Name: Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Öğrenin, kemirgen beyinlerini aynı anda dondurarak ve keserek immunohistokimyasal boyamadaki değişkenliği azaltan bu zaman kazandıran yöntemi. Dokuz hayvanın dokusunu tek seferde işleyerek tutarlı sonuçlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCH misyon destek fonları bu el yazması bildirilen araştırma desteklenen. Yazarlar Daniel Griffiths rakamlar kullanılan fotoğraf çekmek teşekkür etmek istiyorum.

Megabrain tekniği bütün ve hemisected beyin erkek yetişkin C57Bl6 fareler5, juvenil Sprague-Dawley rat ve 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) takip x ile derin transcardially edildi yetişkin Sprague-Dawley rats kullanarak optimize edilmiştir % 4 paraformaldehyde6tarafından. Benzer sonuçlar diğer suşları, fare ve sıçan, her iki cinsiyette ve farklı yaş içinde gerçekleştirilebilir. Bu el yazması için verileri oluşturmak için çalışma Juvenil Sprague-Dawley rat kullanılan ve Arizona Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi ve deneysel hayvanlar için bakım kılavuzu ve laboratuvar kullanım göre için bakım Hayvanlar7.
1. Cryoprotection derin beyin
<ol><li>Aşağıdaki başarılı transcardial perfüzyon6, tam beyin6,8 hayvanlardan toplamak ve 24 h için PBS içinde %4 paraformaldehyde 25 mL şişe içine yerleştirerek sonrası düzeltme. Uyarı: Toksik mendil sabitleştirici Paraformaldehyde olduğunu; özenle hallederim. Paraformaldehyde onun konsantrasyon ve cilt kimyasal duman başlık içinde tanımlayan özel olarak etiketlenmiş bir atık kaba aktarın ve kimyasal güvenlik tarafından veya düzgün bertaraf kadar kabine kimyasal atık deposunda personeli eğitimli.</li>
	<li>Bir duman başlık, 24 saat geçtikten sonra beyin %4 paraformaldehyde bir spatula kullanarak kaldırın. Beyin flakon (yaklaşık 24 h) altına batar kadar beyin yaklaşık 20 mL 1 x Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) % 15 sükroz çözümün bir şişe içine aktarın.</li>
	<li>Beyin flakon (yaklaşık 24-48 h) altına batar kadar bu beyin yaklaşık 20 mL % 30 sükroz çözeltisi 1 x TBS içinde bir şişe aktarın.</li>
</ol>2. beyin donma
<ol><li>500 mL Cam kabı Kuru buzun içinde buz kovası bir yatak üzerinde yerleştirin. İsopentane (2 metil-bütan) 300-400 mL Cam kabı dökün.</li>
	<li>-45 ° C ile -50 ° c arasında ulaşmak için isopentane sıcaklığını izin Yakından izlemek ve bu sıcaklık aralığı yordamı sabit tutarak bir termometre ile korumak. Sıcaklık okuma orta alt veya yan tarafında, kabı değil müessir süre ve çözüm alınır emin olun.</li>
	<li>Benchtop üzerinde kalıp katıştırma tek kullanımlık doldurun (malzeme listesini görmek) en uygun kesme sıcaklık dolu yaklaşık 1/2 (Ekim; Tablo malzemelerigörmek) bileşik. Ekim hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Herhangi bir hava kabarcığı çıkarıp bir spatula veya iğne ile varsa.</li>
	<li>
İlk beyin % 30 sükroz şişe bir spatula ile kaldırın. Bu noktada, ya da beyin bütün veya hemisect çalışma tasarımına bağlı olarak dondurmak.
	<ol>
<li>Hemisected beyin hemisferlerin ayırmak için doku ile temiz bir kesme yapmak için yeni bir jilet kullanın. Çalışma için gerekli değil, beyincik ve olfaktör ampuller Bu aşamada kaldırın. Beyincik çalışma için gerekli değilse, bu düz bir alan beyin ayakta kalıp içine yardım için beynin arka sonunda kesmek için önerilmektedir. Çalışma sadece doku yerelleştirilmiş bir bölgeden gelen gerektiriyorsa, bir kemirgen beyin matris bilinen koordinatlarına göre beyin engellemek için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin sistemi adlandırma bir sayısal ver. Şekil 1' de gösterildiği gibi bir diyagram çizin. Megabrain kalıp pozisyonu 1 olarak hangi beyin donmuştun yönünü hızlı tanımlaması yardım etmek için bir boşluk bırakarak pozisyonu 2, içinde bulundukları ilk beyin numarasını yazın.</li>
	<li>Künt forseps veya cımbız kullanarak, beynini pozisyonu 1 yerleştirilmesi için alın. İlk yukarı bakacak şekilde kesilecek yan beyinle gelecek şekilde yönlendirin. OKT'yi beyne uygun konumda bağımsız olarak standları kadar konumunu ayarlamak için cımbız kullanarak indirin.</li>
	<li>2.3-2.5 kalan beyin/3 – 10 pozisyonda donmuş hemisferlerin için adımları yineleyin. Beyin/hemisfer simetrik bir düzen konumlandırma kaçının.</li>
	<li>Megabrain kalıp tüm 9 beyinlerinde gözden geçirin. Bir kez beyin bağımsız olarak, dik ve düzgün yönlendirilmiş OCT'de ( Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi) ayakta duruyorlar, (üst beyin kaplıdır kadar) daha fazla OCT kalıp için ekleyin. Yine, Ekim hiçbir görünür hava kabarcıkları olduğundan emin olun.</li>
	<li>Forseps forseps kısmen OCT (Şekil 3A) sular altında olmak değil sağlanması kalıp, köşesinde tutmak için kullanın. Kalıp seviyesini korumak için dikkatli olmak isopentane (-50 ° C-45 ° C) içine kalıp alt böylece alt üçüncü kalıp batık. Burada herhangi bir kabarcıklar OCT'de doku (Şekil 3B) uzakta ve yüzeye yükselmeye izin vermek için basılı tutun.</li>
