Name: Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Öğrenin Schrenkiella parvula için çiçek daldırma yöntemiyle Agrobacterium aracılı dönüşüm protokolünü. Bu teknik, ekstremofit bitkilerin tuz stresine adaptasyon mekanizmalarını ve Arabidopsis thaliana ile karşılaştırmalı genomik çalışmaları mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bir Ulusal Bilim Vakfı Ödülü MCB 1616827 tarafından desteklenmiştir.

1. bitki büyüme
<ol><li>
Tohum sterilizasyon (isteğe bağlı)
	<ol>
<li>1 çift-distile su (GKD2O) % 50 çamaşır suyu hazırlamak veya 2 damla non-iyonik bir deterjan ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL tüp içinde. Tüp birkaç kez çözüm karıştırmak için tersine çevirin. Not: Tohum sterilizasyon 15dk için bir UV steril yüzey ile kabine laminar akışı yapmak için tercih edilir.</li>
		<li>Çamaşır suyu çözüm ~ 100-200'e ekleyin S. parvula tohumları bir 1,5 mL tüp. İyice karıştırın ve 5 min için oturup tüp izin.</li>
		<li>Çamaşır suyu tüm tüpünden kaldırın ve % 70 etanol ekleyin. Birkaç kez pipetting tarafından tohum yıkama ve etanol çözüm hemen kaldırın.</li>
		<li>Fazla çamaşır suyu ve etanol kaldırmak için steril su içinde tohum yıkayın, sonra su kaldırın. Bu 5-6 kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tohum stratifikasyon
	<ol>
<li>Steril su içinde tohum bırakın ve 5-7 gün 4 ° C'de depolayın Alternatif olarak, doğrudan ıslak toprak üzerinde kurutulmuş unsterilized tohumları ekmek ve toprak tepsi 4 ° C'de 5-7 gün boyunca yer</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Büyüyen bitkiler dönüşümünün hazırlık
	<ol>
<li>Toprak ( Tablo malzemelerigörmek) 7 x 6 cm2 tencere karıştırmak, tencere suda ıslatın ve sprey su düzgün ıslak büyüme ortamı sağlamak için üst dolgu. (Bkz. Tablo reçetesi) 5-gübre boncuk her pot toprak yüzeyinde ekleyin. Not: Bildiğim kadarıyla biz yaşamış gibi S. parvula A. thaliana büyüdüğü yerde de herhangi bir toprak karışımı üzerinde büyür.</li>
		<li>Islak bir kürdan kullanarak transfer 20 ~ 25 tohum toprak yüzeyinin pot başına. Not: 4-5 tohum toplu dört köşe pot (Şekil 1, gün 15, sol panelde) ortasına koyup uygun bir uygulamadır.</li>
		<li>Pot tepsi tohum çimlenme sırasında altında yüksek nem tutmak için açık bir kubbe ile kapak.</li>
		<li>Bitki tepsileri 130 µmol m−2 s– 1 ışık, 22-24 ° C sıcaklık ve gece döngüsü başına gün/10 h başına 14 h ayarlamak bir ışık şiddeti ile bir büyüme odasında tutun. Kubbeleri 7-10 gün sonra çimlenme kaldırın. Düzgün bir arzu edilen düzeyde nemlendirilmiş toprak tutmak için tepsi altından su ekleyin.</li>
		<li>İlave fidan ot ve de (Şekil 1, gün 15, doğru kapı aynası) birbirinden pot başına sadece 4-5 sağlıklı fide bırakın.</li>
		<li>Yavaşça iki günde bitkiler su ve 0.2 x Hoagland'ın çözüm16 ile iki haftada döller. Not: Toprak nemi Tekdüzen bir düzeyde tutmak anahtarıdır S. parvula sürekli ve sağlıklı büyüyen.</li>
		<li>8-10 hafta kadar birden fazla çiçek bitki (Şekil 1, gün 60-80) başına 100-150 çiçek tomurcukları üretmek için bitkileri büyümeye devam ediyor. Daldırma çiçek tabanlı dönüştürme (adım 4.5) için planlanan günde tüm olgun ve gelişmekte olan siliques bitkilerden kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bitki dönüşümü için bir vektör faiz gen/genomik unsuru klonlama
<ol><li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)17 ve izole bir jel çıkarma kullanarak PCR ürünü kiti ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak hedef DNA parçası yükseltmek göre kit Protokolü veya özel jel kullanarak DNA arındırmak için uygun başka yöntemi Elektroforez17,18. Sanger sıralama19yoluyla izole PCR ürün sırasını doğrulayın.</li>
	<li>İstenen PCR ürünü klonlama vektör ve yetkili E. coli içine klonlanmış yapı hücreleri bir klonlama topoizomeraz tabanlı kullanarak dönüşüm kiti ( Tablo malzemelerigörmek) klon üreticisinin yönergeleri izleyerek.</li>
