Rekombinant membran proteinlerinin Proton ciro oranı analiz etmek için bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot

Bu yöntem taşıyıcılar ve kanallar gibi membran proteinlerinin araştırılmasına yardımcı olabilir. Protein aktivitesi ve özgüllüğü ile farklı fizyolojik ve patolojik durumları karşılaştıran substrat ciro oranı kaybı hakkında bilgi. Bu tekniğin en büyük avantajı, potansiyel kayma varyasyonu ve klorür içermeyen tampon koşulları en aza indirir.

Ve daha kesin membran potansiyel ölçümleri sayesinde ciro oranı belirleme hassasiyetini önemli ölçüde artırır. Yumruk adımları için öğeleri toplayın. Bunlar arasında iki mikro kılcal pipet ucu, keskin bir bıçak ve sürgülü kaliper bulunmaktadır.

Elektrot için gümüş tel, kum kağıdı ve elinde üç azı lı potasyum klorür çözeltisi bulunur. Buna ek olarak temizlik ve DC güç kaynağı için etanol ve su var. İki mikro pipet ucuyla çalışarak devam edin.

Arabelleği içeren uçla başlayın. İkinci ipucunu ilkinin yanına yerleştirin. İkinci ucu hareket ettirin, böylece, dar bir parça eklendiğinde ilkdar kısmına en az beş milimetre kadar uzatır.

İpucu içeren ilk arabelleğe bağlı olacağı konumu işaretleyin. Sonra mikro-agar tuz köprüsü elektrot uzunluğunu ölçmek için kaliper kullanın. Ucu uygun uzunlukta kesmek için bıçağı kullanın.

Kesilen yüzeyi etanol ve ardından su ile temizleyin. Sonra, elektrot için gümüş tel yaklaşık sekiz santimetre uzunluğunda olsun. Mendillerdeki teli etanol ve ardından su ile temizleyin.

Temizledikten sonra, bir ucunda bir santimetre uzunluğunda yüzeyi pürüzsüz lemek için kum kağıdı kullanın. Düzgün leştirilmiş ucu olan bu tel elektro-kimyasal kaplamalı olmaya hazırdır. Pürüzsüz ucu potasyum klorür çözeltisine koyun ve diğer ucunu kaplama için DC güç kaynağına bağlayın.

Kaplandığında elektrotun bağlantısını kesin ve suyla temizleyin. Kuruttuktan sonra, mikro kılcal ucu mümkün olduğunca derinden nüfuz sağlayan uzunluğu belirleyin. Elektrodu kaplamasız taraftan uygun uzunluğa kesin.

Şimdi, agarose ile bir tuz çözeltisi hazırlamak için hareket. Su içeren bir şişe potasyum klorür çözünür ve karıştırma yardımcı olmak için bir manyetik karıştırıcı kullanın. Karıştırıcı çıkardıktan sonra şişeye agarose ekleyin.

Bir mikrodalga için şişe alın ve yaklaşık 100 santigrat derece agarose eritmek için ısıtın. Agarose'un tamamen çözülmüş olup olmadığını görsel olarak kontrol etmek için çıkar. Agarose bir kez hava kabarcıkları önlemek için yavaş yavaş mikro-kılcal içine pipet 10 mikrolitre çözülür.

Özellikle yüksek agar konsantrasyonlarında, agar tuzu çözeltisini mikro kılcal uça dikkatlice pipetlemek önemlidir. Düzgün yapılmazsa hava kabarcıkları kolayca ucu ve blok elektrik akımı üretilir. Pipetten ucu çıkardıktan sonra elektrot içine itin.

Elektrotun tuz çözeltisini deldiğinden emin olun. Elektrot oda sıcaklığında olduğunda bir amplifikatöre bir referans elektrot takın. Referans elektrotunbir mililitre lik tamponla plastik bir kap içine indirilebilmeniz için destekleyin.

Daha sonra tuz köprüsü elektrot'u çözeltiye batırın. Bir voltaj uygulayın ve devam etmeden önce bir akım tepkisi olup olmadığını kontrol edin. Test başarılı olursa, elektrotları ayırın.

