Name: Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin farede glomerüler hücre yüzey proteinlerini biyotinle canlı etiketleme yöntemini. Böbrek hastalıklarında protein trafiklemesini in vivo analiz etmek için güvenilir bir protokoldür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Blanka Duvnjak onun olağanüstü teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 M.W. ve QU280/3-1 için IQ tarafından desteklenmiştir Sermaye sağlayıcı çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, yayımlamaya karar ve el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Fareler bir in-house cins yerel hayvan bakım tesisi veya Javier Labs Fransa olarak elde edilmiştir. İncelemeler bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı (ABD ulusal kurumları, Sağlık Yayın No 85-23, 1996 revize) için Kılavuzu'nda açıklanan yönergelere göre yapılmıştır. İlgili kurumsal onayları uygun olarak tüm hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir (eyalet hükümeti LANUV referans numarası AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. hazırlanması çözümleri, donatım ve aygıtlar
<ol><li>1 L 1 mM magnezyum klorür (MgCl2) ve 0,1 mM kalsiyum klorür (CaCl2) ile desteklenmiş fosfat tamponlu tuz hazırlamak (PBSCM) ve steril bir filtreden filtre.</li>
	<li>5 mL steril PBSCM fare başına de perfüzyon için hazırlamak ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Her fare için 5 mL steril PBSCM 0,5 mg/mL biotin ile desteklenmiş de hazırlayın.</li>
	<li>Her fare için 5 mL steril PBSCM de hazırlamak ve 0.8 x 108 manyetik boncuklar ekleme (Örn., 200 Önarıtma olmadan bir 4 x 108 boncuk/mL solüsyon µL) glomeruli embolizasyon için. Bu çözüm manyetik boncuklar özgün tüpte steril tutmak için hücre kültür tezgah altında hazırlayın. Bu çözüm buza koyun.</li>
	<li>PBSCM (fare başına 5 mL) 100 mM glisin eklenerek su verme bir çözüm hazırlamak ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bir collagenase çözüm (0,378 U/mL collagenase A steril PBSCM içinde) olun. Fare, başına 1 mL collagenase çözeltisi 2 mL tüp içine pipet ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Çamaşır için steril PBSCM hazırlamak (bkz. Adım 1.1) 50 ml tüp ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Perfüzyon için bir şırınga pompa akışı 2.0 mL/dk ile kullanın.</li>
	<li>Bir 10 mL şırınga 21 G iğne ile hazırlayın. İğne ucu bir 20-30 cm uzun kateter yerleştirin (iç çap, kimliği = 0,58 mm). Kateter bağlanmak (0,58 mm ID) 10 cm kısa kateter ile (0,28 mm ID) ve daha küçük kateter ucu eğik fare aort içine kolay bir ekleme için kesti.</li>
	<li>Ameliyat sırasında bağ yordamlar için üç 5-7 cm ipek (4-0 6-0) başına düşen iş parçacığı fare kesmek.</li>
	<li>3 cerrahi kelepçeler, 2 cerrahi makas, 2 cımbız, 2 iyi cımbız, 1 ince makas ve temizleme bezi ameliyat için hazırlayın. Anestezi (Örneğin, mayi anestezi ketamin 100 mg/kg vücut ağırlığı ve xylazine 5 mg/kg vücut ağırlığı) hazırlayın.</li>
	<li>İki böbrek glomeruli yalıtımı için bir 100 µm hücre süzgeç, iki 50 ml tüp ve bir mıknatıs alıcı kullanma.</li>
	<li>ARKADAŞLAR lizis arabellek hazırlamak: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (çocuklar); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 mM sodiumchorlide (NaCl); 50 mM sodiumfluoride (KAF); 15 mM Na4P2, O7; 0,1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; ve 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).</li>
	<li>Serin santrifüjler ile 4 ° c</li>
</ol>2. cerrahi mikroskop altında
<ol><li>Fare anestezi (Örneğin, ketamin/xylazine ile intraperitoneally, bkz: adım 1.11). Uygun anestezi doğrulamak için ayak-çimdik testi gerçekleştirin.</li>