	<li>Luria-Bertani20 (LB) agar bakteriyel büyüme medya (Tablo 1) uygun antibiyotiklerle dönüştürülmüş ürünlerin 50 µL yayılmış örneğin., 50 µg / mL spektinomisin (bkz. Tablo reçetesi) ve 37 ° kuluçkaya C gecede.</li>
	<li>Ertesi gün, 5-10 tek kolonileri seçin, uygun antibiyotikler ile sıvı LB orta içine aşılamak ve nazik 37 ° C'de gecede sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>Plazmid yalıtım kullanarak ayrı tut moduyla plazmid ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve Sanger sıralama19 arası 2.1 güçlendirilmiş hedef sıra düzgün kopyalanmış olup olmadığını doğrulayın.</li>
	<li>Klonlanmış ve doğrulanmış PCR ürünü aktarım bitki dönüşüm rekombinasyon tabanlı ( Tablo malzemelerigörmek) klonlama ile uyumlu bir hedef vector öğesine (bakınız Tablo malzemeler), aşağıdaki kit recombinase enzim karışımı kullanarak seti üreticisinin yönerge. 2.3 adımından için 2.5 yalıtmak ve uygun plazmid yapılarını barındıran klonlar doğrulamak için adımları yineleyin.</li>
</ol>3. vektör oluşturmak için bitki dönüşüm Agrobacterium tumefaciens dönüştürme
<ol><li>A. tumefaciens zorlanma GV3101:pMP90RK21rifampisin direnç geni kromozom arka plan seçimi için limanlar, vektör yapı üzerinden 2,6 plazmid dönüştürün. Uygun antibiyotik, örneğin viomisin veya sefaloridin kullanın (bkz. Tablo reçetesi) bitki seçimi için dönüşüm oluşturmak (Ti plazmid). A. tumefaciens dönüşüm Elektroporasyon ile kısa bir protokol Bölüm 3.2 dahildir.</li>
	<li>
A. tumefaciens dönüştürme Elektroporasyon tarafından
	<ol>
<li>A. tumefaciens yetkili hücreleri22 tarihinde buz çözme. Mix 0.1-1 µg 2.6 hazırlanan plazmid, çözünmüş 1 – 2 µL GKD2O, buz üzerinde yetkili hücrelerle içinde. Karışımı bir Elektroporasyon küvet aktarmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Elektroporasyon plazmit ve yetkili bir electroporator kullanarak 3.2.1, hücrelerden karışımı gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) üreticinin yönergeleri izleyerek. Not: Küvet yüzeyini Elektroporasyon başlamadan önce temizlemek.</li>
		<li>Tepki karışımı küvet 1.5 mL sıvı LB de içerir bir microcentrifuge tüp transferi ve de pipetting ile karıştırın ve nazik sallayarak ile 28 ° c 1 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bölüm 3.2 uygun seçimi antibiyotik içeren LB tabaklarda gelen dönüştürülmüş A. tumefaciens aşılamak (örneğin sefaloridin 25 µg / mL, spektinomisin 50 µg / mL, viomisin 25 µg / mL ve rifampisin 50 µg / mL) ve 28 ° C'de 3 gün kuluçkaya.</li>
</ol>4. Agrobacterium aracılı dönüşümü S. parvula
<ol><li>Dönüştürülmüş tek aşılamak kolonileri 10 mL LB sıvı medya antibiyotik (3,3 ile aynıdır) içeren bir steril 50 mL konik kalıplara gelen tüp ( Tablo malzemelerigörmek). Titreyen bir kuluçka 24 h için kuluçkaya ( Tablo malzemelerigörmek), 250 r.p.m. 28 ° C'de</li>
	<li>Bakteriyel çözüm 3.4.1 bir steril 250 mL şişe transfer LB sıvı ortam uygun antibiyotikler ile 40 mL ekleyin ve 600 nm dalga boyu (OD600), optik yoğunluk yaklaşık 2.0 ulaşıncaya kadar 12 h kuluçkaya.</li>
	<li>A. tumefaciens cultureat 3100 x g 10 dk. Kaldır süpernatant santrifüj kapasitesi ve bakteri kültürü 40 mL A. tumefaciens infiltrasyon çözeltisi (Tablo 1) yeniden askıya alma.</li>
	<li>İnfiltrasyon çözüm 0,8 son OD600 ile resuspended A. tumefaciens sulandırmak. Yüzey aktif çözüm (Tablo 1) 25 µL seyreltilmiş A. tumefaciens 50 mL için eklemek çözüm ve mix tarafından birkaç kez ters çevirme.</li>
