Name: Histochemical boyama ve nişasta yumurtalık Primordia tatlı kiraz kış uyuşukluk sırasında ölçmek için görüntü analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Öğrenin tatlı kiraz (Prunus avium L.) çiçek tomurcuklarında nişasta miktarını histokimyasal boyama ve görüntü analizi ile kış uyuşukluğu sırasında nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, odunsu bitkilerde fizyolojik aktiviteyi değerlendirmek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle Maria Herrero ve Eliseo Rivas onların yararlı tartışma ve tavsiye için teşekkürler. Bu eser "gayri resmi" de Economía y Competitividad tarafından desteklenen — Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu, Avrupa Birliği [grant numarası BES-2010-037992 E. f.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [grant numaraları RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; ve Gobierno de Aragón — Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği [Grupo Consolidado A12-17R].

1. uyuşukluk belirlenmesi ve bitki malzeme toplama
<ol><li>Çiçek tomurcukları alanında örnek. Uyuşukluk çalışmalar uzun süreli deneyler ve yetişkin tomurcukları toplamak için yeterince büyük ağaçlar ve ağaçlar geliştirme önümüzdeki bahar aylarında ödün vermeden bütün kış vuruyor gerektirir. Özel meyve bahçesi yönetimi eğitim sistemine bağlı olarak gerekli olabilir; Böylece, budama meyve üretim amaçları için daha az şiddetli olabilir.<ol>
<li>Her hafta, bud sonu, başlangıcı kadar Sonbahar başlangıcı toplamak ve 10 çiçek tomurcukları ağırlık.</li>
		<li>Bir kap ile 10 mL cam tüp içine yerleştirerek çiçek tomurcukları gidermek ve etanol/Asetik asit (3:1) için en az 24 Saat 4 ° C'de bir sabitleştirici çözümde örnekleri emmek Sonra sabitleştirici atmak ve % 75 etanol, cömertçe örnekleri gelebilmektedir sağlanması ekleyin. Örnekleri 4 ° C'de Bu çözümde kullanmak kadar korunmuş. Not: Vakum infiltrasyon tomurcuk içinde hava kabarcıkları kaldırmak ve onları yüzen gelen engellemek için kullanılabilir. Bu sabitleştirici penetrasyon dokuları içine kolaylaştırır ancak yapısı dokuları zarar verebilir. Eğer gerekli değil önlemek için deneyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sürgünler alanında örnek.<ol>
<li>Her hafta, 15-30 cm uzunluğunda ve 5 mm çapında, en az 10 çiçek tomurcukları içeren üç sürgünler bud sonu, başlangıcı kadar Sonbahar başlangıcı almak. Onları suya batırılmış çiçekçi köpük 22 ± 1 ° C 12 h hafif photoperiod da adlı bir büyüme odasında yerleştirin.</li>
		<li>10 gün içinde büyüme odası sonra al ve 10 çiçek tomurcukları sürgün tartın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bud büyüme değerlendirmek ve uyuşukluk durumunu belirlemek. Konumu koşulları için ayarlanacak örnekleme süresi vardır. Orchard koşullarında (Zaragoza, İspanya, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W ve deniz seviyesinden 220 m), sürgünlerin örnekleme 30 Kasım Şubat sonu ya da Mart başında kadar üzerinden gerçekleştirilmiştir.<ol>
<li>Haftalık çiçek tomurcukları yanıt odası, uygun büyüme koşullarına kadar budburst Bahar, sonbahar başlangıcından itibaren alanından aldım 10 tomurcukları ağırlık karşılaştırarak değerlendirin.</li>
		<li>Hiçbir farkı yoktur veya daha az % 30 bu farklılıklar vardır, tomurcuklar tüyler ürpertici gereksinimlerini yerine değil ve endodormant22vardır düşünün. Farklılıklar daha--dan %30, tomurcuklar tüyler ürpertici gereksinimlerini yerine getirdim ve ecodormant22düşünün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bitki nişasta miktar malzeme hazırlığı
<ol><li>Her örnekleme gelen Select altı sabit tomurcukları (bkz. Adım 1.1) Tarih. Çeşitlerin bağlı olarak, her tatlı kiraz çiçek tomurcuk beş çiçek primordia içerir.<ol>
<li>Dış bud ölçekler çıkarın ve tomurcuk kurumasını önlemek için % 75 etanol ile saatçi'nın camına yerleştirin.</li>
		<li>Tomurcuk teşrih ve hassas forseps yardımıyla ve stereoskopik mikroskop altında Oftalmolojik bir neşter ile bud başına en az bir çiçek primordium ayıklayın. Çiçek primordium bir 10 mL cam tüp 4 ° C'de % 75 etanol ile korunmuş veya hemen sonraki adıma geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tersiyer Bütil alkol serisi örneklerinde kurutmak.<ol>
<li>% 75 etanol çözüm 10 mL % 75 Tersiyer Bütil alkol (TBA) 1,5 saat için kuluçkaya ve cömertçe örnekleri kapağı değiştirin. Pasteur pipet çözüm atmak yararlı olabilir.</li>