	<li>Sonra 30 s, alt tüm kalıp isopentane ve serbest bırakmak--dan Megabrain bırakarak forseps, içine sular altında en az 3 dakikadır (Şekil 3 c). Bu kalıp, düzeyi, tutulur, böylece beyin dik ve eşit uzaklıkta kalır emin olun (şekil 3D).</li>
	<li>3 dakika sonra beyin (Şekil 3E) isopentane üzerinden kullanımı içeren dondurulmuş, kalıp kaldırmak için forseps OCT gömülü.</li>
	<li>Hemen, kalıp ve içeriğini alüminyum folyo sarma ve hayvan numaraları veya Megabrain kimliği ile etiketleyin. Donmuş Megabrain doku çözdürme önlemek için mümkün olduğunca idareli dokun.</li>
	<li>Bu Megabrain şimdi-20 ° C-dondurucu transfer ve en az 24 saat boyunca saklanır. Not: Burada Protokolü duraklatılmış ve Megabrain-ebilmek var olmak stok cryosectioning gerçekleşir kadar donmuş.</li>
</ol>3. Megabrain Cryostat kesit hazırlanması
<ol><li>Cryostat kabin sıcaklığı-19 ° C'ye ayarla Devam etmeden önce bu sıcaklık ulaşacağından emin olun. Kesit boyunca, kabin sıcaklığı-18 ° C ile -20 ° c arasında kalmasını sağlamak</li>
	<li>Megabrain-20 ° C dondurucudan alıp cryostat yerleştirin. Ayrıca, uygun boyut boyutları ve iki ince uçlu boya fırçaları chuck cryostat yerleştirin. Megabrain ve chuck cryostat cryostat sıcaklığa gelmek en az 15 dakika bırakın.</li>
	<li>Uygun şekilde etiket Megabrain kimlik numarası ve slayt numarası ile slaytlar. Bu slaytları bir slayt üzerinde daha sıcak (35-45 ° C) yatıyordu.</li>
	<li>Megabrain alüminyum folyo dan paketini açmak. Dikey olarak kalıp kalıp (Şekil 4A), Ekim bloğunun kolayca kaldırılmasına olanak köşeleri kesmek için jilet kullanın.</li>
	<li>İnce bir tabaka (yaklaşık 3 mm kalınlığında), Ekim chuck dağıtmak.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde, parmak ve OKT arasında en az kişiyle, chuck, istenilen yönde Megabrain yerleştirin. Büyük forseps çözdürme en aza indirmek için bu adım için de kullanılabilir. Bölüm, Megabrain bırakın başlamadan önce chuck cryostat OCT tamamen dondurmak izin vermek 15-20 dakika içinde monte edilebilir.</li>
	<li>Bir kez temel katmanın, Ekim dondurdu, OCT Megabrain kenarlarına etrafında 2 mm kalın bir tabaka uygulayın ve bu chuck üzerine taraftan yakalamak izin. Bu Chuck Megabrain sağlanmasına yardımcı olur. Yine, devam etmeden önce monte Megabrain chuck cryostat OCT dondurmak izin vermek 15-20 dk içinde bırakın.</li>
	<li>Bir tıraş bıçağı taraf veya alt Chuck (Şekil 4B) herhangi bir aşırı OCT kaldırmak için kullanın.</li>
</ol>4. Cryosectioning Megabrain
<ol><li>Başlamadan önce en az 20 mL 1 x PBS içeren bir ölçek erişilebilir olduğundan emin olun.</li>
	<li>Chuck, Megabrain ile cryostat (Şekil 4B) chuck kafasına içine monte getirin.</li>
	<li>Cryostat istediğiniz kalınlıkta kesmek için ayarlayın. Geçerli metodoloji 50 µm bölümlerine 10 µm için optimize edilmiştir.</li>
	<li>Trim OKT ve doku koleksiyonu (Şekil 4 c) için istenen beyin bölgesi ulaşmak için gerektiği gibi doku.</li>
	<li>Doku toplamak, sahne alanı'nda aittir dek anti-roll plaka indirin ve tek bir bölüm almak için cryostat ne zaman hazır. Yavaş yavaş kesitli Megabrain anti-roll plakasına bağlı olmayan ve sahneden Şekil 4 ddüşmek değil dikkatli olmak anti-roll plaka kapalı kaldırın).</li>
	<li>Yavaşça boya fırçaları düz cryostat sahne alanı'nda (Şekil 5A) yalan kadar Megabrain bölümüne göz önüne sermek için kullanın. (Gerekirse, OCT haddeleme önlemek için boya fırçaları kullanarak düz tutun).</li>
	<li>Daha sıcak slayttan slayt kaldırmak ve slayt etiket tarafı aşağı, Megabrain bölüm bölüm slayda sopa izin sahnede üzerinde gezdirin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde slayttaki her doku Bölüm 1 x PBS bir damla uygulamak ve bunlar onlar düz fırça kadar kurumasına izin verme (bkz. Adım 4,9).</li>
	<li>Herhangi bir doku kabarcıkları dışarı fırça ve düz slayt üzerinde (5B rakam) yalan söylüyor bu yüzden doku açılmak için 1 x PBS daldırma ince uçlu fırça kullanın. Değil beyin bölümleri konumunu değiştirmek ve böylece diğer doku bölümlerine göreli konum kaybetmek için dikkat ediniz. Gözyaşları önlemek için itina ile doku işlemek. Periferik alan bir coverslip ve boyama bazı protokoller PAP kalem uygulama için gerekli olarak beyin bölümlerini slayt, kenarları uzak tutun.</li>
	<li>Slayda geri slayt daha sıcak ve kuru 45 dk. doku üzerinde yerleşme toz önlemek için gerektiğinde kapak koyun. Kuru bir kez, içinde slaytları-80 ° c kadar kullanmaya devam etmenize depolama.</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome%2C+post-traumatic+sleep%2C+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Megabrain ve çevresi sıcaklığı sürekli çözdürme ve doku yeniden donma önlemek için takip gerekir Bu yordam sırasında düşünülmelidir. Beyin sadece-20 ° C dondurucudan için 3 kez olarak bu değindi 's ve daha sıcak bir dalgalanan sıcaklık, doku cryostat sol Tammy'nin ve refreezes, bir jöle gibi doku ve anormal doku bütünlüğü10neden her zaman kaldırılabilir. Bu nedenle, Megabrain tek seferde kesmek için en iyi yöntemdir.
Doku fiksasyon ve cryoprotection buz kristal oluşumu ...