	<li>Önümüzdeki Bölüm 4.4 20 s. kullanım taze bir bakteriyel çözüm için önümüzdeki altı tencere üzerinden daldırma sonra hazırlanan A. tumefaciens solüsyona bitkilerin daldırma. Tüm çiçekler ile temas çözüm olduğundan emin olun. Damlalıklı bakteriyel çözümler üzerine doğrudan çözüm içine daldırma olamaz Eğer önümüzdeki alt kısmında bulunan çiçekler. Not: İlk turda dönüştürme için bir keskin neşter veya küçük makas kullanılarak tüm olgun ve gelişmekte olan siliques kaldırdığınızdan emin olun. Siliques ikinci kez dönüşüm gerçekleştirmek Eğer kaldırmaz.</li>
</ol>5. sonrası dönüşüm tesisi bakım ve ikinci dönüştürme
<ol><li>Daldırma çiçek bitki bitkiler kapak ve karanlık büyüme Oda 1-2 gün için yer için kubbe ile temiz kasetlerine yatay olarak yerleştirin. Not: Çiçekler yüksek oranda nem içeren altında tutmak (Şekil 1, bitkiler dönüştürme sonra) Bu aşamada önemlidir.</li>
	<li>Bitkiler bir dik konuma getirin ve 14 h gün/gece döngüsü, 130 µmol m-2 s-1 ışık şiddeti ve 22-24 ° C sıcaklık s 10 günlük bir büyüme Oda bitkiler aktarmak.</li>
	<li>Daldırma galvaniz çiçeklenme aşağıdaki hafta izleyin. Çok sayıda çiçek (Şekil 2) iptal olursa, çiçek DIP (adım 4) yaklaşık 4 hafta sonra veya çok sayıda çiçekler yeni geliştirdik sonra tekrarlayın. Not: İlk dönüştürme (adım 1.3.7) hazırlık adımda farklı olarak, önceden var olan veya siliques (Şekil 2) geliştirme dönüştürme ikinci turdan önce kaldırmayın.</li>
	<li>Tohumları olgun ve tohum ~ 21 haftalıkken hasat kadar bitkiler büyümek.</li>
	<li>İle hava geçirmez bir kap içinde oda sıcaklığında 2-3 hafta için kuru tohumlar ( Tablo malzemelerigörmek) Nem Çekiciler ile dolu.</li>
</ol>6. pozitif Transformants yelpazesi
<ol><li>Vahşi türü tohumları 1.2-1,3 adımda açıklandığı gibi bitki T1 tohumları.</li>
	<li>İlk 2 gerçek yaprakları geliştirmek, yaklaşık 10 – 14 gün sonra çimlenme kadar bitkiler büyümek.</li>
	<li>
İlk seçim herbisit direnç (Şekil 3A ve 3B) ayrıntılı olarak aşağıdaki gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Glufosinate-amonyum (% 11,3) herbisit (veya BASTA) seyreltik (Tablo 1) 1:1,000 (v/v) için. Sprey seyreltilmiş BASTA çözüm üzerinde fidan ve kubbeler bitkilerle gecede kapsar.</li>
		<li>2-3 kat püskürtme BASTA tekrar her 5-7 gün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aşağıda ayrıntılı olarak BASTA bırak testi kullanılarak ikinci seçim yapın.
	<ol>
<li>3-4 kez BASTA çözüm püskürtme sonra hayatta bitkiler tanımlayın. Başka bir 2-3 3-5 yaprakları nispeten geniş bir yüzey alanı geliştirmek kadar hafta bitkiler büyümek.</li>
		<li>Bitki başına en büyük Olgun yaprak seçin, balmumu katman kaldırmak için hafifçe parmak ile yaprak yüzeyine ovmak ve bir damla seyreltik BASTA çözüm (Kimden adım 6.3.1) yerleştirin. Not: BASTA damla ile yakın kök üzerinde bir kâğıt şerit yerleştirerek uygulanan yaprak konumunu işaretleyin.</li>
		<li>Bir hafta kadar solan belirtileri BASTA damla ile uygulanan yaprakları izlemek. Yaprakları BASTA damla tarafından etkilenmemiş bitkilerle seçin. Not: Hatta BASTA çözüm damla (Şekil 3Ckadar) kuruduktan sonra true-mutlak yapraklarından bozulmamış ise iki gün içinde wilt için en yanlış pozitif bitki yapraklarından başlatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pozitif transformants genomik PCR kullanarak doğrulayın.
	<ol>
<li>Adım 6.4.5, hayatta kalan bitkilerden 2-3 yaprak toplamak.</li>
		<li>Genomik DNA CTAB yöntemi23 veya başka uygun DNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak yapraklarından ayıklayın.</li>
		<li>PCR hedef bitkiler, vahşi-türü bitkisi (olarak negatif denetimleri) ve plazmid yapı adım 3.1 ayıklanan genomik DNA örnekleri (pozitif bir denetim olarak) kullanarak gerçekleştirin. Örneğin PCR astar için seçici marker gen, belirli uygun bir çift kullanmak, BASTA dirençli gen (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (ileriye doğru) ve GTCAACCACTACATCGAGACAA (tersi) için.<ol>