		<li>Saf TBA oda sıcaklığında (< 20 ° C) crystalizes ve çok uçucu ve toksik beri yükselen konsantrasyonlarda (% 85, % 95 ve % 100, v/v; ve saf TBA ile 3 x) ile TBA ekleme 2.2.1, 30 ° c ile hava emme, kurutma fırın içinde adımları yineleyin. TBA ile örnek crystalizes durumunda dokulara zarar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parafin18' örnekleri katıştır.<ol>
<li>Parafin ile hava ayıklama önceki gün 60 ° C'de kurutma fırın içinde parafin inci tanıtarak eritebilir. Parafin inci de bir ocağın üzerinde erimiş olabilir, ama Sıvı parafin 60 ° C'de ve doku hasarı önlemek için daha yüksek bir sıcaklık, olduğundan emin olun.</li>
		<li>TBA TBA ve parafin yağı (1:1) karışımı ile değiştirin ve 60 ° C'de kurutma fırın içinde 24 h için kuluçkaya O zaman, TBA karışımı eski yerine koymak ve parafin yağı ile saf parafin eritin ve 60 ° C'de kurutma fırın içinde en az 6 h için kuluçkaya Tekrar 2 x ve en az 4-6 d için son değişikliği kuluçkaya.</li>
		<li>Her örnek üzerinde küçük bir metal temel kalıp ısı yüzey üzerinde yerleştirin parafin ve gömme kaset hızı gömülü. Soğuk bir yüzeye yerleştirin ve balmumu katılaşmış bir kez blok çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bölüm ve hazırlıklar rehydrate.<ol>
<li>Haupt'ın yapıştırıcı hazırlamak: düz Knox jelatin 30 ° C'de; distile su 100 ml 1 g dağıtılması sonra 2 g fenol gevşek kristaller (C6H5OH) ve 15 mL gliserol ekleyin. Bir fırça ile bir cam slayt Haupt'ın yapıştırıcı yayılmış ve % 1 formaldehit çözüm bir damla ekleyin.</li>
		<li>Her parafin 10 µm çevirme microtome, blok ve cam slayt üzerine bölümleri yer bölümü Haupt'ın yapıştırıcı ile kaplı.</li>
		<li>Cam slaytlar bölümleri ile 35-40 ° c ısı yüzey kuru kadar yerleştirin; sonra cam slaytları bir slayt raf taşıyın.</li>
		<li>Dewax ve rehydration çözümleri hazırlayın. Histoclear II 200 mL yer üç yemekleri Cam Boyama, başka bir Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) ile bir etanol serisi (% 100, % 70, % 40, v/v) ve son bir distile su yıkama.</li>
		<li>Üç yıkar, her 5 dk, Histoclear II ve Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) bölümlerle dewax. Cam Boyama yemekleri çözüm tamamen slaytları kapsar sağlanması içinde slayt raf yerleştirin ve sonra slayt raf bir çözümden geçmek.</li>
		<li>Bölüm 2-min yıkar aşağıdaki bir dizi tarafından rehydrate: bir etanol serisi (% 100, % 70, % 40, v/v) ve son distile su yıkama. Son olarak, oda sıcaklığında cam slaytlar kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bölüm18leke.<ol>
<li>Hazırlamak2KI leke: 2 g potasyum iyodür (KI) ve iyot 0.2 g dağıtılması (Ben2) 100 ml distile su. Bir damla taze uygulama ben2KI 5 min için bölümler üzerinde ve sonra leke fazlalığı ile Bloting kağıt emerek atın. Hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin.</li>
		<li>Küçük bir damla bir sentetik montaj ortamının uygulama, küçük bir cam üzerine yerleştirin ve sert bastır. Montaj medya kurur sonra yumurtalık nişasta bir ön değerlendirme için alan parlak mikroskopla gözlemlemek. Not: nişasta ile arka plan arasında daha iyi bir kontrast elde edilir, ancak bu adım zorunlu değildir. Bölümün diğer lekeleri ile nişasta miktar sonra yeniden kullanılabilir varsa, cam damla leke olarak yerleştirin ve Bloting kağıt ile emerek aşırı atmak (2.5.1 bakınız). Sonra nişasta miktar sonra yıkayın2KI benim leke distile su ve hazırlıklar bir ateşte 35-40 ° C kadar kuru yüzey yer ile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. miktar nişasta içeriği
<ol><li>Optik koşullar kalibre. Not: Image analyzer tarafından lekeli nişasta algılamak için kullanılan algılama düzeyleri ışık koşulları ve mikroskop büyütme üzerinde doğrudan bağlı olan; Böylece, bu koşullar için tüm hazırlıklar değerlendirildi düzeltmek. Burada mevcut mikroskop ve ışık koşulları için önerilen ayar uyum.<ol>
<li>Diyafram diyafram 20 X büyütme ve Parlaklık kontrolü veya ışık yoğunluğunu ayarlayın.</li>
		<li>Filtre tutucu filtre olduğundan emin olun ve mikroskobu parlak alan koşulunu seçin. (Örneğin, 40 X tatlı kiraz yumurtalık primordium için) uygun bir büyütme düzeyini seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntü edinme koşulları kontrol. Kamera ayarlarını doku ile görüntü olmadan lekeli bir hazırlık | Edinme | Ön görünüm.<ol>