Burada, iletişim kuralı için birden çok kemirgen aynı anda aşağı akım immunohistokimyasal yordamlar için beyin cryosection için geliştirilen Megabrain dediğimiz bir roman yöntemi mevcut. Tek slaytları içeren birden fazla hayvan dokudan üretimi için bir Megabrain sağlar. Bu teknik, aynı anda 9 yetişkin fare hemisferlerin veya 5 Yetişkin tam beyin, koronal bölümleri kesmek için en iyi duruma getirilmiş. Bu nedenle, en büyük immunohistokimyasal çalışmalar veya slayt monte beyin dokusu üzerinde hayvan büyük bir kohort yapılan diğer analizler uygulanabilir bir tekniktir.
İmmünhistokimya belirli antikor protein anlamak ve kendi ifade ve hücresel değişiklikler belirli doku1,2,3' te karakterize ilgi karşı kullanımını gerektirir. İmmünhistokimya kullanımı nörolojik araştırma, beyin4hücresel ve moleküler anlamada yardım diğer bilimsel disiplinler arasında yaygındır. Büyük ölçekli çalışmalar birçok hayvan ve beyin bölümleri içeren kaynak ve zaman yoğun olabilir. Bu nedenle, Megabrain gelişimi çok yönlü bir mantığı var: süresini azaltmak için montaj ve sonuç olarak daha az reaktifler kullanırken doku, boyama cryosectioning geçirdim. Ayrıca, yeteneği süreci hızlandırmaya ve aynı birden çok beyin leke yuvarlak bazı parçalar, bir sınırlama immünhistokimya3boyama arasında değişkenlik hafifletmeye yardımcı olur. Buna ek olarak, bir Megabrain kesit bireysel donmuş kemirgen beyin kesit için alternatif bir zaman tasarrufu ve doku hayvanlar veya bile tedavi grupları arasında hızlı karşılaştırma mikroskobu teknikleri tarafından sağlar.