<li>Örnek PCR astar için bar gen hedeflemeyi kullanın aşağıdaki PCR koşullar: 30 98 ° C'de ilk denatürasyon adım s; 30 98 ° C'de denaturing 30 döngüleri ardından 30 59 ° C'de tavlama s, s ve 30 72 ° C'de uzanan s; ve 5 min için 72 ° C'de son uzantısı. Not: Tüm T-DNA ekleme emin olmak için aynı zamanda genomik PCR PCR astar seçici marker gen üzerinden kullanarak yapmak tavsiye ve başka bir PCR astar için hedef sıra belirli bitki dönüşüm vektör adımda klonlanmış</li>
		</ol>
</li>
		<li>Özel jel elektroforez17 hedef örnekleri (Şekil 4A) yanı sıra izole PCR ürünü19 kullanarak sıralama tarafından güçlendirilmiş bar PCR ürünü beklenen boyutu varlığını doğrulamak aynı prosedürü adım 2.1 olduğu gibi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21822265">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li>
<li>Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+extreme%3A+lessons+from+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241(2012).</li>
<li>Whited, J. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(15)01125-3.pdf">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li>
<li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012381466100002X">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li>
<li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+extremophile+crucifers%3A+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166(2012).</li>
<li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+evolution%3A+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li>
<li>Oh, D. -H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li>
<li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li>
<li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+%28Thellungiella+parvula%29+under+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li>
<li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="https://www.journals.uchicago.edu/doi/10.1086/338825">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li>
<li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20409266">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/2769">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028(2013).</li>
<li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/251150135_Transformation_Technology_in_the_Brassicaceae">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/watercultureme3450hoag">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li>
<li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/271968">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14888646">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li>
<li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-011-0511-8_4">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/abstract/med/22484681">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li>
<li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li>
<li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li>
<li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://gcirc.org/fileadmin/documents/Proceedings/IRCWuhan2007vol2/Biotechnology/45-49.pdf">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li>
<li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/ijb/article/view/4778">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127(2010).</li>
<li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li>
<li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+lines%3A+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bitkinin fizyolojik devlet dönüştürme25verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Sağlıklı ve dinç bitkilerin kullanımı için dönüştürme başarılı dönüşüm içinde S. parvulaiçin anahtar bir gereksinimdir. Su veya hafif stresli bitkiler sağlıklı bitkiler için dönüşüm (Şekil 1, merkezi panel) ideal kıyasla daha az çiçek olacak. S. parvula hafif yoğunlukta büyüyebilir daha az 130 µmol m-2 s-1ama bitkiler frailer; olma eğilimi tür bitkiler i...