<li>Parlaklığı % 50, kazanç 1.0'de düzeltmek x ve gamma değeri 1.00 ve kontrast at 0 - çubuk grafik göstergeleri 100, parlaklık dağıtım histogram sınırları ile sıraya.</li>
		<li>Dozun/pozlama iþlevini etkinleþtirmek ve overexposure limitte çekim hızı ayarlayın.</li>
		<li>Beyaz dengesi fonksiyonu tam görüntü düzeltilmiş ve homojen bir görüntü oluşturmak için herhangi bir renk tonu ve gölgelendirme düzeltme olmadan görüntünün tüm nötr renkli bileşenleri görüntülemek için tam görüntü uygulanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geçirgenliği (T) değerleri tarafından elde edilen farklı optik yoğunlukları (OD) gri düzeyi (0, siyah; 255, beyaz) denetim değerlerini elde etmek için görüntü analiz sistemi kalibre.<ol>
<li>Denetim beyaz kabul olmadan doku, lekeli bir hazırlık görüntüsünü elde etmek ve siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyini ölçmek | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri = 0 | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu % 100 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, bir optik yoğunluğu 0, OD göre = 2 - T. oturum</li>
		<li>4 ışık miktarını azaltan bir 4N filtresiyle aynı hazırlık görüntüsünü elde x ve ölçü siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyi | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri 0.6 = | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu bir % 25 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, optik bir yoğunluğu 0,6, OD göre = 2 - T. oturum</li>
		<li>Işık, kabul siyah olmadan aynı hazırlık görüntüsünü elde etmek ve siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyini ölçmek | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri = 1 | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu bir % 0 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, optik bir 1, OD göre yoğunluğu = 2 - T. oturum</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nişasta algılamak.<ol>
<li>TIFF formatında en az 300 nokta / inç (dpi) çözünürlüğe sahip ölçmek için alan bir renk görüntüsünü elde etmek.</li>
		<li>Lekeli alan karşılık gelen ikili bir resim oluşturun. Üç renk eşikleri ayarlamak (değerleri arasında 0 - 255 her biri için) ikili görüntü tam olarak gözlenen üzerinden görüntü lekeli nişasta granülleri yansıtır kadar | Tespit | Kırmızı, mavi ve yeşil eşikleri seçin | Tamam. Çeşitli hazırlıkları ve doku son algılama düzeyleri ayarlamak için tekrar tekrar görsel karşılaştırma yapmak. Depolayın ve bu düzeyleri için tüm hazırlıklar kullanın.</li>
		<li>Nişasta ölçmek. Orijinal renk görüntü görüntü analiz sistemi ile siyah beyaz bir görüntü dönüştürmek. İkili resim siyah beyaz görüntü ile görüntü üzerinde üst üste bir maske olarak kullanmak | İkili düzen. Optik yoğunluk maske ile ölçü birimi altında her pikselin toplamı ölçmek | Gri düzeyi | Tamam ve ölçülen alanın nişasta içerik olarak bu değeri göz önünde bulundurun.</li>
		<li>3.4.1 - 3.4.3 dört yerleri yumurtalık primordia çiçek primordia yumurtalık nişasta içeriğinde temsil eden bir değer elde etmek için yineleyin.</li>
		<li>Tekrarlamak merdiven 3.4.1 - 3.4.3 ve 3.4.5 her toplama tarihi farklı çiçekler içinde adım.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+seasonal+flowering+in+the+Rosaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).</li>
<li>Rohde, A., Bhalerao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+dormancy+in+the+perennial+context%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant dormancy in the perennial context.</a> Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847217302794">Unveiling winter dormancy through empirical experiments.</a> Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00468-018-1735-7">Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.).</a> Trees - Structure and Function. , In Press (2018).</li>
<li>Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormant+flower+buds+actively+accumulate+starch+over+winter+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).</li>
<li>Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/25/3/274.full.pdf">Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots.</a> HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).</li>