	<li>Fare ile % 70 isopropanol ventral tarafında dezenfekte.</li>
	<li>Cilt üzerinden ortalama bir kesim için sternum leğen kemiği gerçekleştirmek ve cımbız kullanarak karın fasya cilt kaldırın. Deriyi karın ortasında her iki tarafta cerrahi makasla kesme.</li>
	<li>Cerrahi Araçlar değiştirin. Medyan kesiği karın kas katmanı yoluyla mesane xiphoid uygulamak ve bunları cımbız ve cerrahi makas kullanarak dört çeyrek daire bölmek. İki cerrahi kelepçeler ile fare boyun doğru kelepçeler ile üst iki kenara iliştirin. Not: Karın şimdi açıldı.</li>
	<li>Viseral organlar bir steril bez ile bir kenara koymak ve hepatik frenik bağ iyi makasla kesme.</li>
	<li>Bir tüp ligasyonu (ile 6-0 ipek iplik 4-0) renal arter böbreküstü bezi yüksekliğini üzerinde proksimal aort çevresinde iki iyi cımbız ile hazırlayın. Kan akımı cımbız ile kaldırılması için proksimal aort ligasyonu sıkın.</li>
	<li>Fasya, yağ ve diğer dokularda distal aort ücretsiz ve çevresinde kafatası hepatik/mezenterik arter ligasyonu iyi cerrahi Cımbız kullanarak renal arter hazırlamak.</li>
	<li>Renal arter distal aort çevresinde (ile 6-0 ipek iplik 4-0) bir ligasyonu hazırlamak ve vena kava ve aort bifurkasyon yükseklikte kelepçe.</li>
	<li>Böylece aorta yarı çapını deliktir bir küçük aort distal renal arterler delik açın. Katater aort koymak ve ile hazırlanan bağ düzeltebilirim. Dikkat: hava embolisi önlemek için perfüzyon sistemi kabarcıklar kaçının.</li>
	<li>Perfüzyon buz gibi PBSCM 2 mL/dk akış hızında başlayın.</li>
	<li>İyi cerrahi makas ile renal arter düzeyinde renal ven içine bir delik açıp ve çevresinde hepatik ve mezenterik arter ligasyonu sıkın. Not: Böbrekler perfüzyon başlattıktan sonra soluk açmalısınız.</li>
</ol>3. in Vivo Biotinylation
<ol><li>Değişim kabarcık içermeyen için buz gibi PBSCM şırınga ile 0,5 mg/mL biotin etiketleme yüzey için takıma ve böbrekler ile 2 mL/dk akış hızında 5 mL sıvı. Not: PBSCM çözümleri (50 mL tüpler çevirerekmesela ) karışımı yavaşça çözüm içindeki kabarcıklar oluşturan önlemek için. Sonra şırıngayı çözümünüzde aspirasyon, şırıngadan herhangi bir kabarcıklar veya hava tahliye edin. İlave bir kanül (21 G) şırıngayı kateter sisteme bağlı kanül boşluğu doldurmak için kullanın. Son olarak, şırınga kanül kabarcıklar olmadan kateter ile içine sopa.</li>
	<li>Şırınga kabarcık-Alerjik glomeruli gidermek ve 5 mL 2 mL/dak bir akış yönü ile sıvı buz gibi PBSCM 100 mM glisin ile desteklenmiş değiştirin.</li>
	<li>Değişim şırınga için buz gibi PBSCM bubble ücretsiz 200 μL manyetik boncuklar/mL ile desteklenmiş ve böbrekler 2 mL/dk sıvı. Not: böbrek yüzeyinde, glomeruli kahverengi manyetik boncuklar ile embolizasyon görünür hale gelir.</li>
</ol>4. Glomeruli iki böbrekler üzerinden yalıtım
<ol><li>Kapsülün sökün ve Hilus, böbrekler. Böbrekler buz 15 ml PBSCM 10 cm hücre kültür tabağına yerleştirin. Böbrekler hasat sonra servikal çıkığı anestezi altında fareyle ötenazi. Cerrahi ve perfüzyon yordamlar yaklaşık olarak 20-22 dk son.</li>
	<li>Böbrekler en küçük olası yeni bir çift-kenar bıçakla parçalara. Doku ile collagenase A 1 mL 2 mL tüp içine taşıyın (bkz. Adım 1.6) ve sindirmek için 30 dk 37 ° C'de. Önce ve sonra sindirim 1000 μL pipet kesilmiş bir karışımı yavaşça.</li>
	<li>Sindirilir doku buz gibi PBSCM kullanarak bir 100 mikron hücre süzgeç aracılığıyla durulayın. Yavaşça kalan doku yalak hücre süzgeç kıyma ve daha sonra toplam hacmi 50 mL için buz gibi PBSCM ile durulayın için hücre kazıyıcı kullanın.</li>
	<li>5 dk. süpernatant kaldırmak ve Pelet vortexing pelet ise buz gibi PBSCM biraz daha az 1,5 mL ile resuspend 4 ° C 500 x g de süspansiyon santrifüj kapasitesi. Daha sonra glomerular süspansiyon yeni 2 mL tüp içine koymak.</li>