Bu protokol için büyüme ve extremophyte model Schrenkiella parvulaiçin kararlı transgenik hatları kurulması açıklanmaktadır. Verimli dönüştürme sistemin herhangi bir çok yönlü genetik model damgasını olduğunu. Aşırı ortamlarda gelişirler bitkiler extremophytes, kritik bir kaynak sağlamak bitki uyarlamaları için çevresel stresleri anlamak için kabul edilir. Schrenkiella parvula (eski adıyla Thellungiella parvula ve Eutrema parvulum) genomik kaynakları1,2,3,4,5genişletilmesi ile böyle bir extremophyte model, olduğunu. Ancak, dönüşüm protokolleri henüz S. parvula için yayınlanmış çalışmalarda bildirilmiştir değil.
S. parvula genom Turpgiller (hardal-lahana aile) ilk yayımlanan extremophyte genom olup geniş bir genel genom synteny sigara extremophyte modeli, Arabidopsis thaliana1ile gösterir. Böylece, A. thaliana ve S. parvula arasında karşılaştırmalı çalışmalar genetik çalışmalar parvula S. genom nasıl gelişti ve düzenlenmiş bilgilendirici hipotezler yapmak A. thaliana üzerinde gerçekleştirilen zenginliği yarar farklı şekilde başa çıkmak için5,6,7aşırı çevre vurguluyor. S. parvula (toprak NaCl LD50 dayalı) tuz en dayanıklı türlerin bilinen yabani akrabaları arasında A. thaliana8biridir. Ek olarak NaCl hoşgörü, S. parvula ve hayatta yüksek konsantrasyonlarda toksik çoğu bitkiler7' ye birden çok tuz iyonları huzurunda ömrünü tamamlayan. Abiyotik stres doğal tabiatında yaygın yanıt olarak, çeşitli özellikleri, aralarında birkaç biyokimyasal ya da fizyolojik düzey 8,9,10okudu gelmifltir, 11.
2010 yılından bu yana, S. parvula bir hedef tür olarak ya bir karşılaştırma ile diğer bitki genom kullanılan 400'den fazla eş-reveiwed yayınları olmuştur. Ancak, açık bir performans sorunu ne tür çalışmalar yürütülen bir daha yakından bakmak ile belirlenmiştir. Bu raporlar çoğunluğu S. parvula potansiyelini kullanmak gelecek çalışmalarda tartışmak veya karşılaştırmalı genomik veya phylogenomic çalışmalar kullanın. Bir kanıtı-of-concept dönüştürme iletişim kuralı olmaması nedeniyle kurulan S. parvulaiçin o değil kullanılan en yüksek kalite bitki genom bugüne kadar mevcut biri olmasına rağmen fonksiyonel genomik çalışmalar (> 5 Mb dokunma N50) toplandı ve kromozom düzeyi pseudomolecules1açıklamalı.
Agrobacterium aracılı daldırma çiçek dönüşüm yöntemi A. thalianaiçinde trasngenic satırları oluşturmak için en geniş kullanılan yöntem haline gelmiştir ve dönüşümünün bir tekrarlanabilir sisteminin geliştirilmesi başarısını kritik bir faktör oldu bir genetik model12,13. Ancak, tüm turpgiller türler başarıyla A. thalianaiçin geliştirilen çiçek daldırma yöntemiyle dönüştürülmesi için gösterilmiştir. Özel olarak, S. parvula dahil turpgiller Lineage II tür çiçek daldırma tabanlı dönüştürme yöntemleri14,15' e inatçı oldu.
S. parvuladar yaprak morfolojisi ile kombine, belirsiz çiçekli büyüme alışkanlığı zorlu standart Agrobacterium aracılı daldırma çiçek dönüşüm yöntemi benimsemeye yaptı. Bu çalışmada, S. parvulatekrarlanabilir dönüşüm için geliştirdiğimiz değiştirilmiş Protokolü rapor.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Bacto Agar Ssatış Maddesi, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>B5 vitaminleri</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg' s Vitamin Çözeltisi</td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>WA Hammond Drierite, Xenia, OH</td><td>22005</td><td>Gösterge DRIERITE 6 mesh</td></tr><tr><td>Bitki dönüşümü için hedef vektör</td><td>TAIR</td><td>Vektör:6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>Elektroporasyon küveti, yuvarlak kapak, 0,2 cm boşluk</td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>BIO-RAD Laboratuvarları, Hercules, CA</td><td>1652100</td><td>MicroPulser Elektroporatör</td></tr><tr><td>Gübre boncukları</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N/A</td><td>Osmocote Akıllı Salımlı Bitki Beması&nbsp; Çiçek & Bitkisel</td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti</td><td>iNtRON Biyoteknoloji, Boston, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin Toplam parça DNA saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Gentamisin sülfat</td></tr><tr><td>Glufosinat-amonyum (% 11.3) herbisit (BASTA)</td> <td>Bayer çevre bilimi, Montvale, NJ</td><td>N/A</td><td>FINALE herbisit</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>VWR Uluslararası, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Kanamisin monosülfat</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublin, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES, Serbest Asit</td></tr><tr><td>MS tuzu</td><td>MP Biyomedikal, Santa Anna, CA</td><td>092621822</td><td>Hoagland'ın modifiye edilmiş bazal tuz karışımı</td></tr><tr><td>N6-benzilaminopurin (BA) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B3274</td><td>6-Benzilaminopurin çözeltisi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Alrich</td><td>S7653</td><td>Sodyum klorür</td></tr><tr><td>İyonik olmayan deterjan</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>Plazmid izolasyon kiti</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>Zyppy Plazmid Kitleri</td></tr><tr><td>Rekombinaz enzim karışım kiti</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>11791-020</td><td>Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim karışımı</td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Rifampisin, toz, 
&#8805; % 97 (HPLC)</td></tr> <tr><td>Çalkalama kuvözü</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 Tezgah Üstü Orbital Çalkalayıcılar</td></tr><tr><td>Toprak karışımı</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 Yetiştirici Karışımı</td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>VWR Uluslararası, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>Steril 50 mL konik tüpler</td><td>ABD Bilimsel, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>50 mL konik vidalı kapaklı tüpler, kopolimer, raflar, steril</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>Sükroz, ACS</td></tr><tr><td>Yüzey aktif madde çözeltisi</td><td>Lehle tohumları, Yuvarlak Kaya, TX</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>Topoizomeraz bazlı klonlama kiti</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>pENTR/D-TOPO Klonlama Kiti, Tek Çekim TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>VWR Uluslararası, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Tripton, BD Biosciences</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>VWR Uluslararası, Radnor, PA</td><td>90000-722 & nbsp;</td><td>BD Bacto Maya Özü, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