<li>Hedhly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+turnover+and+metabolism+during+flower+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development.</a> Plant Physiology. , (2016).</li>
<li>Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1034/j.1399-3054.2000.108001035.x">Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca).</a> Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).</li>
<li>Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamen+development+and+winter+dormancy+in+apricot+%28Prunus+armeniaca%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca).</a> Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pistil+starch+reserves+at+anthesis+correlate+with+final+flower+fate+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana).</a> PLoS One. 8 (10), e78467(2013).</li>
<li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n3/abs/nprot.2006.232.html">Quantification of starch in plant tissues.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nature Methods. 9 (7), (2013).</li>
<li>Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970050124">Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.).</a> Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).</li>
<li>Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalloseMeasurer%3A+A+novel+software+solution+to+measure+callose+deposition+and+recognise+spreading+callose+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns.</a> Plant Methods. 8 (1), (2012).</li>
<li>Faulkner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+image+analysis+tool+for+the+identification+of+microtubule+patterns+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants.</a> Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).</li>
<li>Kuhn, B. F. <a target="_blank" href="http://www.pubhort.org/ejhs/2006/file_338662.pdf">Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. &#34;Stevnsbaer.&#34.</a> European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).</li>
<li>Johansen, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohansen%2C+DA+%22Plant+microtechnique%22">Plant microtechnique</a>. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).</li>
<li>Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1399-3054.1997.tb03437.x">Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system.</a> Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+starch+reserves+and+pistil+development+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana).</a> Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).</li>
<li>Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+histological+and+ultrastructural+changes+in+the+olive+pistil+during+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering.</a> Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).</li>
<li>Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. <a target="_blank" href="https://www.scienceopen.com/document?vid=72cb57c5-ade2-4529-b2ff-f7987d4b215e">Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research.</a> HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).</li>
<li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+clearing+and+staining+of+arabidopsis+flower+organs+and+siliques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).</li>
<li>Kaufmann, H., Blanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+carbohydrate+levels+and+relative+water+content+%28RWC%29+to+distinguish+dormancy+phases+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry.</a> Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).</li>
<li>Herrero, M., Dickinson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen-pistil+incompatibility+in+Petunia+hybrida%3A+changes+in+the+pistil+following+compatible+and+incompatible+intraspecific+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses.</a> Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Her ne kadar uyuşukluk arkasında biyolojik süreci belirsizliğini uyuşukluk içinde odunsu uzun ömürlü meyve üretiminde açık etkileri ve Ormancılık değişen bir iklimde sunar. Uyuşukluk çalışmaları farklı açılardan yaklaştı ama kış uyuşukluk biyolojik bir marker arıyorum araştırma son yılda şiddetlendi. Ancak, ne zaman bir tomurcuk uyuşukluk kırık vardır gösteren kesin bir gösterge bulmak için birçok girişimleri başarısız3olmuştur. Histochemical teknikleri18 analiz görüntüsüyl...