</ol>5. çamaşır
<ol><li>Mıknatıs catcher glomeruli bir tarafa çekmek için kullanın. Glomeruli doğru mıknatıs taşındı önce 1 dakika bekleyin.</li>
	<li>2 mL tüp mıknatıs catcher kalırken süpernatant 1000 μL pipet ile kaldırın. Birinci ve ikinci yıkama sırasında (bkz. Adım 5.3), glomeruli kaybı olmaması için tüp süpernatant kalıntıları 250 μL adımları. Hızlı bir şekilde yapılar tüp altına lavabo izin kaçının bu yordamı gerçekleştirin. Not: Çamaşır yordamı Aksi takdirde uzun sürecek.</li>
	<li>2 mL tüp mıknatıs catcher kaldırmak ve PBSCM, pipet (çok önemli), o yukarı ve aşağı 1 mL ekleyin girdap.</li>
	<li>Tüp mıknatıs catcher koy ve adım 5.2 ile baştan.</li>
	<li>Glomeruli saflığı % 90 ulaşmıştır kadar çamaşır adımları yineleyin. Bunun için bir temsilci aliquot süpernatant mikroskop (40-100 X) altında inceleyin. Not: Glomeruli kahverengi manyetik boncuklar içeren yuvarlak yapıları görünür. Uzun yapılar borulu parçaları, ve ücretsiz manyetik boncuklar kahverengi yuvarlak noktalar görünür. Hücre artıkları hantal yapıları görünebilir.</li>
	<li>Saflık eriştiyseniz, glomeruli sayısı PBSCM 1 ml glomeruli çözülerek tahmin ediyoruz. Karıştırma sonra 10 μL bir aliquot al ve glomeruli mikroskop altında saymak. Glomeruli aşağıda ki formül ile sayısını hesaplayın: glomeruli son sayısı = 10 μL aliquot x 100 glomeruli sayısı.</li>
	<li>Glomeruli başarılı yalıtım 10.000-40,000 glomeruli bir dizi yol açar.</li>
</ol>6. protein çıkarma ve Immunoprecipitation (IP)
<ol><li>Santrifüjü 6800 x g 5 dakika süreyle de 4 ° C'de tarafından toplamak glomeruli süpernatant bir mıknatıs alıcı kullanırken kaldırmak ve Pelet buz gibi lizis arabellekte resuspend (Örn., 30.000 glomeruli 300 μL; Çocuklar, bakın adım 1.11). 30 için en yüksek hızda bir doku homogenizer ile örnekleri homojenize s ve onları buz 30 dk için koşullar.</li>
	<li>Santrifüjü 4 ° c için 30 dak için 15.000 x g de tarafından çözünmez malzeme çıkarmak Yeni 1,5 mL tüp içine lysate hücre içeren süpernatant pipette. Pelet atmak.</li>
	<li>Bir bicinchoninic (BCA) kullanarak protein konsantrasyonu süpernatant ölçmek-üreticinin yönergelerini takip yöntemi dayalı. 30.000 glomeruli başarılı bir lizis için 700-1000 µg/mL glomerular protein miktarını verir. Eşit protein miktarları ile lizis arabellek için ayarlayın.</li>
	<li>Bir aliquot için toplam hacminin % 10 glomerular almak lysate ve 95 ° C'de 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) kuluçka 5 min için önce Ekle</li>
	<li>IP için kalanı lysate streptavidin özel boncuk gecede 4 ° C'de üzerinde genel gider bir shaker ile kuluçkaya.</li>
	<li>Özel boncuk vasıl 1000 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırın ve belirsiz protein bağlama için boncuk yıkamayı lizis arabelleği 800 μL ekleyin.</li>
	<li>Yıkama 3 kez tekrarlayın ve süpernatant tamamen kaldırın.</li>
	<li>2 x Laemmli + DTT 30 μL ekleyin ve 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Lysate yük ve IP sonda üzerinde % 10 SDS jel ve SDS jel çalıştırmak için 30 dk 70 V, daha sonra 20 mA 1,5 h. için jel başına daha sonra leke için 2 h 200 jel nitroselüloz membran anne.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de % 5 Sığır serum albumin (BSA) ile nitroselüloz membran arabellek yıkama engelleyin.</li>
	<li>Membran antikor gecede 4 ° C'de ilgi ile kuluçkaya Bir shaker üzerinde 5 min için 3 kez arabellek yıkama ile yıkama ve membran ile Oda sıcaklığında 1 h için HRP öğesini ikincil antikor kuluçkaya. Çamaşır adımı yineleyin.</li>
	<li>Lysate görselleştirmek ve immunoprecipitation membran üzerinde bir CCD fotoğraf makinesi ile süper çözünürlük chemiluminescent Aracısı kullanarak sondalar.</li>
</ol>