<table><tbody><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT bileşiği (12 vakası)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Tek Kullanımlık Gömme Kalıpları</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Yüksek Hassasiyetli Düz Geniş Güçlü Nokta Cımbız/Forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 20 mL HDPE Sintilasyon Şişeleri ile Polipropilen Kapak</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz, poli şişe 2,5 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2-212</td><td>Hem %15 hem de %30 sükroz konsantrasyonlarının oluşturulması gerekir.</td></tr><tr><td>2-Metilbütan (Sertifikalı), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Uzun Formlu Beherler</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Genel Amaçlı Cam İçi Sıvı Kısmi Daldırma Termometreleri (-50 ila +50 &°; C)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Scoopula Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY Tıraş Bıçağı Grainger</td><td></td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Edge-Rite Mikrotom bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları (1" don) - beyaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; PBS (Fosfat Tamponlu Salin) 10x, pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>Kullanmadan önce 1X&nbsp'ye seyreltin</td></tr><tr><td>15 parça ince boya fırçaları</td><td>Amazon</td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Chuck Şekil 4'te gösterilen bir laboratuvar teknisyeni tarafından özel olarak yapılmıştır, ancak benzer boyutlar ticari olarak diğer şirketlerden sipariş edilebilir.</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

birden çok kemirgen beyin aynı anda cryosectioning

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histoloji ve immünhistokimya mikroskopik anatomi görselleştirmek ve proteinlerin biyolojik doku içinde yerelleştirmek için analiz rutin yöntemleri vardır. Neuroscience, yanı sıra diğer bilimsel alanları bir bolluk, bu teknikleri kullanılır. İmmünhistokimya slayt monte doku veya serbest yüzer bölümleri üzerinde yapılabilir. Slayt monte numune hazırlama bir zaman yoğun bir süreçtir. Aşağıdaki protokol için Megabrain adında bir teknik cryosection ve mount beyin dokusu tek bir donmuş blok birden çok beyin birleştirerek 90 %'e kadar geçen süre azalır. Ayrıca, bu teknik turda büyük bir histochemical çalışma boyama arasında görülen değişkenliği azaltmak. Geçerli teknik kemirgen beyin dokusu içinde aşağı akım immunohistokimyasal analizleri kullanarak için optimize edilmiş; Ancak, cryosectioning kullanan farklı bilimsel alanlar için uygulanabilir.

Bu yordam için olumlu bir sonuç hiçbir kabarcıklar veya gözyaşları içinde donmuş yönde düz slaytta yatıyor dokudur. Doku bölümler nedeniyle beyin OCT'de ve iyi gösterim olarak Şekil 1' deki gösterdiği iyi yerleşimini ayrı ve kolayca tanımlanabilir eşit aralıklandırılmış. Beyin dokusuna benzer yaş hayvanlardan toplanan ve doku düzgün Ekim uyumlu varsayılarak, bir slayt üzerinde toplanan bölümleri beyin bölgeleri hayvanlar arasında karşılaştırılması izin benzer...