Ilıman odunsu çok yıllık bitkiler için mevsim onların büyüme ve gelişme oransal uyum. Bahar ve yaz aylarında geliştirirken, Sonbahar Kış1' uyuyan gitmek sırasında büyüyen durdurmak. Uyuşukluk düşük kış ısılarda hayatta kalmak izin verecek, ancak, tüyler ürpertici bir bahar2uygun bir budburst için ön koşuldur. Uyuşukluk ılıman meyve üretim ve Ormancılık önemli etkileri çeşitli çabalarını belirlemek ve uyuşukluk dönem3tahmin açmıştır. Meyve ağacı türleri, ampirik deneyler koşulları ve çiçekli verilerine dayalı istatistiksel tahminler zorlama için sürgünler aktarma uyuşukluk, tahmin etmek araştırmacılar sağlayan kırılması tarihini belirlemek için güncel yaklaşımları vardır. her çeşidinde için gereksinimleri tüyler ürpertici. Ancak, biyolojik süreçleri dayalı uyuşukluk durumunu belirlemek nasıl belirsiz3kalır.
Tatlı kiraz (Prunus avium L.), gibi ılıman meyve ağaçlarında çiçeklenme yılda bir kez oluşur ve hakkında bir iki hafta sürer. Ancak, çiçekler ve dönüşüm sırasında önceki yaz4yaklaşık 10 ay önce geliştirmek için başlatın. Çiçek primordia sonbahar kış aylarında tomurcukları içinde hareketsiz kalır sırasında büyüyen durdurmak. Bu dönemde her çeşidinde uygun çiçekli4için belirli bir tüyler ürpertici gereklilik birikir gerekir. Kış aylarında tomurcukları phenological değişiklikler olmamasına rağmen çiçek primordia sırasında uyuşukluk fizyolojik aktif ve sıcaklık soğutma birikimi son zamanlarda nişasta birikimi dinamik ile ilişkili olduğu veya azaltmak Yumurtalık primordium hücrelerde uyuşukluk belirlenmesi5için yeni bir yaklaşım sunuyor. Ancak, küçük boyutu ve yumurtalık primordium konumunu özel bir metodoloji gerektirir.
Nişasta odunsu bitki tür6büyük depolama karbonhidrat var. Böylece, nişasta değişimler için karbonhidrat onların geliştirme7,8desteklemek için gereken çiçek dokuların etkinlik fizyolojik ile ilgili olduğu. Üreme sürecinde farklı önemli olaylar da nişasta içeriği Anter mayoz9, polen tüplerinin ile stil veya ovule fertilizasyon10büyüme gibi farklı çiçek yapılarda değişimler ilgilidir. Histochemical teknikleri nişasta tespiti sırasında uyuşukluk çiçek primordia her belirli doku sağlar. Ancak, zorluk birikimi/azaltma onun desen zamana veya nişasta karşılaştırma takiben dokuların, çeşitlerin veya yıl arasında içerik izin vermek o nişasta miktarının kalır. Bu doku için analitik teknikler11kullanılabilir küçük miktarda kaynaklanmaktadır. Alternatif olarak, görüntü analiz mikroskobu12 ' ye bağlı nişasta miktar bitki doku13çok küçük örnekleri sağlar.
Callose14, mikrotüpler15, gibi bitki dokularında farklı bileşeninin içeriğini ölçmek veya özel tarafından boyanmış alanının boyutunu ölçerek16, nişasta için kullanılan mikroskobu ve görüntü analizi birleştirerek yaklaşımlar lekeleri. Nişasta için bu kolayca potasyum iyodür-iyot kullanarak tespit edilebilir (Ben2KI) tepki17. Bu yöntem son derece özeldir; Ben2KI nişasta taneleri Laminer yapısı içinde intercalates ve koyu mavi veya kırmızımsı kahverengi renk, nişasta18Amiloz içeriğine göre oluşturur. Bölümler ile lekeli2KI leke nişasta ve bir kesin nişasta algılama ve sonraki miktar görüntü analiz sistemi19tarafından izin arka plan doku arasında yeterli kontrast göster. Bu boya stokiometrik olmasa da, iyot birikimi son derece17değişebilir nişasta molekül uzunluğu ile doğru orantılıdır. Böylece, nişasta içeriği yüksek farklılıklar benzer boyutta lekeli alanlar içeren alanlar arasında bulunamadı bu yana piksel sayısı olarak ifade lekeli alanının boyutunu nişasta, içeriğini doğru yansıtmayabilir. Alternatif olarak, nişasta içeriği kayısı8,13 farklı dokularda bildirilmiştir gibi--dan mikroskop, elde edilen siyah beyaz görüntülerde lekeli granül optik yoğunluk ölçme tarafından değerlendirilecek , 19, avokado10,20ve zeytin21.
Burada, anlayış ve tahmin için yeni bir araç sunuyor nişasta içeriği yumurtalık primordium doku tatlı kiraz, Bahar sonbahardan miktar uyuşukluk durum deneysel belirlenmesi birleştiren bir metodoloji açıklamak biyolojik mekanizmaları çalışmaya dayanarak uyuşukluk ve uyuşukluk ile bağlantılı.