bitki büyüme ve floral daldırma dönüşümün agrobacterium aracılı extremophyte schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula bir extremophyte birden fazla iyon toksisite gerilmeler de dahil olmak üzere çeşitli abiyotik stres için adapte olduğunu. Rağmen yüksek kaliteli genomik kaynakları kullanılabilir nasıl bitkiler için çevre uyum çalışmaya vurguluyor, fonksiyonel genomik model olarak değerini ve aracı uygun dönüşüm sistemi eksikliği tarafından sınırlı. Bu protokol için biz nasıl istikrarlı transgenik S. parvula oluşturmak için raporu bir Agrobacterium aracılı çiçek daldırma yöntemiyle hatları. S. parvula, benzersiz özellikleri bir belirsiz çiçekli alışkanlık ve yapraklarda yüksek epicuticular balmumu içeriği gibi hesaba A. thaliana için kullanılan dönüştürme iletişim kuralını değiştiren. Kısaca, S. parvula tohum dikim önce beş gün boyunca 4 ° C'de tabakalı. Bitkiler bir photoperiod 14 h ışık ve 10 h karanlık ve bir 130 µmol m-2s-1 ışık şiddeti, 22 ° c ile 24 ° c de yetiştirilmiştir Sekiz dokuz haftalık bitkiler birden fazla çiçek ile dönüşüm için seçildi. Bu çiçek pMP90RK plazmid taşıyan bir infiltrasyon çözümde Agrobacterium tumefaciens GV3101, daldırma. Çiçek üç ila dört hafta dönüşüm verimliliği artırmak için zaman aralığı ile daldırma iki tur gerçekleştirilen. T1 tohum toplanmış ve çimlenme için aday ekran satırları dönüşüm önce dört hafta için bir konteyner Nem Çekiciler ile kurutulmuş. BASTA direnç T1 bitkiler ekran için kullanıldı. BASTA çözüm üç kez üç gün yanlış pozitif azaltmak için iki haftalık bitkiler başlangıç aralığı ile püskürtülür. BASTA damla test gerçek pozitif transformants tanımlamak için bireysel bitkiler kalan gerçekleştirildi. Dönüşüm verimliliği %0.033 3-4 transgenik bitkiler başına 10.000 T1 tohumları yayılır verimli oldu.