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Bu zaman kazandıran yöntem, anatomi ve yerel protein ve dokunun görselleştirilmesini optimize etmek için nörolojik çalışmalarda immünohistokimyasal prosedürlerin turları arasındaki değişkenliği azaltır. Bu tekniğin en büyük avantajı, birden fazla beyni tek bir donmuş blokta birleştirerek kriyoksiyon ve beyne monte etmek için geçen süreyi azaltmasidır. Bu teknik kemirgen beyinlerinin koronal bölümleri için optimize edilmiş olsa da, sagittal veya enine kesitlere veya kas veya karaciğer gibi dokuların farklı türlerine adapte edilebilir.Başarılı transkardiyal perfüzyonu takiben, PBS'de 25 mililitrelik paraformaldehit şişedeki hayvanların beyinlerini 24 saat boyunca düzeltin. Bundan sonra, paraformaldehit beyin kaldırmak için künt uçlu forseps kullanın. Beyinleri TBS'de yaklaşık 20 mililitre %30 sakaroz çözeltisi içeren bir şişeye aktarın.Onlar şişenin altına batana kadar beyin ve çözüm tutun. Sonra, bir buz kovası kuru buz bir yatak üzerine 500 mililitrelik cam kabı yerleştirin. Sonra kabın içine 300 ila 400 mililitre isopentane dökün.Negatif 45 ve negatif 50 santigrat derece arasında isopentane koruyun. Tezgahın üst kısmında, tek kullanımlık gömme kalıbını optimal kesme sıcaklığı veya OCT bileşiğiyle yaklaşık yarım tam doldurun. Kalıp herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir iğne kullanın.Sakaroz çözeltisi ilk beyin kaldırmak için künt uçlu forseps kullanın. Sonra hemisfer ayırmadan önce beyincik ve koku ampulleri kaldırmak için yeni bir jilet kullanın. Sonra, beyinsayısal bir adlandırma sistemi verin.Künt forceps kullanın, pozisyon iki yerleştirilecek beyin almak, ve yan ilk yukarı bakacak şekilde kesilecek ile yönlendirmek. OCT içine beyin indirin ve bağımsız durana kadar konumunu ayarlamak için cımbız kullanın. Bu tekniğin önemli bir değişiklik pozisyon bir boş alandır.Bu alan megabeyin yönünün kolayca tanımlanmasını sağlamak ve bu nedenle her beyinle ilişkili hayvanı tanımlamak için belirlenmiştir. Tüm beyinler kalıp konumlandırılmış sonra, beynin üstleri kapsayacak yeterli OCT eklemek, sonra herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir iğne kullanın. Perçelerin OKT'de kısmen batırılmasını sağlamasını sağlayan persepslerle kalıbın köşesini tutun.Daha sonra, kalıp içine kalıp indirin böylece kalıp alt üçte sular altında. 30 saniye sonra, isopentane içine tüm kalıp indirin ve forceps bırakın. Üç dakika sonra, isopentane kalıp kaldırmak için forceps kullanın.Hemen alüminyum folyo kalıp ve içeriğini sarın ve uygun etiket. Megabeyni en az 24 saat boyunca negatif 20 derecelik bir dondurucuya aktarın. İlk olarak, kriyostat kabinenin sıcaklığını negatif 19 dereceye ayarlayın.Dondurucudan megabeyni çıkarın ve kriyostat yerleştirin. Sonra kriyostat bir chuck ve iki ince uçlu boya fırçaları yerleştirin. Bundan sonra, slaytları megabeyin kimlik numarası ve slayt numarasıyla etiketlendirin ve slaytları kaydırak ısıtıcıya yerlebir edin.Sonra, megabeyin açın ve kalıp köşeleri kesmek için bir jilet kullanın. Chuck üzerine OCT ince bir tabaka dağıtın. Sonra hızlı bir şekilde chuck üzerinde megabrain yerleştirin.OCT tamamen donduktan sonra, megabeynin kenarlarına IKI milimetrelik bir EKIM katmanı uygulayın ve aynanın üzerine yanlardan aşağı doğru çalışmasına izin verin. Chuck'ın kenarlarından ve altından fazla OCT'yi kaldırmak için bir jilet kullanın. İlk olarak, chuck kriyostat chuck başında megabrain ile monte pozisyon.Sonra istenilen kalınlıkta kriyostat ayarlayın. Doku toplama için istenilen beyin bölgesine ulaşmak için gerekli OCT ve doku kırpın. Daha sonra sahneye dayanacak kadar anti-roll plakasını indirin ve tek bir kesit almak için kriyostat sapını çevirin.Yavaşça anti-roll plaka kaldırın, doku bölümüne dokunulmaz dikkatli olmak. Düz yatana kadar doku bölümünü çıkarmak için boya fırçalarını hafifçe kullanın. Gerekirse, yuvarlanmayı önlemek için paintbrushes kullanarak OCT düz tutun.Daha sonra slayt ıstırağını kaydırıcıdan çıkarın ve slayt etiketi tarafını megabeyin bölümünün üzerine doğru kaydırın ve slayta yapışmasını bekleyin. Hızlı bir şekilde doku bölümüne PBS bir damla uygulayın. PBS'ye batırılmış ince uçlu bir fırça kullanarak, doku bölümündeki kabarcıkları fırçalayın ve slaytta düz yatmak için dokuyu aç.Son olarak, slaytı 45 dakika kuruması için kaydırak ısıtıcısına yerleştirin ve slayı negatif 80 santigrat derecede saklayın. Bu protokolde dokuz hayvanın beyin dokusu aynı anda hazırlandı ve kriyodize edildi. Kriyoding inardından sonra, Kriyokoruma kalitesini değerlendirmek için H&E boyama yapılabilir.Mikroglianın iyonize kalsiyum bağlayıcı molekülü bir veya Iba1 boyamasının temsili sonuçları, tek bir megabeyinüzerinde her çalışma beyni arasında tutarlı bir boyama olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken, çatlak veya erime önlemek için megabeyin donma ve daha sonra anormal doku bütünlüğüne yol açan doku yeniden donma sırasında sürekli sıcaklığı izlemek için hatırlamak önemlidir. Boyama sırasında gruplar arasında farklılık yaratabileceği ve görüntüleme ve analiz sırasında önyargı ve öznelliği azaltabileceği için farklı tedavi gruplarını ayrı ayrı megabeyinlerde ayırmak tavsiye edilmez.Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve PBE giymek ve başlıkta çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