Gerekirse tuz köprüsü elektrotünü üç azı lı potasyum klorür çözeltisi içinde batırarak saklayın. Ardından, plastik uç içeren arabelleği hazırlayın. Bir mikro kılcal ucu alın ve dar kısmından iki santimetre bir nokta belirlemek.

Bu pozisyonda tüp 90 derece bükmek için bir ısıtma teli kullanın. Keskin bir bıçakla tüpü bükülmeden beş milimetre uzakta kesti. Etanol ve ardından su ile kesilen bölgeyi temizleyin.

Devam etmeden önce, ucundaki deliğin çapını ölçmek için ölçekli bir ışık mikroskobu kullanın. Daha sonra, pipeti bir çözücü kabına ve başka bir tamponkabına yakın olacak şekilde hareket ettirin. Pipet üç mikrolitre çözücü nün ucuna girip çıkar.

Ardından, ölçüm ucunu üç mikrolitre arabellekle doldurun. Şimdi, tuz köprüsünü potasyum klorür çözeltisinden alın. Ölçüm ucunu tamponla tuz köprüsü elektrotuna takın.

Tuz köprüsü elektrotünü ve referans elektrot'u bir amplifikatöre bağlayın. Bu noktada, referans elektrot ile tampon çözeltisindeki tuz köprüsü elektrotunu askıya alın. Deney için yapılandırmanın bir temsili bu şematiktedir.

Deney sırasında, membran pipet içeren tampon sonunda oluşacaktır. Membran kapasitesini bulmak için veri toplayın. Dikdörtgen alternatif akım tepkisi oluşturmak için üçgen alternatif gerilim sinyali uygulayarak bunu yapın.

Daha sonra, iletkenve gerilimi sıfır akımda bulun. Eksi 50 ila 50 milivolt arasında değişen bir voltaj rampası uygulamasını otomatikleştirin ve akımı kaydedin. Doğrusal bir işlevi verilere sığdırın.

Eğim iletkenlik, x-intercept sıfır akımdaki gerilimdir. Bittiğinde tuz köprüsünden ölçüm ucunu çıkarın. Arabellek ile yeni bir ölçüm ucu doldurun, membran boyunca bir proton gradyanı ayarlamak için farklı pH değerine ayarlayın.

Ölçümleri tekrarlamak için yeni bir ölçüm ucu ve elektrotlarla kurulan deneysel seti yeniden kurun. Burada bir pH gradyan varlığında temsili akım gerilim kayıtları vardır. Ve, bir pH gradyan yokluğunda.

Çizgiler verilere doğrusal bir uyum gösterir. Farklı pH değerleri için x ekseni kesişim noktasındaki kayma Nernst denklemi tarafından tahmin edilir. Bu veriler, beyaz standart gümüş klorür elektrodu ve siyah mikro-agar tuz köprüsü elektrot için zaman içinde membran potansiyelinde kayma temsil etmektedir.

Agar tuz köprüsü elektrodu, 300 saniyenin üzerinde maksimum beş milivoltluk bir kayma ile daha kararlıydı. PH gradyanının bir fonksiyonu olarak potansiyel kaymanın bu çiziminde iki elektrotun pH degradesi arttıkça önemli ölçüde farklı davrandığı görülmektedir. Proton devir hızı bulunabilir ve iki elektrot tipi için karşılaştırılabilir.

Burada standart bir elektrot ile karşılaştırıldığında tuz köprüsü elektrot ile ölçülen mitokondriyal ayırma proteini bir UCP1 için belirlenen proton ciro sayıları verem. Benzer şekilde hazırlanmış UCP3 için de veriler vardır. Oranları agar tuz köprüsü elektrot ile daha kesin görünüyor.

Bu işlemi denerken elektrotun agar tuzu çözeltisine nüfuz etmesini unutmamak önemlidir. Tuz köprüsü de tampon çözeltiiçine daldırma gerekir. Son olarak, agar tuz çözeltisi hiçbir hava kabarcıkları içerdiğinden emin olun.