Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma
1 Kasım 2018
Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.
Bu yöntem kloroplast alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, örneğin, kloroplast protein ithalat makine bileşimi. Bu yeşilleme ve fotosentez ve dolayısıyla gezegende gıda üretimi için gereklidir. Moleküler makine, TOC ve TIC adı verilen kloroplastın dış ve iç yapısında iki ayrı kompleksten oluşur, ancak bileşimi tam olarak bilinmemektedir.
Bu tekniğin en büyük avantajı Arabidopsis TOC/TIC kompleksinin arınma yöntemi olan TAP-TOC arınması ile gerçekleştirilmesidir. Bu özel ve verimli bir yöntemdir. Kloroplast membran fraksiyonlarının, deterjan, çözünürlüğü veya afinite arınma izolasyonuna aşina olmadıkları için genellikle, bu yönteme yeni araştırmacılar mücadele edebilirler.
Arabidopsis bitkileri hazırlandıktan sonra, soğuk bir harç ve kum ile havaneli kullanarak, sıvı azot üç haftalık fideler 10 gram öğütün. Zemin dokulara soğuk taşlama tampon 20 mililitre ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve karışımın buzda çözülmesine izin verin.
Daha sonra, taşlama tamponu ile hızlı filtrasyon malzemesi iki kat ıslatın. 50 mililitrelik konik santrifüj tüpü içine filtrasyon malzeme iki tabaka ile homogenate filtre. 1, 500 kez g dört santigrat derece 10 dakika ve taze, önceden soğutulmuş 50 mililitre konik santrifüj tüp supernatant aktarın filtrasyon.
Santrifüjün aynı koşullarda bir kez daha tekrarlayın. Supernatant soğuk bir 38,50 mililitre ultracentrifuge tüp aktarın ve soğuk taşlama tampon ile 35 mililitreye kadar üst. Bir saat boyunca 100, 000 kez g ve dört santigrat derece numune santrifüj için ultracentrifuge kullanın.
Bir cam Teflon homogenizer kullanarak, taşlama tampon yeşil pelet resuspend. 100, 000 kez g ve bir saat için dört derece santigrat centrifuge ve supernatant atın. Bir x taşlama tampon 18,75 mililitre yeşil pelet resuspend için cam Teflon homogenizer kullanın.
Sonra başka bir 9.375 mililitre bir x taşlama tampon ekleyin. Son hacmi 37,5 mililitreye çıkarmak için 4 x solubilizasyon çözeltisinin 9,375 mililitresini ekleyin ve 30 dakika boyunca dört derece santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, bir saat boyunca 100, 000 kez g ve dört santigrat derece numune santrifüj için bir ultracentrifuge kullanın.
Çözünür membranları içeren süpernatantı 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. IGG agarose reçinesini hazırladıktan sonra, daha önce yıkanmış IGG agarose reçinesini 37,5 mililitre çözünür membran içeren 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Dört santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıyla gece boyunca kuluçkaya yat.
Ertesi gün, tortu IGG agarose rezorin 100 kez g ve dört derece santigrat beş dakika. Supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. IGG agarose regin tampon A 37.5 mililitre ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dönen bir shaker inkübat oldu.
Metin protokolünde belirtildiği gibi rekaryonu tortulama ve yıkamaya devam edin. Bundan sonra, IGG agarose reçinesini 35 mikron filtreli 500 mikrolitrelik bir spin sütununa aktarın. Denge için 300 mikrolitre TEV elüsyon tamponu ile boncukları iki kez yıkayın.
Daha sonra, TEV elüsyon tampon 300 mikrolitre eklemek TEV proteaz 10 mikrolitre içerir. Spin sütununa termmikterle 16 derece santigrat ve 350 rpm'de boncuklarla iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra, spin sütunu açın ve yeni, temiz, 1,5 mililitrelik bir tüp yerleştirin.