simultaneous-cryosectioning-of-multiple-rodent-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Biz medial entorinal korteks (MEC) dorsal-ventral eksen korumak beyin dilimleri ile hazırlanması ve elektrofizyolojik kayıt için prosedürler açıklanmaktadır. Konumu nöral kodlama MEC içinde dorsal-ventral organizasyonu aşağıdaki Çünkü, bu işlemler navigasyon ve bellek için önemli hücresel mekanizmaların incelenmesi kolaylaştırmak.

Kemirgen Medial entorinal Korteksin dorsal-ventral Örgütü Soruşturma parasagital Dilimleri hazırlanması

Bu videoda, aşağı akış analizleri için donmuş fare beyin dokusu kesitlerinin hazırlanmasına yönelik ayrıntılı bir adım adım protokol gösterilmektedir.

Aşağı akış analizi için bir fare beyninin işlenmesi

Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

Mevcut protokol, entegre bir doku koruma sistemi ile minimal invaziv bir yaklaşımla kemirgenlerde beyin tümörlerinin standartlaştırılmış bir rezeksiyonunu tanımlamaktadır. Bu tekniğin, kemirgen ve diğer hayvan modellerindeki bakım standardını doğru bir şekilde yansıtmak için etkileri vardır.

Yüksek Canlılık Doku Toplanması için Kemirgenlerde Minimal İnvaziv Beyin Tümörü Rezeksiyonunun Uygulanması

Mevcut protokol, boyalar ve donmuş kesitler kullanarak viral izleme yapmadan önce stereotaksik enjeksiyon koordinatlarının doğrulama adımını hızlandırmak için pratik bir stratejiyi açıklamaktadır.

Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması

Modern sinirbilimler, laboratuvar kemirgenleri ve insanlar dahil olmak üzere birçok tür arasındaki farkları keşfetmelidir. Ancak büyük beyinli memeliler söz konusu olduğunda teknik zorluklar ortaya çıkar. Bu yaklaşım, çok farklı memelilerde nöronal popülasyonların türler arası varyasyonlarını ele alır ve evrimsel kalıpların ortaya çıkarılması için haritalanacak benzer sonuçlar sunar.

Farklı Memeli Beyinlerinde Nicel Hücre Sayımı Çalışmaları İçin Karşılaştırmalı Yaklaşım

Öğrenin, kemirgen beyinlerini aynı anda dondurarak ve keserek immunohistokimyasal boyamadaki değişkenliği azaltan bu zaman kazandıran yöntemi. Dokuz hayvanın dokusunu tek seferde işleyerek tutarlı sonuçlar elde edin.

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Daha fazla video keşfet