<ol><li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+biology+for+the+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li>
<li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513(2016).</li>
<li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li>
<li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemitry%22%5BJournal%5D)">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li>
<li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).</li>
<li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li>
<li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dynamin%2C+synaptojanin%2C+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li>
<li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li>
<li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte%3A+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).</li>
<li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li>
<li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li>
<li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).</li>
<li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li>
<li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium%3A+biology+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li>
<li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li>
<li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+glomeruli+from+mice%3A+A+practical+approach+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li>
<li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).</li>
<li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li>
<li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li>
<li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li>
<li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).</li>
<li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan Yöntem glomerular RNA veya protein araştırmak için glomeruli başarılı yalıtım sağlar. Buna ek olarak, birincil glomerular hücre kültürlerinde izole glomeruli gerçekleştirilir. Biotin glomerular yalıtım daha önce uyguladıysanız, glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme gerçekleştirilebilir. Bu yöntemle vivo içinde glomerular hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu ve protein bereket yarı Nefelometri mümkündür. Başarıyla glomerular hücre yüzey proteini bereket testleri için en kritik 1 adımlardır) far...

Proteinüri glomerular yaralanma özelliğidir ve genellikle glomerular filtre1bozulma eşlik eder. Glomerular filtre Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes oluşur. Glomerular filtre hassas moleküler yapısını son derece dinamik hücre yüzey protein hem sağlıklı ve hastalıklı böbrekler2,3,4,5' te,6 kaçakçılığı olup . Endositoz hücre yüzey proteinlerin podocytes7yaşam için temel olarak gösterilmiştir. Nephrin ve podocalyxin podocytes ifade edilen transmembran proteinler vardır. Podocalyxin bir sialoglycoprotein podocytes8,9,10ikincil ayak süreçlerinin kaplama ise Nephrin glomerular yarık diyafram belkemiğidir. Endositik kaçakçılığı daha önce nephrin podocalyxin3,11,12,13,ve14için gösterilmiştir.
Bizim bilgi en iyi şekilde, endositoz hücre yüzey proteinlerin henüz literatürde glomerular endotel hücrelerinde tarif edilmiştir değil. Ancak, endotel hücreleri genel olarak tüm gerekli proteinler endositoz (Yani, clathrin bağımlı, Sal-bağımlı endositoz)15,16farklı türleri için hızlı. Bu nedenle, endotel hücre yüzey kaçakçılığı, örneğin, vasküler endotel (VE) kullanarak bu yöntemle ele-cadherin ve hücre içi adezyon molekülü (ICAM-2) bir hücre olarak yüzey glomerular endotel hücreleri17 için işaretleyici protein .
Ne yazık ki, hiçbir doğru vitro modeli hangi hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu olabilir hassas üç katmanlı glomerular filtresi vardır. Böylece bu yöntemin hedeftir glomerular protein kaçakçılığı vivo içindeçalışmaya. Ayrıca, bu iletişim kuralını glomeruli, daha da glomerular RNA, proteinler veya hücre Analizi etkinleştirme izole konularında bilgi sağlar. Farklı tarafından açıklanan teknikleri benzer glomerular yalıtım18,19gruplandırır.
Daha önce biz ve diğerleri ex vivo glomerular hücre yüzey proteinlerin biotinylation2,3,4,20,21tarafından etiketleme kullandık. Ancak, bu ex vivo yöntemde, izole glomeruli endositik ticareti etkileyebilecek mekanik stres maruz bırakıldı. Alternatif olarak, glomerular hücre yüzey proteinlerin ayirt etiketleme kapsamlı edebiyat2,20,22yılında kullanılmıştır. Bu yöntemle ancak, az sayıda protein bir slayt içinde analiz edilebilir ve Nefelometri ayirt görüntülerin genellikle zordur.