Geliştirdiğimiz T0 tohumları 150 gün içinde hasat sağlayan dönüştürme protokol bundan A. thalianaiçin değiştirilmiş bir çiçek daldırma yöntemiyle. Şekil 1 zaman çizelgesi ve dönüşümü daldırma çiçek üzerinden yürütmek için en iyi sahne temsil S. parvula bitkiler bir özetini gösterir. 60-80 gün sonra dönüştürme için hedef sahne olarak çimlenme sırasında birden fazla çiçek S. parvula bitkiler 70 –80 çiçekler ile seçilen. Az ...

Agrobacterium aracılı dönüşümü daldırma çiçek yöntemini kullanarak başarılı bir şekilde Schrenkiella parvulaextremophyte modelinin kararlı transgenik satırları oluşturmak için istihdam edilebilir. Biz bundan farklı büyüme alışkanlıkları ve extremophyte fizyolojik özellikleri dikkate alınarak Arabidopsis thalianaiçin değiştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Schrenkiella parvula için tekrarlanabilir bir dönüşüm protokolü olan bu yöntem, özellikle sert ortamlara bitki adaptasyonlarını araştıran çalışmalar olmak üzere, bitki karşılaştırmalı ve fonksiyonel genomlama alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, schrenkiella parvula'da çoklu iyon tuz gerilmelerine uyarlanmış ekstremofit üzerindeki rutin fonksiyonların araştırılmasını sağlar. Aynı zamanda yakın akrabası, anne ebeveyn Aribidopsis Thaliana bakar karşılaştırmalı çalışmalar sağlar.Schrenkiella Parvula'nın Aribidopsis Thaliana ile karşılaştırılması, Schrenkiella parvulanın benzersiz adaptasyonunu sağlayan gen regülasyonu ve fonksiyonundaki varyanslar hakkında fikir verebilir. Arabidopsis Thaliana için dönüşüm protokolü zaten iyi kurulmuş. Yöntem şimdi transgenik Schrenkiella Parvula bitkileri kullanarak karşılaştırmalı çalışmalar sağlar.Genellikle bu yönteme yeni araştırmacılar çiçekli alışkanlığı ve bir flora daldırma kullanarak etkili dönüşüm yapmak Schrenkiella Parvula bitkilerin yaprak morfolojisi yanı sıra gerçek dönüştürücülerin seçimi zor nedeniyle mücadele edecek. Başlamak için, ıslak toprak üzerine yaklaşık 20-25 S.Parvula tohumu aktarmak için ıslak bir kürdan kullanın. Sonra beş ila yedi gün boyunca dört derece santigrat tohumları tabakalı.Tabakalaşmadan sonra tohumları 7-10 gün boyunca büyüme odasına geri döndürün. Tüm fideler çimlendikten sonra, her dört köşede ve tencerenin ortasına sadece bir fide bırakın. Onlar çiçek kadar büyüme odasında sekiz ila 10 hafta boyunca bitkiler büyümek.Dönüşüm gününde, metin protokolüne göre S.Parvula tesislerini seçin. Zaten siliques içine gelişmekte olan herhangi bir tozlaşmış çiçeklenme kaldırmak için forceps ve küçük makas kullanın. Bitkiler hazır olduktan sonra, bir agrobacterium infiltrasyon çözeltisi hazırlayın.Bundan sonra, S.Parvula çiçeklenmesini 20 saniye boyunca agrobacterium infiltrasyon çözeltisi içine daldırın. Burada gösterilen dönüşüm için kullanılabilecek bitkilerin en erken aşamasıdır, sürece zaten gelişmiş siliques dönüşüm önce kaldırılır, daha fazla çiçek ile eski bitkiler kullanılabilir. Dönüşümden sonra, çiçekleri yatay olarak kubbeli temiz tepsilere koyarak bitkileri kaplayın.Sonra bir ila iki gün için karanlık bir büyüme odasında bitkiler yerleştirin. Dik bir konuma bitkiler dönün ve büyüme odasına aktarın. Takip eden hafta, daldırma çiçeklenmeleri izleyin.İlk çiçek daldırma on gün sonra, S.Parvula bitkiler yeni çiçeklenme ve siliques üretmeye devam edecektir. Çiçek daldırma ikinci bir tur daha yeni ortaya çıkan çiçeklenme dönüştürmek için yapılabilir. Tohumlar olgunlanıncaya kadar bitkileri büyütün ve tohumları yaklaşık 21 hafta hasat edin.Kurutucularla dolu hava geçirmez bir kapta oda sıcaklığında tohumları 2-3 hafta kurulayın. Metin protokolüne göre T bir tohumlarını ekin. İlk 2-3 gerçek yaprakları geliştirmek kadar bitkiler büyümek.Herbisit direnci için ilk seçimi gerçekleştirmek için, seyreltmek glufosinat amonyum herbisit ve fideler üzerine sprey. Fidelerin üzerini bir gecede kubbelerle kaplayın. Tepsileri büyüme odasına geri koy ve kubbeyi çıkar.Fidelerin çoğu herbisit tarafından seçilene kadar bekleyin. İkinci seçime başlamak için, BASTA çözeltisi ile üç ila dört kez püskürtülen bitkilerin belirlenmesi. Iki ila üç hafta daha bitkiler büyüdükten sonra, her bitki üzerinde en büyük olgun yaprak seçin.Sonraki balmumu tabakası kaldırmak için bir parmak ile yavaşça yaprak yüzeyine ovmak. Daha sonra yaprak üzerine seyreltilmiş BASTA çözeltisi bir damla yerleştirin. Bir haftaya kadar solma belirtileri için BASTA çözeltisi ile tedavi edilen yaprakları izleyin.Son olarak daha fazla analiz için BASTA damla etkilenmemiş yaprakları ile bitkiler seçin. Bu protokolde S.Parvula çiçek daldırma yöntemi ile agrobacterium ile dönüştürülmüştür. Agrobacterium ile enfeksiyon bazı çiçekler kürtaj ile sonuçlandı.Ancak S.Parvula bitkileri ilk çiçek daldırma sonra yeni çiçekler üretmeye devam etti ve tekrar dönüştürülebilir. BASTA sprey ve damla testleri kullanılarak, gerçek pozitif transformatanlar doğru bir şekilde tanımlanabilir. PCR onayı kullanılarak test edilen numune sayısı azaltılabilir.Bu yöntem Arabidopsis Thaliana dönüşümüne benzer olsa da, Schrenkiella Parvula'nın büyüme ve morfolojisindeki farklılıkları hatırlamak önemlidir. Protokolün bu farklılıkları yansıtacak şekilde değiştirilmesi, başarılı dönüşüm için çok önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların ekstremofit modeli Schrenkiella Parvula'da birden fazla tuz stresi adaptasyonuna yol açan genomik varyasyonların evrimini keşfetmelerine yardımcı olabilir.Aradopsis Thaliana, schrenkiella Parvula ile yakından ilgili başka bir bitki fonksiyonları hakkında bilgi ile bu tekniği birleştirerek. Araştırmacılar, bu iki tür arasında iki farklı yapı olduğunu yönetmelik ve işlevleri varyasyonları inceleyebilirsiniz. Dönüşüm işlemi sırasında, otoklavlanabilir kaplarda tüm agrobacterium infiltrasyon çözümiçeren önemlidir.Eldivenler, makro pipet uçları ve kağıt havlular da dahil olmak üzere agrobacterium ile temas eden tüm malzemeleri sterilize edin ve güvenli bir şekilde atın.