<table><tbody><tr><td>Hassas terazi</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopik mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma ocağı</td><td>Memmert</td><td>U15</td><td></td></tr><tr><td>Parafin Gömme istasyonu</td><td>Leica Microsystems</td><td>EG1140H</td><td></td></tr><tr><td>Döner mikrotom</td><td>Reichert-Jung</td><td>1130/Biocut</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom bıçağı</td><td>Tüy</td><td>S35</td><td>Paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>Parlak alan mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DC-300</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Analiz Sistemi</td><td>Leica Microsystems</td><td>Quantiment Q550</td><td></td></tr></tbody></table>

histochemical boyama ve nişasta yumurtalık primordia tatlı kiraz kış uyuşukluk sırasında ölçmek için görüntü analizi

Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy

Nişasta küçük yapılarda üreme aşamaya döllenme ve meyve başlangıcı tozlaşma üzerinden de dahil olmak üzere çeşitli bitki gelişim süreçleri sırasında önemli olaylar ile ilişkili değişikliklerdir. Ancak, nişasta değişimler çiçek farklılaşma sırasında tamamen, çiçek primordia özellikle küçük yapıların nişasta içeriğinde miktarının esas zorluğu nedeniyle bilinmemektedir. Burada, farklı aşamaları ile nişasta içeriğinde değişiklikler ile ilgili sağlar mikroskop bağlı bir görüntü analiz sistemi kullanılarak yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) nişasta miktar için bir yöntemi açıklamak Bahar sonbahardan uyuşukluk. Bu amaçla, bud büyüme için kontrollü şartlar kış zamanında farklı anlarda transfer sürgünlerin değerlendirerek çiçek tomurcukları uyuşukluk durumu belirlenir. Yumurtalık primordia nişasta miktar için çiçek tomurcukları ardışık olarak toplanan, sabit, parafin balmumu içinde gömülü, kesitli ve ben ile lekeli2Kl (potasyum iyodür-iyot). Ürünleri mikroskop altında gözlenen ve açıkça nişasta kökenli ayıran bir Image analyzer tarafından incelendi. Nişasta içerik değerleri her bir pikselin optik yoğunluk okudu çerçeve nişasta içeriği bir tahmini olarak toplamı dikkate alınarak lekeli nişasta için karşılık gelen görüntü optik yoğunluk ölçerek elde edilir.

Uyuşukluk çalışmalar ne zaman ürpertici koşulları yerine getirmek an belirlenmesi gerekir. Düşük sıcaklık altında belirli bir süre geçene phenological değişiklikleri alan koşullarında (şekil 1A) kış aylarında olmamasına rağmen uygun koşullarla büyüme kapasitesini kiraz ağaçları geri mi. Sürgünleri Kış saati sırasında kontrollü şartlar Odası (şekil 1B) için normal aktarım çiçek tomurcukları uyuşukluk durumunu değerlendirilmesi izi...

Biz histochemical teknikleri ile kombine bir görüntü analiz sistemi kullanılarak sırasında kış uyuşukluk yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) içinde nişasta içeriğinde ölçmek için bir metodoloji mevcut.

Histochemical boyama ve nişasta yumurtalık Primordia tatlı kiraz kış uyuşukluk sırasında ölçmek için görüntü analizi

Changes in starch in small structures are associated with key events during several plant developmental processes, including the reproductive phase from ...