Bu roman vivo Yöntem glomerular hücre yüzey proteini bolluk ve kaçakçılığı doğru içinde sağlıklı ve hastalıklı böbrekler çalışmaya güvenilir bir aracı sunuyor ve ek olarak ayirt testleri kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td> Fare cerrahisi için <td>Motic</td><td>SMZ168BL</td><td>mikroskobu</td></tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Pulch ve Lorenz mikroskobu</td><td>150500</td><td>fare cerrahisi için ışık</td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) %2</td> <td>Bayer</td><td>PZN:01320422</td><td>anestezi</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>ince makas, aort içine kesmek için</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, karın</td><td>kesimi için</td>Aesculap <td>BC210R</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, karın</td><td>açılana kadar ameliyat için</td>Aesculap <td>BD215R</td></tr><tr><td>Pr&auml; ameliyat için parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>IC108000</td><td>ipek iplik</td></tr><tr><td>Ketamin %10</td> <td>Medistar</td><td></td><td>anestezi</td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) %2</td> <td>Bayer</td><td></td><td>anestezi</td></tr><tr><td>İnce Delikli Polietilen Boru ID 0.28mm OD 0.61mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>Kateter</td></tr><tr><td>İnce Delikli Polietilen Boru ID 0.58mm OD 0.96mm</td><td>Portex</td><td>800/100/200</td><td>Kateter</td></tr><tr><td>Harvard aparatı 11 Plus</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-2209</td><td>şırınga pompası</td></tr><tr><td>EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>biotin</td></tr><tr><td>Dynabeads El değmemiş Fare T-hücreleri</td><td>Glomerülleri embolize etmek için</td><td>Invitrogen</td><td>11413D</td></tr><tr><td>Kollajen Böbrek</td><td>dokusunu sindirmek için</td>bir <td>Roche</td><td>10103578001</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>123.21D</td><td>Mıknatıs yakalayıcı</td></tr><tr><td>100 & glomerüler izolasyon için m hücreli boyayıcı</td><td>Greiner-bio</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 40 CFL</td><td>Zeiss,</td><td>glomerüler saflığı doğrulamak için</td><td>kullanılamaz</td></tr><tr><td>DokuRuptor</td><td>Quiagen</td><td>9002755</td><td>Doku homojenizatörü</td></tr><tr><td>lizis tamponu için</td><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td></tr><tr><td>lizis tamponu</td><td></td><td></td><td></td> için Tris-HCL Sigma-Aldrich T5941</tr><tr><td>Lizis tamponu için</td> <td>NaCl</td><td>VWR kimyasalları</td><td>27810295</td></tr><tr><td>Lizis tamponu için</td><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td></tr><tr><td>Lizis tamponu için</td><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td></tr><tr><td>Lizis tamponu için</td><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test</td><td>Kiti Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Üreticinin talimatlarına uyun</td></tr><tr><td>nefrin antikoru</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>westernblot</td></tr><tr><td>Poliklonal keçi anti-podokaliksin antikoru</td><td>için R& D Systems</td><td>AF15556-SP</td><td>westernblot için</td></tr><tr><td>Streptavidin Agaroz Reçine</td><td>Thermo Scientific</td><td>20347</td><td>immünopresipitasyon için</td></tr><tr><td>Protein A sefaroz CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17096303</td><td>immünopresipitasyon</td></tr><tr><td>poliklonal tavşan anti-p57 antikoru</td><td>İmmünohistokimya için</td><td>SCBT</td><td>SC-8298</td></tr><tr><td>fare monoklonal anti-beta aktin antikoru, klon AC-74</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td>Western blot yükleme kontrolü</td></tr><tr><td>tavşan anti-p44 / 42</td><td>hücre sinyalizasyonu</td><td>4695</td><td>westernblot</td></tr><tr><td>Pierce için yüksek hassasiyetli streptavidin-HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>21130</td><td>westernblot</td></tr><tr><td>poliklonal fare ICAM-2 antikoru</td><td>için R& </td><td></td><td>Westernblot poliklonal</td></tr><tr><td>fare anti-VE-cadherin</td><td>R& için D Sistemleri AF774 </td><td>Westernblot için</td> D Systems <td>AF1002</td></tr></tbody></table>

