Hedeflenen Plasmid DNA teslim için metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler
6 Ağustos 2019
Bu çalışma, geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler (mBG) hazırlanması sunar. Elde edilen mBG 'nin plazmid DNA 'Sı karmaşıklığı ve transfeksiyon verimliliği de incelenmiştir. Raft yöntemi, özel fonksiyonel gruplar içeren polimerleştirici monomerlerin için çok yararlıdır.
Katyonik polimer ilaç taşıyıcıları iyi stabilite, düşük immünojenite ve kolay hazırlık ve modifikasyon avantajlarına sahiptir. Burada, sentezi için hızlı ve basit bir yöntem sunuyoruz. Geri dönüşümlü ek parçalama zinciri transfer polimerizasyon yöntemi kontrollü moleküler ağırlık ve yapı ve fonksiyonel gruplar taşıyan blok polimerler verim için geçerli bir yöntemdir.
Bu ilaç taşıyıcıları aynı anda kanser, inflamasyon ve diğer hastalıkların işbirliği tedavi elde etmek için farklı ilaçlar taşıyabilir. IFT polimerizasyonu klasik bir yöntemdir ve bu protokol gen terapisinde uygulanmasına bir örnek vermektedir. Bu polimerin sentezinde başarının anahtarı reaksiyon sıcaklığını tam olarak kontrol etmektir.
Bir su banyosu daha bir yağ banyosu kullanmak için daha tavsiye edilir. Bu prosedüre başlamak için, polimerizasyon şişesi olarak kullanılmak üzere bir kauçuk durdurucu ve manyetik karıştırıcı ile yuvarlak alt şişe elde edin. Polimerizasyon şişesinde bir mililitre distile suda 1,87 gram bis-hidroksi HEMA çözün.
Beş mililitrelik bir kabın içinde, 0.03 gram CTP ve 0.02 gram ACVA'yı 0,5 mililitre 1, 4-dioksan olarak çözün. Polimerizasyon şişesine bu karışımı ekleyin. Daha sonra, polimerizasyon şişesinde çözelti dondurmak için bir yoğuşma tuzağı kullanın.
Şişeyi demir desteğine sabitleyin ve vakumlamak ve reaksiyon karışımına azot enjekte etmek için iğneyle tökezleyen bir kanal kullanın. Daha sonra polimerizasyon şişesini kapatın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika eritin. Bu donma pompası çözülme döngüsünü üç kez tekrarlayın.
Bundan sonra, 70 santigrat derece bir yağ banyosu içine şişe yerleştirin ve çözelti azot atmosferi altında 24 saat boyunca tepki sağlar. Ertesi gün, polimerizasyon şişesini sıfır santigrat derecede soğutun ve polimerizasyon reaksiyonunu sonlandırmak için kauçuk durdurucuyu açın. Daha sonra, iki saat boyunca negatif 20 santigrat derecede bir buzdolabında precool aseton, ve 50'ye bir oranında polimerizasyon şişesinde reaksiyon çözeltisi ile karıştırın.
Santrifüj bu karışımı 8, 200 kez g 10 dakika asetonu kaldırmak ve çökelti toplamak için. Sentezlenen poli bis-hidroksi HEMA'yı arındırmak için toplanan çökeltiyi iki mililitre saf suda çözün. Daha sonra, 1-50 oranında önceden soğutulmuş aseton 100 mililitre ile karıştırın.
Çökelti toplamak için 10 dakika boyunca 8, 200 kez g çözeltisantrik. Çökeltme işlemini üç kez eritme, karıştırma ve santrifüj işlemini tekrarlayın. İlk olarak, 10 mililitrelik bir kabın içinde beş mililitre distile suda 0,96 gram APMA ve 0,93 gram saflaştırılmış poli bis-hidroksi HEMA'yı çözün.
0,01 gram ACVA'yı 0,5 mililitre 1, 4-dioksan olarak çözün ve bunu APMA ve poli bis-hidroksi HEMA çözeltisine ekleyin. Bu karışımı bir polimerizasyon şişesine aktarın ve kuru nitrojenle bir saat havalandırın. Sonra polimerizasyon şişesini 70 santigrat derecede bir yağ banyosuna koyun ve azot atmosferinin altında 24 saat boyunca tepki göstermesine izin verin.