Bu yöntem, neden çiçek tomurcukları düzgün çiçek kış aylarında soğuk birikmesi gerekir gibi odunsu bitki, uykudalık hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, çiçek primordium çok küçük örneklerinişasta nicelik sağlar. Bu yaklaşım, uyku sırasında çiçek primordium fizyolojik aktivitesini tespit etmek için çok yararlıdır ve aynı zamanda kayısı veya erik gibi diğer ağaç türlerine uygulanabilir.Bu yöntem, atıl çiçek tomurcuk içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda meyve başlangıcı tozlaşma üreme aşaması gibi diğer süreçleriçin uygulanabilir. Başlamak için, alanından beş sürgünler toplamak. Sonra tartmak ve dört santigrat derece en az 24 saat fiksatif çözelti ile 10 mililitrelik cam tüp 10 çiçek tomurcukları düzeltmek.Bundan sonra, fiksatif atın ve örnekleri kapsayacak kadar% 75 etanol ekleyin. Her biri 10 çiçek tomurcukları ile uzunluğu 15 ila 30 santimetre ve çapı beş milimetre olan üç sürgünler elde edin. Daha sonra sürgünleri suyla ıslatılmış çiçekçi köpüğünün üzerine bir büyüme odasına yerleştirin.Büyüme odasında 10 gün sonra, sürgünler çiçek tomurcukları çıkarın ve onları tartmak. Sonbaharın başlangıcından ilkbaharda tomurcuk patlamasına kadar her hafta, çiçek tomurcuklarının büyümesini değerlendirin. Her numuneden dış tomurcuk ölçeklerini çıkarın ve her bir tomurcukları %75 etanol içeren bir saat makinesinin bardağına yerleştirin.Tomurcukları incelemek ve her tomurcuktan en az bir çiçek primordium elde etmek için hassas forceps ve oftalmolojik neşter kullanın. Örnekleri parafin balmumuna tek tek gömerek bir blok oluşturup döner bir mikrotome bölün. Örnekleri kesitle dikten sonra, bir bölüm üzerine taze Lugol iyot damlası uygulayın.Beş dakika sonra, leke kağıdı ile fazla leke kaldırın. Daha sonra küçük bir damla sentetik montaj ortamı uygulayın, numunenin üzerine küçük bir kapak camı yerleştirin ve sertçe bastırın. Montaj ortamı kuruduktan sonra, parlak alan mikroskobu altında lekeli bölümü gözlemleyin.Önce diyafram diyaframını ve parlaklık kontrolünü metin protokolüne göre ayarlayın. Ardından filtre tutucuda filtre olmadığından emin olun ve mikroskopta bir parlaklık alanı koşulu seçin. Bundan sonra, doku olmadan lekeli hazırlık için kamera ayarlarını ayarlayın.Parlaklığı %50'de düzeltin Sonraki aşırı pozlama/pozlama fonksiyonunu etkinleştirin ve pozlama süresini aşırı pozlama sınırında ayarlayın. Beyaz dengesi işlevini ve gölgeleme düzeltmesini uygulayın. Doku olmadan lekeli hazırlık ortaya çıkan siyah-beyaz görüntü gri düzeyini ölçün.Ardından 4N filtre uygulayın, hazırlıktan başka bir siyah-beyaz görüntü alın ve gri seviyeyi ölçün. Sonraki ışık olmadan aynı hazırlık bir görüntü elde ve ortaya çıkan görüntü ve kalibre gri düzeyini ölçmek. Bundan sonra, en az 300 dpi çözünürlüğe sahip TIFF formatında bir örnek bölümün renkli görüntüsünü elde edin.Lekeli alana karşılık gelen bir ikili görüntü oluşturun ve ardından ikili görüntü lekeli nişasta granüllerini tam olarak yansıtana kadar üç renk eşiğini ayarlayın. Son algılama seviyelerinde ince ayar yapmak için bu işlemi diğer preparatlar ve dokularla tekrarlayın. Görüntü analiz sistemini kullanarak, alandaki nişasta içeriğini ölçmek için maskenin altındaki her pikselin optik yoğunluğunun toplamını ölçün.Bu protokolde, uygun koşullarda 10 gün sonra tomurcuk ağırlığındaki artış ölçülerek çiçek tomurcuk büyüme ve hareketsizlik durumu değerlendirildi. Uyku sırasında uygun koşullarda 10 gün sonra herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Bir kez uykuda üstesinden geldi, tomurcukları şişti ve büyüme odasında patladı.Yumurtalık primordiyumundaki nişasta içeriği her mikrotomitli bölümde görüntü analizi ile ölçüldü. Sürekli olarak, kış başında nişasta miktarı 40,000'den daha az optik yoğunluk değeri sunmuştur ve maksimum miktar çalışmanın her iki yılında da 120, 000 ve 140,000 arasında bir değere ulaşmıştır. Uykuda lığı göz önünde bulundurarak, her iki yıl boyunca soğutucu yerine getirilmesi ile birlikte nişasta maksimum miktarda meydana geldi.Görüntü analizörü tarafından kullanılan algılama düzeylerinin doğrudan sistemin kalibrasyonuna bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Bu ışık durumu, leke yoğunluğu ve mikroskop büyütme içerir. Bu durum tüm hazırlıklar için düzeltilmelidir.Histokimyasal tekniklerin görüntü analizi ile birleşimi, hareketsizliğin farklı evrelerinde çiçek primordiumunun karbonhidrat rezervinin incelenmesinde çok yararlı olmuştur. Diğer tür ve dokulara da uygulanabilir. Bu yöntemin kullanımı ile açıklanan yumurtalık primordia uykuda salınım ı ve nişasta birikimi arasındaki ilişki, hareketsizlik ve soğutma gereksinimleri biyolojik temelini anlamak için sağlam bir temel sağlar.Gelecekteki çabalar, ağacın hareketsizlik durumunu kolayca gösterebilecek güvenilir biyolojik göstergeleri incelemeye odaklanmalıdır. Bu arada, uykuda boyunca nişasta varyasyonları desen daha fazla fizyolojik ve genetik çalışmalar çerçeve için kullanılabilir.

