Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Bu yöntem, protein etkileşimi alanında proteinin doğrudan küçük veya büyük bir moleküle bağlanıp bağlanmadığı gibi anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, atomik düzeyde doğrudan etkileşimleri tespit etmek için basit ve hızlı bir şekilde olmasıdır. Fırlatma komutu ej ile hava akışını açın.

Bu mıknatıstan gelen örneği getirecek. Şimdi, açıkta mıknatıs üstüne bir spinner içinde örnek yerleştirin. komut ij ile ekleyin.

Devam etmeden önce örnek mıknatısın içine yerleşene kadar bekleyin. Edc komutunu kullanarak yeni bir veri kümesi oluşturun ve zGPR deneyini seçerek standart proton NMR parametrelerini yükleyin. AD, deneme numarası ve işlenmiş veri klasörü numarası alanlarını doldurun.

Set çözücü alanında çözücüseçin ve standart probkafası ve solventbağımlı parametreleri okumak için Execute getprosol tıklayın. Kilidi komutunu kullanarak numuneyi deuterated çözücüye kilitleyin ve süpürme bitene ve kilit elde edene kadar bekleyin. Otomatik ayar komutunu kullanarak örneği ayarlayarak mıknatısın rezonans frekansını düzeltin.

Otomatik ayar tamamlanana kadar titreme eğrisini izleyin. Topşimi kullanarak manyetik alanı shim. Shimming manyetik alana ayarlama yapar.

Örnek etrafında tekdüzelik elde edin. Bu komut wsh ile değerlerde bu depolamak için iyi bir uygulamadır ve aynı veya benzer örnekleri kullanıyorsanız, topshim önce rsh kullanarak okuyun. Şimdi gürültü oranı maksimum sinyal elde etmek için rga komutu ile alıcı kazanç ayarlayın.

Spektrumun merkezini su rezonans ofsetine yerleştirin ve calibo1p1 kullanarak 90 derecelik proton darbesini yüksek güçte ayarlayın. Proton spektrumunu sıfır go zg komutunu kullanarak toplayın ve efp ile işlem leyin. Buna üstel çarpma, satır genişletmeyi içeren serbest indüksiyon bozunması, FID'nin Fourier dönüşümü ve faz düzeltmesi uygulamak için pk dahildir.

Entegrasyon seçeneği olmadan polinom kullanarak otomatik faz düzeltme apk ve otomatik taban çizgisi düzeltme absn uygulayın. Deneyde SFHMQC3GPPH'yi seçerek SOFAST HMBC denemesi için yeni bir veri kümesi oluşturun. Proton spektrumundan optimize edilmiş P1 ve O1'i kopyalayın ve P1'in p1'in optimize edilmiş P1 değeri olduğu ve plw1'in P1'in güç seviyesi olduğu getprosol 1H p1 plw1 komutunu kullanarak P1'e bağımlı darbeleri doldurun. Şimdi, amide kimyasal kayması için ofset ayarlamak için CNST54 sabiti optimize edin.

Ayrıca, alıcı kazancının optimize edilmesine izin vererek spektral ilgi bölgelerini kapsayacak şekilde bant genişliğini tanımlamak için CNST555'i optimize edin. Bu parametreleri seçmek için, iki boyutlu spektrumdan ilk FID ayıklayın ve bunları tanımlamak için gözlenen sinyali arayın. Buna ek olarak, gkomutu ile kabul edilebilir sinyal hassasiyeti elde etmek için gevşeme gecikmesini, tarama sayısını ve sahte taramaları değiştirin ve veri kalitesini gerçek zamanlı olarak izlemek için gidip taramayı sağlar.

Son olarak, Zero Go zg kullanarak spektrumları kaydedin. İşlemparametrelerini, dolaylı boyutta isteğe bağlı doğrusal tahminle, spektrumun doğrudan F2 ve dolaylı F1 boyutlarıboyutuna ayarlayın. Pencere işlevi olarak QSINE'yi seçin ve iki boyutlu spektrumu işlemek için iki nin Sine çan kaydırmasını girin.

Pencere fonksiyonu ve Fourier dönüşümü ile her iki yönde verileri işlemek için xfb komutunu girin. Her iki yönde de otomatik faz düzeltmesi gerçekleştirmek için apk2d komutunu kullanın. 2B veriler için otomatik taban çizgisi düzeltme işlevi abs2 ile taban çizgisini düzeltin.