Ertesi gün, polimerizasyon şişesini sıfır santigrat derecede soğutun ve polimerizasyon prosesi çözümemesini sonlandırmak için kauçuk durdurucuyu açın. Başlamak için, tohum MCF-7 hücreleri iyi başına 20, 000 hücre yoğunluğunda altı iyi plaka kuyularına. 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesindeki hücreleri 12 saat boyunca %5 karbondioksitle kültüre sittirin.
Bundan sonra kültür ortamını, azot-fosfor oranlarının farklı oranda katyonik polimer ve pDNA polipleksler içeren taze kültür ortamı ile değiştirin. Kültür hücreleri altı saat, ve sonra taze RPMI 1640 orta iki mililitre ile orta değiştirin. 48 saat boyunca kültür emzme devam edin.
Sonra, hücreleri toplamak ve yeşil floresan algılamak için bir akış sitometre kullanın. Bu çalışmada metiyonin fonksiyonelleştirilmiş biyouyumlu blok kopolimerler geri dönüşümlü ek parçalama zinciri transferi yöntemi ile hazırlanır ve elde edilen mBG'nin plazmid DNA karmaşıklaştırma yeteneği ve transfeksiyon etkinliği araştırılmıştır. MBG/pDNA polikseksilerinin ortalama partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli 16 N-p oranında sırasıyla 124 nanometre ve artı 15.7 milivoltdur.
Elektroforetik gerilik, N-p oranı sıfır olan pDNA'nın agarose jelde dizginleme olmadan hareket edebildiği ve jel görüntüleyicide bir şerit olarak gözlendiğini ortaya koymaktadır. PDNA mBG ile karmaşıklandığında, pDNA hareketi gerizekalı ve daha sonra bandın parlaklığı azalır. Bu, N'den P'ye dörtten yüksek olduğunda mBG'nin pDNA'yı tamamen karmaşıklatadığını gösterir.
MBG/pDNA polikseksilerinin sitotoksisitesi standart MTT testi kullanılarak ölçülür Bu sonuçlar mBG/pDNA polikseslerinin dört, sekiz, 16 ve 32'lik N--P oranlarında PEI/pDNA polikseksilerden daha sitotoksite olduğunu göstermektedir. Görüldüğü gibi mBG/pDNA polikseksilerin sitotoksisitesi artmış N-p oranı ile artar. Bu artmış sitotoksisite pozitif yüklü GPMA bileşeninin bir sonucudur.
PDNA transfeksiyon deneyinde kullanılan N-P oranı sitotoksisite sonuçlarına göre seçilir. MBG1, mBG2 ve mBG3 transfeksiyon yetenekleri GFP floresan yoğunluğu ölçülerek karşılaştırılır ve sonuçlar mBG3'ün optimal gen taşıyıcısı olduğunu göstermiştir. Silt yuvarlak alt şişeden havayı tüketmek ve reaksiyon sıcaklığını korumak önemlidir.
Elde edilen polimer ilaç taşıyıcıları sinerjik ilaç dirençli kanser tedavisinde kemoterapi ilaçları ve gen ilaçların ın ortak teslim uygulanabilir. Gen ilaçları ve kemoterapötik ilaçların kombinasyonunun moleküler mekanizması ilaca dirençli tümörlerin tedavisinde daha fazla araştırılabilir. Aseton akut toksisitesi için düşük toksik olarak derecelendirilmiştir.
Anahtarlar, teneffüs veya göz veya deri ile temas kaçınılmalıdır. Isıtma işlemi sırasında haşlanma riskine karşı kaçının.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, reversibl ekleme-fragmentasyon zincir transferi (RAFT) polimerizasyon yöntemi kullanarak katyonik polimer ilaç taşıyıcılarını sentezlemek için hızlı ve basit bir yöntem sunmaktadır. Sentezlenen metionin fonksiyonelize edilmiş biyokompatible blok kopolimerler (mBG) plazmid DNA komplekslenme yetenekleri ve transfeksiyon verimlilikleri açısından değerlendirilmiştir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Polimer Kimyası
- Gen Terapisi
- İlaç Teslimat Sistemleri
Arka Plan
- Katyonik polimer ilaç taşıyıcıları stabilite ve düşük immünojenisite sunar.
- RAFT polimerizasyon, kontrollü moleküler ağırlık ve yapı sağlar.
- Bu taşıyıcılar, işbirlikçi tedavi için birden fazla ilacı taşıyabilir.
- Reaksiyon sıcaklığının kesin kontrolü başarılı sentez için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Biyokompatible blok kopolimerler sentezlemek için bir yöntem geliştirmek.
- Sentezlenen polimerlerin DNA komplekslenme yeteneğini araştırmak.