yalıtım glomeruli ve glomerular hücre yüzey proteinleri vivo etiketleme

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinüri Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes onların yarık zarlar ile oluşan glomerular filtre bozulma oluşur. Glomerular filtre, özellikle yarık diyafram, narin yapısı farklı hücre yüzey proteinleri etkileşimi üzerinde dayanır. Bu hücre yüzey proteinleri eğitim defa vitro çalışmalar veya histolojik analiz için sınırlı olmuştur. Burada, glomerular hücre yüzey proteinleri fizyolojik ve etyopatogenezi koşullar altında çalışma sağlayan yöntem, etiketleme bir fare içinde vivo biotinylation mevcut. Bu iletişim kuralı fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi bir proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirme hakkında bilgi içerir. Yarı Nefelometri glomerular hücre yüzey bereket hazır bu roman yöntemi ve tüm proteinler biotin perfüzyon için erişilebilir olduğunu ve immunoprecipitation okudu. Buna ek olarak, izolasyon-in glomeruli ya da biotinylation olmadan daha fazla çözümleme glomerular RNA ve protein hem de birincil glomerular hücre kültürü (Yani, birincil podocyte hücre kültürü) sağlar.

Glomeruli doğru bir şekilde ayırmak için fare böbrekler PBSCM ile ilk sıvı gereklidir. PBSCM ile perfüzyon böbrekler soluk (Şekil 1A) döner. Glomeruli manyetik boncuklar ile embolizasyon (Şekil 1B) böbrek yüzeyinde kahverengi noktalar olarak görünür. Glomeruli yalıtım mıknatıs catcher ile kirlenme böbrek tubuli (Şekil 1C...

Burada fare vivo biotin ile glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu protokolü nasıl fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirmek yönergeler içerir.