combining-histochemical-staining-image-analysis-to-quantify-starch

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bitki hücre duvarı bileşimi doku tipleri arasında farklılık gösterir ve lignin, selüloz, hemiselülozlar ve pektin içerebilir. Hücre tipi düzeyindeki farklılıkları görselleştirmek için çeşitli boyama teknikleri geliştirilmiştir. Bu makale, yaygın olarak kullanılan hücre duvarı boyama tekniklerinin bir derlemesidir.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Yaprak biti embriyoları üzerinde tam montajlı immün boyama protokolü sunulmuştur, burada arka plan boyamasını azaltmak ve doku geçirgenliğini artırmak için kritik koşullar ele alınmaktadır. Bu koşullar, yaprak bitlerinin embriyonik dokularında protein ekspresyonunun etkili bir şekilde tespit edilmesi için özel olarak geliştirilmiştir.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Burada, köklerinin genç farelerin kültürlü yumurtalık içinde seri kesit olmadan ölçmek için bir protokol mevcut. Ayirt bütün organ ve doku takas kullanarak, fiziksel kesit optik kesit ile değiştirilir. Bu yöntem örnek hazırlama ve görselleştirme organ bütünlüğü korur ve belirli hücre otomatik miktar kolaylaştırır.

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Bu teknik, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin gözlem ve analizi için tam tohum büyüklüğünde reçine bölümünün hızlı ve basit hazırlanmasına olanak sağlar.

Tam Tohum Lu Reişin Elde Edilmesinde Basit Bir Kuru Kesit Yöntemi ve Uygulamaları

Elma hamuru hücrelerinin izole protoplastları sitoplazmik Ca2+ konsantrasyonu tespit etmek için kalsiyum floresan reaktif ile yüklendi.

Apple Pulp'da Sitoplazmik Ca2+'yı Fluo-4/AM ile Boyama

Burada, tam montajlı immünoboyama, çoklu foton mikroskobu ve 3D görselleştirme ve analiz kullanarak kantitatif ve kalitatif analizler için tüm yumurtalıkları görüntülemek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlilleri için geçerli olan yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi kapsar.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Öğrenin tatlı kiraz (Prunus avium L.) çiçek tomurcuklarında nişasta miktarını histokimyasal boyama ve görüntü analizi ile kış uyuşukluğu sırasında nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, odunsu bitkilerde fizyolojik aktiviteyi değerlendirmek için değerli bir araçtır.

Histochemical boyama ve nişasta yumurtalık Primordia tatlı kiraz kış uyuşukluk sırasında ölçmek için görüntü analizi

Daha fazla video keşfet