- İlaç taşıyıcılarının transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Geri dönüşümlü ekleme-fragmentasyon zincir transferi (RAFT) polimerizasyon.
- Metionin fonksiyonelize edilmiş blok kopolimerlerin sentezi.
- Plazma DNA komplekslenme yeteneğinin değerlendirilmesi.
- Transfeksiyon verimliliğinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Sentezlenen mBG etkili plazmid DNA komplekslenmesi göstermiştir.
- Transfeksiyon verimliliği başarılı bir şekilde değerlendirilmiştir.
- RAFT polimerizasyonunun fonksiyonelize polimer sentezine faydalı olduğu kanıtlanmıştır.
- Yöntem, birden fazla ilacın eşzamanlı teslimine izin verir.
Sonuçlar
- Çalışma, mBG sentezlemek için bir yöntemin başarılı bir şekilde geliştirildiğini göstermiştir.
- Bu biyokompatible polimerler gen terapisi uygulamaları için umut vaat etmektedir.
- İlaç teslimindeki etkinliklerini artırmak için daha fazla araştırma yapılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This work presents a RAFT polymerization-based method for synthesizing methionine-functionalized biocompatible block copolymers capable of complexing plasmid DNA, offering a tunable platform for gene delivery vector development. The ability to control molecular weight, charge ratio, and particle size enables predictive design of non-viral carriers with reduced cytotoxicity compared to PEI, supporting early-stage de-risking of nucleic acid therapeutics. Such systems address the need for scalable, reproducible polymer synthesis in preclinical discovery workflows where mechanistic clarity and formulation consistency impact go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-DNA interactions through quantifiable complexation at defined N/P ratios, supporting target validation via controlled gene delivery.
- Operational Value: Provides a reproducible synthesis route for cationic block copolymers with tunable methionine and guanidine functionalization, reducing variability in early screening assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates well-defined polyplexes with measurable zeta potential (+15.7 mV at N/P 16) and size (124 nm), enabling standardized assessment of transfection efficiency and cytotoxicity.
- Operational Value: Facilitates high-throughput screening of polymer variants (mBG1, mBG2, mBG3) by linking APMA content (21%, 37%, 52%) to functional outcomes in gene transfer assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates complete plasmid DNA retardation at N/P >4, indicating reliable cargo protection—a key preclinical benchmark for vector stability.
- Operational Value: Supports formulation screening across N/P ratios (8, 16, 4) to identify optimal transfection conditions while monitoring cytotoxicity trends linked to GPMA content.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling synthesis of defined gene carriers for lead identification in nucleic acid delivery, where polymer structure-function relationships inform advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on polymer-mediated gene delivery by providing quantifiable outputs (particle size, zeta potential, transfection efficiency) to correlate structure with biological activity.
- Screening: Enables assay-ready polyplex production with consistent size (100–200 nm at N/P 16–32) and surface charge, improving reproducibility across compound evaluation campaigns.
- Analytics: Generates measurable biophysical readouts (N/P ratio, zeta potential, electrophoretic retardation) that allow comparative analysis of polymer variants under standardized conditions.
- Translational Research: Connects polymer design to preclinical relevance through demonstrated pDNA complexation and reduced cytotoxicity relative to PEI, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular RAFT-based platform adaptable to other functional amino acids or therapeutics, promoting cross-project standardization in polymer synthesis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in gene carrier performance by linking molecular design (methionine/guanidine content) to DNA binding and transfection outcomes.
- Operational Value: Delivers a scalable, purification-friendly synthesis protocol using acetone precipitation and RAFT control, improving batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by offering a lower-cytotoxicity alternative to PEI, enabling better go/no-go decisions in nucleic acid therapeutic development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer leads (e.g., mBG3 as optimal carrier) based on transfection efficiency and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RAFT polymerization, including freeze-pump-thaw degassing and inert atmosphere handling.
- Dependent on precise temperature control (oil bath at 70°C) and specialized reagents (ACVA, CTP) for reproducible block copolymer synthesis.
- Necessitates analytical infrastructure for GPC, zeta potential, particle sizing, and fluorescence-based transfection assays to evaluate polyplex performance.
- Adaptation to other cell lines or payloads may require re-optimization of N/P ratio and cytotoxicity assessment due to variable GPMA-mediated effects.
- Practical limitations include the need for multi-step purification and sensitivity to oxygen during polymerization, which must be mitigated via rigorous degassing protocols.