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Bu yöntem, nefroloji alanındaki hücre yüzeyproteininin proteinürik böbrek hastalığında değil, proteinürik tespüleden rolü ile ilgili anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, hücre yüzeyi protein ihyasının in-vivo çalışmasını kolaylaştırması ve deney başına birden fazla proteinin analiz edilebilmiş olmasıdır. Bu yöntem glomerüler hücre yüzeyi ticareti hakkında bilgi sağlasa da, izolasyon teknikleri ile perfüzyona sahip ve erişilebilen diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.Parmak ucuna yanıt eksikliğini onaylayarak ve anestezili farenin ventral tarafını %70 izopropil ile dezenfekte ederek başlayın. Sternum pelvis deri ile bir medyan kesim yapmak ve karın fasya deri kaldırmak için cımbız kullanın. Karın orta hattının her iki tarafında deri kesin ve ksifoid için mesane karın kas tabakası ile bir orta yapmak.Kasları dört çeyreğe bölmek için makas ve forceps kullanın ve hayvanların boynuna doğru üst iki kadranda güvenli iki cerrahi kelepçe kullanın. Bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan yerleştirin ve visseral organları bir kenara taşımak için steril bir takas kullanın. Ince makas kullanarak, hepatik frenik bağ kesti.Ince cerrahi cımbız

isolation-glomeruli-vivo-labeling-glomerular-cell-surface

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, fare böbreklerinden sağlam glomerülleri izole etme yöntemi açıklanmaktadır. Bu şekilde elde edilen kapsüllenmiş ve kapsüllenmiş glomerüller, murin böbreğinden parietal epitel hücre büyümelerini kültürlemek için de kullanılabilir.

Glomerül İzolasyonu: Murin Böbrek'ten Sağlam Glomerül Elde Etme Tekniği

Bu videoda, fare bağırsağının submukoza ve lamina propriasından enterik glial hücrelerin izole edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Submukoza ve lamina propria dokusunun çıkarılması, enterik glial hücrelerin bunlardan izole edilmesi ve bir enterik glial hücre kültürü oluşturmak için hücrelerin kaplanmış bir kuyu plakası üzerinde kültürlenmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Bir farenin submukoza ve lamina propriasından enterik glial hücrelerin izole edilmesi

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Gömme sonrası immünogold yöntemi, spesifik moleküllerin hücre altı lokalizasyonunun yüksek çözünürlüklü analizlerini sağlamanın en etkili yollarından biridir. Burada, retinal şerit sinapslarında glutamat reseptörlerini kantitatif olarak analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Bu protokol ana odak verimli bir şekilde uygun birincil glomeruli kültürlerin çeşitli aşağı akım uygulamaları kullanmak için en az kirletici maddeleri ile izole etmektir. İzole glomeruli bileşeni hücre tipleri arasındaki yapısal ilişkileri korumak ve kültürlü ex vivo kısa bir süre için olabilir.

Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Makalede, termolabil simian virüsü 40'ı eksprese eden transgenik farelerin böbreklerinden şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin izole edilmesi ve foto-aktive edilebilir mitokondri, PhAMeksize edilmesi yöntemi açıklanmaktadır. Boncuklar, sindirim adımları, tohumlama ve GEC-CD31 pozitifin kültürlenmesi kullanılarak tüm böbreklerden glomerül izolasyonu prosedürünü açıklıyoruz.

Şartlı Ölümsüzleştirilmiş Fare Glomerüler Endotel Hücrelerinin Floresan Mitokondri ile İzolasyonu

Bu çalışma, CUBIC temizlenmiş fare böbreklerinden glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için kullanımı kolay, eksiksiz ve basit bir dizi yöntem sunmaktadır. Glomerulus sayısı ve hacmi gibi veriler, floresein izotiyosiyanat (FITC)-Dekstran, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) veya yaygın konfokal mikroskopi ve Imaris gibi yazılımlar kullanılarak kolay ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

Fare Glomerüllerini Etiketlemek ve Analiz Etmek için Etkili ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Öğrenin farede glomerüler hücre yüzey proteinlerini biyotinle canlı etiketleme yöntemini. Böbrek hastalıklarında protein trafiklemesini in vivo analiz etmek için güvenilir bir protokoldür.

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Daha fazla video keşfet