Bu tüpü 100 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün. Bu çalışmada transgenik A.thaliana bitkilerinden TAP etiketli kloroplast zarf protein kompleksi saflaştırılır. İmmünoblot analizi TAP-TOC159'un TOC kompleksinin TOC75 ve TOC33 ile etkileşime girdiğini doğrulamaktadır.
TOC159 fosforilasyon bilinen kloroplast dış membran kilaz, KOC1 de izole edilmiştir. TIC110'un varlığı, izole TAP-TOC159 kompleksinin tic kompleksinin bileşenlerini de içerdiğini ortaya koymaktadır. FBN1A antikorları TAP-TOC159 kompleksini tanıyamadı ve kontaminasyonun olmadığını gösteriyordu.
Negatif kontrolde, immünopsipitated NTAP proteini TOC, TIC proteinlerinin hiçbiriyle birlikte izole edilmedi ve TAP-TOC159 saflaştırmasının özgüllüğünü doğruladı. Bu yöntem kloroplast protein ithalatı içine fikir sağlayabilir rağmen, potansiyel Arabidopsis thaliana şişe sisteminde başka bir kompleks uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, bilinen bileşenlerin varlığını göstermek veya TOC ve TIC komplekslerinin yeni bileşenlerini belirlemek için batı lekeleme veya kütle spektrometresi gibi başka yöntemler de uygulanabilir.
Bu teknik, TOC ve TIC komplekslerinin yeni bileşenlerinin işlevini araştırmak için kloroplast protein ithalat alanında araştırma nın önünü açmıştır.
Genel Bakış
Bu makale, TAP-tag kullanarak kloroplast protein içeri aktarma komplekslerini (TOC-TIC kompleksi) saflaştırmak için tek adımlı bir afinite-izolasyon protokolü sunar. Bu yöntem, kitle spektrometrisi ile yeni etkileşim ortaklarını tanımlayabilir ve kloroplast işlevini anlamak için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kloroplast biyolojisi
- Protein saflaştırması
- Kitle spektrometrisi
Arka Plan
- Kloroplast protein içeri aktarma makinesi, fotosentez ve gıda üretimi için gereklidir.
- TOC ve TIC kompleksleri protein içeri aktarma ile ilgilidir, ancak tam bileşimleri tam olarak anlaşılmamıştır.
- Bu kompleksleri izole etmek için mevcut yöntemler karmaşık ve zaman alıcı olabilir.
- Bu çalışma, saflaştırma sürecini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- TOC-TIC kompleksini saflaştırmak için basit bir protokol geliştirmek.
- Kloroplast protein içeri aktarımında yer alan yeni bileşenlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
- Arabidopsis thaliana'daki diğer protein komplekslerine uygulanabilecek bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Arabidopsis fidelerinin hazırlanması ve sıvı nitrojen içinde öğütülmesi.
- Kloroplast zarlarını izole etmek için sıralı santrifüjleme.
- IGG agaroz reçinesi kullanarak afinite saflaştırması.
- Spesifik proteinlerin varlığını doğrulamak için immunoblot analizi.
Ana Sonuçlar
- TAP-TOC159 kompleksi başarıyla saflaştırıldı ve TOC75 ve TOC33 ile etkileşime girdiği gösterildi.
- TIC110'un birlikte izolasyonu, saflaştırılmış komplekste TIC bileşenlerinin varlığını gösterdi.
- Yöntem özgüllük gösterdi, çünkü negatif kontroller TOC ve TIC proteinleri ile birlikte izolasyon göstermedi.
- Bu teknik, kloroplast protein içeri aktarma mekanizmalarının daha fazla keşfini sağlar.
Sonuçlar
- TAP-tag saflaştırma yöntemi, kloroplast protein komplekslerini izole etmek için verimli ve özgürdür.
- Bu yaklaşım, kloroplast protein içeri aktarma sistemi üzerindeki araştırmaları geliştirebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemi kullanarak TOC ve TIC komplekslerinin yeni bileşenlerini tanımlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
