Histochemical boyama ve nişasta yumurtalık Primordia tatlı kiraz kış uyuşukluk sırasında ölçmek için görüntü analizi

Bu yöntem, neden çiçek tomurcukları düzgün çiçek kış aylarında soğuk birikmesi gerekir gibi odunsu bitki, uykudalık hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, çiçek primordium çok küçük örneklerinişasta nicelik sağlar. Bu yaklaşım, uyku sırasında çiçek primordium fizyolojik aktivitesini tespit etmek için çok yararlıdır ve aynı zamanda kayısı veya erik gibi diğer ağaç türlerine uygulanabilir.

Bu yöntem, atıl çiçek tomurcuk içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda meyve başlangıcı tozlaşma üreme aşaması gibi diğer süreçleriçin uygulanabilir. Başlamak için, alanından beş sürgünler toplamak. Sonra tartmak ve dört santigrat derece en az 24 saat fiksatif çözelti ile 10 mililitrelik cam tüp 10 çiçek tomurcukları düzeltmek.

Bundan sonra, fiksatif atın ve örnekleri kapsayacak kadar% 75 etanol ekleyin. Her biri 10 çiçek tomurcukları ile uzunluğu 15 ila 30 santimetre ve çapı beş milimetre olan üç sürgünler elde edin. Daha sonra sürgünleri suyla ıslatılmış çiçekçi köpüğünün üzerine bir büyüme odasına yerleştirin.

Büyüme odasında 10 gün sonra, sürgünler çiçek tomurcukları çıkarın ve onları tartmak. Sonbaharın başlangıcından ilkbaharda tomurcuk patlamasına kadar her hafta, çiçek tomurcuklarının büyümesini değerlendirin. Her numuneden dış tomurcuk ölçeklerini çıkarın ve her bir tomurcukları %75 etanol içeren bir saat makinesinin bardağına yerleştirin.

Tomurcukları incelemek ve her tomurcuktan en az bir çiçek primordium elde etmek için hassas forceps ve oftalmolojik neşter kullanın. Örnekleri parafin balmumuna tek tek gömerek bir blok oluşturup döner bir mikrotome bölün. Örnekleri kesitle dikten sonra, bir bölüm üzerine taze Lugol iyot damlası uygulayın.

Beş dakika sonra, leke kağıdı ile fazla leke kaldırın. Daha sonra küçük bir damla sentetik montaj ortamı uygulayın, numunenin üzerine küçük bir kapak camı yerleştirin ve sertçe bastırın. Montaj ortamı kuruduktan sonra, parlak alan mikroskobu altında lekeli bölümü gözlemleyin.

Önce diyafram diyaframını ve parlaklık kontrolünü metin protokolüne göre ayarlayın. Ardından filtre tutucuda filtre olmadığından emin olun ve mikroskopta bir parlaklık alanı koşulu seçin. Bundan sonra, doku olmadan lekeli hazırlık için kamera ayarlarını ayarlayın.

Parlaklığı %50'de düzeltin Sonraki aşırı pozlama/pozlama fonksiyonunu etkinleştirin ve pozlama süresini aşırı pozlama sınırında ayarlayın. Beyaz dengesi işlevini ve gölgeleme düzeltmesini uygulayın. Doku olmadan lekeli hazırlık ortaya çıkan siyah-beyaz görüntü gri düzeyini ölçün.

Ardından 4N filtre uygulayın, hazırlıktan başka bir siyah-beyaz görüntü alın ve gri seviyeyi ölçün. Sonraki ışık olmadan aynı hazırlık bir görüntü elde ve ortaya çıkan görüntü ve kalibre gri düzeyini ölçmek. Bundan sonra, en az 300 dpi çözünürlüğe sahip TIFF formatında bir örnek bölümün renkli görüntüsünü elde edin.

Lekeli alana karşılık gelen bir ikili görüntü oluşturun ve ardından ikili görüntü lekeli nişasta granüllerini tam olarak yansıtana kadar üç renk eşiğini ayarlayın. Son algılama seviyelerinde ince ayar yapmak için bu işlemi diğer preparatlar ve dokularla tekrarlayın. Görüntü analiz sistemini kullanarak, alandaki nişasta içeriğini ölçmek için maskenin altındaki her pikselin optik yoğunluğunun toplamını ölçün.

Bu protokolde, uygun koşullarda 10 gün sonra tomurcuk ağırlığındaki artış ölçülerek çiçek tomurcuk büyüme ve hareketsizlik durumu değerlendirildi. Uyku sırasında uygun koşullarda 10 gün sonra herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Bir kez uykuda üstesinden geldi, tomurcukları şişti ve büyüme odasında patladı.

Yumurtalık primordiyumundaki nişasta içeriği her mikrotomitli bölümde görüntü analizi ile ölçüldü. Sürekli olarak, kış başında nişasta miktarı 40,000'den daha az optik yoğunluk değeri sunmuştur ve maksimum miktar çalışmanın her iki yılında da 120, 000 ve 140,000 arasında bir değere ulaşmıştır. Uykuda lığı göz önünde bulundurarak, her iki yıl boyunca soğutucu yerine getirilmesi ile birlikte nişasta maksimum miktarda meydana geldi.

Görüntü analizörü tarafından kullanılan algılama düzeylerinin doğrudan sistemin kalibrasyonuna bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Bu ışık durumu, leke yoğunluğu ve mikroskop büyütme içerir. Bu durum tüm hazırlıklar için düzeltilmelidir.

Histokimyasal tekniklerin görüntü analizi ile birleşimi, hareketsizliğin farklı evrelerinde çiçek primordiumunun karbonhidrat rezervinin incelenmesinde çok yararlı olmuştur. Diğer tür ve dokulara da uygulanabilir. Bu yöntemin kullanımı ile açıklanan yumurtalık primordia uykuda salınım ı ve nişasta birikimi arasındaki ilişki, hareketsizlik ve soğutma gereksinimleri biyolojik temelini anlamak için sağlam bir temel sağlar.

Gelecekteki çabalar, ağacın hareketsizlik durumunu kolayca gösterebilecek güvenilir biyolojik göstergeleri incelemeye odaklanmalıdır. Bu arada, uykuda boyunca nişasta varyasyonları desen daha fazla fizyolojik ve genetik çalışmalar çerçeve için kullanılabilir.