Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

İmmünofluoresans adrenal zonation hakkında adrenal alanda anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir temel bir yöntemdir, hücre kimliği ve fonksiyonu. Bu tekniğin en büyük avantajı, adrenal dokunun morfolojisini korurken birden fazla proteinin incelenmesine olanak sağlamasıdır. Murine adrenal bezi kaldırmak için, çevreleyen yağ dokusu etrafında kesilmiş ve buz üzerinde taze PBS içeren 24-multiwell plaka bir kuyuda bezi yerleştirin.

Bir diseksiyon mikroskop altında bir Petri çanak veya cam destek üzerine bezi aktarın ve bitişik yağ dokusu kaldırmak için iki 25 gauge iğnekullanın. Tüm yağ çıkarıldığında, iki saat boyunca sallanan ile dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit doku düzeltmek. Kuluçka sonunda bezi, yıkama başına bir ila iki mililitre taze PBS cinsinden dört santigrat derecede üç adet 15 dakikalık yıkama ile durula.

Son yıkamadan sonra, iki sıralı etanol daldırma içinde dört derece santigrat bezi dehydrate ve kuluçka başına iki saat sallanan. İşleme için adrenal doku hazırlamak için, gazlı bezsarın ve bir doku gömme kaset adrenal içine. Daha sonra, işlem kadar dört derece santigrat depolama için% 70 etanol ile dolu bir kavanoza kaset yerleştirin.

Dokuyu işlemek için kaseti tabloda belirtildiği gibi işlenmesi için doku işlemcisine takın. Programın sonunda, kaseti erimiş 65 derece parafinle dolu bir gömme istasyonuna aktarın ve gazlı bezin imal etmek için bir çift forceps kullanın. Yavaşça katıştırma kalıp tabanının merkezinde uygun pozisyonda adrenal transfer ve bezi üzerine erimiş parafin dökün.

Daha sonra, parafinsertliğini kolaylaştırmak için gömme kalıbını bir soğutma tepsisine dikkatlice taşıyın. Döner mikrotom ile kesit yapmadan önce, bir dizi mikroskop slaytını etiketlendirin ve slaytları 37 derece lik santigrat kaydırak ısıtıcısına yatırın. Her slayt üzerine otoklavlı tip bir ultra saf su yaklaşık 450 mikrolitre dağıtın ve beş mikrometre mikrotomun kesme kalınlığını ayarlayın.

Gömülü dokuyu kesme bloğuna yükleyin ve numune mikrotom bıçağının kenarı ile yüz hizasına gelene kadar parafin bloğunu indirin. Sabit bir ritim ile el tekerleği döndürme, parafin kaldırmak ve adrenal doku ortaya çıkarmak için bir ilk kırpma gerçekleştirin. Daha sonra, toplandığı gibi önceden etiketlenmiş slaytlar birine su damlacık içine her bölümü aktarmak için forceps kullanarak adrenal bezin sonuna kadar beş mikrometre bölümleri elde.

Mikroskopi ile bölümlerde doku varlığını doğruladıktan sonra, yaklaşık iki saat boyunca sıcak plaka üzerinde slaytlar kuru ve daha fazla su görünür kadar 37 santigrat derece bir slayt tepsisinde en az bir gecede pişirin. Kurutuldıktan sonra, slaytları oda sıcaklığında bir slayt kutusunda saklayın. İmmünofloresan antijen alımı için, iki beş dakika 100% ksilen daldırma ile slaytlar de-parafinize, alçalan bir etanol ve su daldırma serisi rehidrasyon izledi.

Su daldırma sonra, bir metal slayt tutucu için slaytlar aktarın ve 10 dakika boyunca bir sıcak plaka üzerinde 0,01 azı sitrat kaynayan bir kabın içinde tutucu yerleştirin. Kuluçka sonunda, sıcak tabaktan beher çıkarın ve 20 dakika soğumasını bekleyin, tüm adrenal bölümleri hala tampon ile kaplı olduğunu dikkat çekerek. Kabı soğuduğunda, slaytları bir Coplin kavanozuna aktarın ve taze PBS'de hafif sallanan üç 10 dakikalık yıkıntılar.

Son yıkamadan sonra, doku bölümlerine zarar vermeden her slaytyüzeyini dikkatlice silin ve her bölümün etrafında bir daire yapmak için hidrofobik bir marker kullanın. Slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her bölüme en az 50 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin. Engelleme kuluçka sonunda, sallayarak ve odaya slaytlar dönmek ile yıkama başına beş dakika taze PBS slaytlar üç kez yıkayın.

Daha sonra, dört santigrat derece bir gecede kuluçka için her bölüme ilgi birincil antikor kokteyl ekleyin. Ertesi sabah, numuneleri yıkama başına taze PBS'de 15 dakikalık üç yıkayarak yıkayın ve slaytları ışıktan korunan bir saat boyunca uygun ikincil antikor solüsyonuyla etiketleyin. Kuluçka sonunda, numuneleri ışıktan korunan bir kaya üzerinde 15 dakikalık üç yıkama yla yıkayın ve son yıkamadan sonra ışıktan korunan oda sıcaklığında yedi dakika boyunca bölümlerin çekirdeklerini DAPI ile etiketleyin.

Üç beş dakikalık PBS sallanan yıkar sonra, örnek başına bir kapak cam yüzeyi boyunca immünororescence için uygun montaj ajanı 60 mikrolitre ekleyin ve hafifçe bir kapak cam üzerine her slayt doku bölümü yan aşağı basın, kabarcıklar önlemek için özen. Daha sonra, görüntülemeden önce en az 24 saat oda sıcaklığında kür için koyu bir kapta her slayt düz yatıyordu. Yağ kaldırma işlemi sırasında, dehidratasyon doku yapısına zarar verebilir gibi adrenal bezi kurumasına izin vermemek için önemlidir.

Çevreleyen yağ dokusunun başarılı bir şekilde çıkarılmasından sonra, böbreküstü bezi ekstra görünür yağ ile kolayca tespit edilmelidir. Gösterildiği gibi adrenal bez bölümlerinin immünostaining nükleer steroidojenik faktör bir adrenokortikal hücrelerin boyanması ortaya koymaktadır, medüller hücrelerin tirozin hidroksilaz boyama, dış kapsül non-steroidogenik hücrelerin çekirdeklerinin DAPI boyama, ve adrenokortikal ve medüller hücreler ile co-boyama. Bu yordamı denerken, fare adrenallerinin küçük olduğunu ve konumlarının biraz değişken olduğunu ve tespitlerini zorlaştırdığını hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, diseksiyon sırasında alanın net bir görünüme sahip olmak çok önemlidir. Bu prosedürler in vivo adrenal bezin in çalışma için temel tekniklerdir. Bunları takiben, belirli bilimsel ihtiyaçları karşılamak için immünboyama ek yöntemler yapılabilir.

Gelişiminden sonra, immünboyama biyomedikal bilim alanlarında araştırmacılar için yerinde protein ekspresyonu, birçok disiplin ve alanlarda yararlı bir araç keşfetmek için yol açtı.