plant-growth-agrobacterium-mediated-floral-dip-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu makale, çiçek-daldırma yöntemi göstermektedir.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

Kaynak: Lee, H. ve diğerleri, Enfeksiyon Sırasında Bakterilerden Verilen Efektörleri Görselleştirmek için Bölünmüş Yeşil Floresan Protein Sistemi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, konfokal mikroskopi ile birlikte bölünmüş süper klasör yeşil floresan proteini (sfGFP) tamamlama kullanılarak bitki hücrelerinde bakteriyel enfeksiyonu ve efektör protein dağıtımını izlemek için bir yöntem göstermektedir. Yaklaşım, efektör translokasyonunun konakçı hücre sitozolüne hassas bir şekilde görselleştirilmesini...

Bitki Hücrelerinde Bakteriyel Enfeksiyon ve Efektör Protein Dağıtımının İzlenmesi

Bu videoda, Agrobacterium aracılı ikili bakteriyel yapay kromozom tabanlı gen dönüşümü yoluyla kararlı transgen ifade eden transgenik Arabidopsis bitkilerinin neslini gösteriyoruz.

Arabidopsis Bitkilerinde İkili Bakteriyel Yapay Kromozom Vektör Tabanlı Gen Dönüşümü: Tek Kopya Yerleştirme ile Transgenik Bitkiler Oluşturma Tekniği

Burada, biz çiçek daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki dönüşümü kullanarak keten dönüştürmek için bir protokol mevcut. Bu protokol için basit ve ucuzdur, ancak keten transformasyonu için mevcut veriler yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranını verir.

Keten Çiçekli-Dip Dönüşüm ( Linum usitatissimum) Yüksek Dönüşüm Oranı ile Transgenik progeny'lerinde oluşturmak için

PBIBAC-GW ikili vektör oluşturma transgenik bitkiler sağlam tek kopya eklemeler, kolay bir süreç ile kolaylaştırır. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik Arabidopsis bitkiler üretme ve bitkiler intactness için sınama işlemi boyunca rehberlik ve ekleme sayısı kopyalamak sunulur.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Bu protokol, ilgilenilen gen(ler)i yeşil mikroalgler Chlorella vulgaris'in nükleer genomuna entegre etmek için Agrobacterium tumefaciens aracılı dönüşümün (AMT) kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve kararlı dönüştürücülerin üretimine yol açar.

Yeşil Mikroalglerin Agrobacterium tumefaciens Aracılı Genetik Mühendisliği ( Chlorella vulgaris)

Agrobakteriya aracılı bir Brassicaceae türü olan Rorippa aquatica'nın Agrobakteriya aracılı dönüşümü için, kaynak yoğun steril doku kültürü prosedürleri olmadan verimli ve optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Görsel dönüşüm işaretleyicisi ve sürgün yenileme boru hattı kullanılarak yakın klonal transformantlar başarıyla üretildi ve böylece bitkinin su altı ortamına uyum sağlama çalışmalarını ilerletti.

Eşeysiz Amfibi Brassicaceae Türü, Rorippa aquatica'nın Verimli Rejenerasyon Temelli Agrobakteriya Aracılı Dönüşümü

Phytophthora palmivora'nın Agrobakteriya aracılı dönüşümü için basit, etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz; bu protokol P. capsici  için de geçerlidir.

Phytophthora palmivora'nın Agrobakteri Aracılı Dönüşümü İçin Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Öğrenin Schrenkiella parvula için çiçek daldırma yöntemiyle Agrobacterium aracılı dönüşüm protokolünü. Bu teknik, ekstremofit bitkilerin tuz stresine adaptasyon mekanizmalarını ve Arabidopsis thaliana ile karşılaştırmalı genomik çalışmaları mümkün kılar.

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Daha fazla video keşfet