Bu işlem parametrelerinde tanımlanan ppm değerleri arasında bir polinom işlevi uygular ve daha fazla analiz için bir 2B spektrum üretecektir. Etkileşim verilerinin başka bir molekülle karşılaştırılması için seri işleme yapmayı planlıyorsanız, işlem parametrelerini wpar komutuyla saklayın ve rpar ile geri çağırın. Tepe toplama işlemini başlatmak için pp komutunu girin.

Ppm aralığını, minimum yoğunluğu ve beklenen en yüksek tepelere göre maksimum tepe sayısını tanımlayın. Ardından Tamam'ı tıklatın. Sonuçları görsel inceleme ile doğrulayın. Gerekirse, sonuçlar spektrum kalitesine göre tatmin edici olana kadar işlemi yeniden çalıştırın.

pp komutu ile bir tepe listesi oluşturun. Bu tepe listesi varsayılan olarak veri yüksekliği ve en yüksek yoğunluk bilgilerini içerir. Tepe listesi sonraki spektrumlara dışa aktarılabilir ve diğer programlar tarafından okunabilir.

Şimdi başka bir molekül ile etkileşimi gösteren kimyasal kaymalarda zirve yoğunlukları veya hareket değişiklikleri için protein HSQC spektrumları gözlemleyin. Etkileşen molekül büyükse, bazı zirvelerin kaybolması ile birlikte tepe yoğunluklarında azalmalar bekleyin. Zirveler sekmesini tıklatarak ve zirveler penceresinde sağ tıklatarak içe aktarma'yı seçerek bir sonraki veri kümesine tepe listesini aktarın.

Spektrum üzerindeki zirveleri görselleştirin ve gerekirse yeni konumlara kaydırın. Yoğunlukları içeren spektrum için bir tepe listesi oluşturmak için tam tablo için sıfırlama yoğunluklarını tıklatın. Bu tepe listesi, depolanan tepe listesindeki konum bilgilerini taşır.

Dışa Aktarma işlevini seçerek, farklı veri kümelerinden gelen tepe listelerini bir elektronik tabloya veya analiz için başka bir matematiksel programa dışa aktarın. Karmaşık spektrumdaki fonksiyon pik yoğunluğu, her tepe için protein spektrumundaki pik yoğunluk ile tepe yoğunluklarında değişimi hesaplayın. Değerler 100 ile çarpılarak yüzde değişimine dönüştürülebilir.

Tepe hacimleri de yararlı olduğunu unutmayın, ancak tepe yoğunlukları birbirine yakın konumlandırılmış zirveler için ölçmek daha kolay olsa da, nispeten geniş zirveleri yüksek yoğunluklu proteinler için genellikle olduğu gibi. N15HSQCs vahşi tip E-PRD için satın alındı, yanı sıra R1914E mutant, varlığı veya VimRod yokluğunda. Yabani tip E-PRD spektrumu iyi çözülmüş zirvelerin beklenen sayısını gösterir, düzgün katlanmış protein göstergesi.

VimRod varlığında, spektrum geniş çizgi genişletme ve pik ortadan kalkması gösterir, E-PRD ve VimRod arasında bağlayıcı karşılık. R1914E mutantının spektrumu arasında tek başına ve VimRod'in eklenmesi yle bu mutant E-PRD'ye bağlanma eksikliğini gösteren çok az değişiklik gözlenir. Burada VimRod varlığı ve yokluğunda E-PRD tepe yoğunlukları karşılaştırıldı ve E-PRD kompleksinde pik genişletme aralığı nı göstermek için göreceli tepe yoğunlukları olarak çizilmiştir.

VimRod ve E-PRD'nin bağlanmasını doğrulamak ve quantitate etmek için, Hedef olarak floresan RED-tris-NTA boya ile etiketlenmiş His6-VimRod kullanılarak MST analizi, E-PRD ligand azalan konsantrasyonları kullanılarak yapıldı. Veriler tek siteli ligand bağlama standart bir model ile uygun ve 25.7 artı veya eksi 2.1 mikromolar bir KD verdi. Bu yordamı çalışırken, aynı edinme ve işleme koşullarını kullanmayı unutmamak önemlidir.

NMR spektrumlarının toplanması için izotop etiketli protein örneklerine erişim nedeniyle mücadele edecektir. Bu tekniğin etkileri kanser, enfeksiyon veya nörodejeneratif hastalığın tedavisine doğru uzanır, çünkü hastalıkta tehlikeye atılan protein etkileşimlerinin oluşumunu içerirler.