Name: Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin, yetişkin farelerde intratekal enjeksiyonla adeno ilişkili virüsün merkezi sinir sistemine etkili teslimatını. Lidokain içeren bu yöntem, ALS gibi hastalıklarda gen tedavisi araştırmalarını optimize eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser HEBEI İl Müdürlüğü insan kaynakları ve sosyal güvenlik (CY201605) hibe ve Hebei Eyaleti, Doğa Bilimleri Vakfı (H2017206101) bir hibe tarafından finanse edildi, ve biz AAV için sağlanan Guangping Gao için Dr için çok minnettarız Bu çalışmada.

FVB/NJ fareler anahtar laboratuvar Hebei Nöroloji hayvan tesiste bred. Tüm fare deneyleri ikinci hastane, Hebei Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvan yönetimi, Çin Halk Cumhuriyeti'nin teknoloji ve Bilim Bakanlığı tarafından yürürlüğe düzenlemelere göre yürütülen Çin.
1. %20 lidokain hidroklorür stok çözelti hazırlanması
<ol><li>Lidokain hidroklorür 2 g ağırlığında. 5-6 mL steril su ve girdap yavaşça ekleyin. 10 mL steril su ile toplam hacmi artar.</li>
	<li>1.2 0.2 mikronluk filtrelerden hisse senedi çözüm filtre. Aliquot hisse senedi çözüm, 1.5 mL microcentrifuge başına 1 mL tüp ve sızdırmazlık bir film ile kapatın. 4 ° C'de mağaza</li>
</ol>2. doğrudan intratekal AAV teslim uyanık farelerde
<ol><li>Tablo 1' de belirtildiği gibi gerekli malzemeleri hazırlamak ve çalışma alanının % 70 etanol ile steril gazlı bez kullanarak silin.</li>
	<li>RAAVrh10 hisse senedi çözüm (5 x 1012 genom kopya/mL) 95 µL bir steril 200 µL microcentrifuge tüp ekleyerek AAVrh.10/1% lidokain hidroklorür karmaşık 100 µL hazırlamak ve 5 µL % 20 lidokain hidroklorür hisse senedi çözüm ekleyin. Mix de yukarı ve aşağı pipetting. Sonra virüs çözümü buz (4 ° C) depolar. Not: fare4 başına 8 µL kullanılacaktır.</li>
	<li>
AAV çözüm şırınga enjeksiyon için hazırlanıyor
	<ol>
<li>Bir 25 µL Hamilton şırınga ile 27 G iğne ve şırınga eğimli hacimsel ölçek iğneyle ucunda hizalamak bir araya getirin.</li>
		<li>4 x 1010 genom kopyaları virüs çözümü ile 8 µL şırınga hafifçe çizin. Hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare hazırlanıyor Not: erkek veya kadın FVB/NJ fareler (30-70 gün eski) Bu çalışmada kullanılmıştır. BT enjeksiyon mahallede ameliyat.<ol>
<li>KukuIeta % 70 etanol ile çalışma alanında sterilize. Yüzükoyun başlıklı bir bedpiece uyanık fare (erkek veya kadın, 30-70 günlükken, 13-20 gr ağırlığında) koyun. Fare sakin ve ısırılan önlemek için steril gazlı bez ile üst vücut kapak.</li>
		<li>Hayvan onun pelvik korse ile diğer tarafta bir yan ve işaret parmağı/orta parmağına bir başparmak üzerinde uygun şekilde ve sıkıca sürükleyici tarafından tamir. Cilt arasında ikili pelvik korse başparmak ve işaret parmağı ile gergin tutmak. Yavaşça hayvan üst vücut üzerinde hurma ile tutun.</li>
		<li>Kürk arasında ikili pelvik korse sırtında tıraş sonra cilt yüzeyinde bir iyodür tabanlı fırçalayın ve % 70 etanol ile sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İntratekal enjeksiyon12
	<ol>
<li>İntervertebral alanı arasında ikili pelvik korse bir başparmak veya diğer elin işaret parmağı ile orta çizgi boyunca hissediyorum ve L5-L6 intervertebral alanı belirtmek için bir tırnak ile bir girinti tuşuna basın (enjeksiyon yeri bulmak).</li>
		<li>Kuyruk Bankası biraz ve yavaşça döndürün omurganın orta hat belirtmek için. Hayvan önce enjeksiyon (2.3.1 adımda belirtilen) Başkanı doğru iğne eğim ayarlayın.</li>
		<li>Hayvanlar sıkıca sabitlenir ve omurga orta çizgi boyunca iğne hizalamak emin olun.</li>
		<li>İğneyi yavaşça ve dikey olarak yerleştirin (veya biraz 70 – 80 ° eğim) girinti ve tutmak belgili tanımlık tenkıye bir merkez sagittal düzlemde kesiştiği. Kemik bağlandığında yaklaşık 30 ° açı yavaş yavaş azaltmak sonra iğne intervertebral uzaya kayma. Not: Bir belirgin ani kuyruk flick intradural alan başarılı bir giriş bir ibret vardır. Bir kez iğne intervertebral alanı girer, iğne ucu sıkıca klempe hissedeceksiniz. Bu çalışmada kullanılan 27 G iğne BT teslim fareler ama değil fareler için uygundur.</li>
		<li>(2.2 adımda belirtilen) vektör çözüm enjekte. Sayacı başlatmak ve vektör çözüm 1 µL/4 s. koru iğne yaklaşık 1 dk hızında 8 µL bitirdikten sonra enjekte teslim. İğne sızıntı önlemek için nazik döndürme ile geri alıyorum.</li>
		<li>Fare geçici zayıflık bacaklarda hemen doğumdan sonra enjeksiyon kalite4değerlendirmek için puan. Not: Standart4gibidir. 0 puan edinildi: zayıflık; 1 puan edinildi: küçük zayıflık hind bacaklarda olmadan yürüyüş anormallik; 2 puan edinildi: orta arka bacaklarda zayıflık belirgin yürüyüş anormallik ile; 3 puan edinildi: komple felç hind ekstremitelerin; 4 puan edinildi: tamamlamak hind bacaklarda felç, nefes darlığı ve ılımlı zayıflık ön bacaklarda; ve 5 puan: tüm dört bacaklarda felç ve belirgin darlığı tamamlandı.</li>
		<li>Fare kurtarma felç için kafes geri taşıyın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Temizlik
	<ol>
<li>Şırınga 1 mL steril su ile yıkayın. Laboratuvar malzemeleri sıralamak ve autoclaved sterilizasyon için tüm olmayan tek malzemeleri toplamak. Kürsüye % 70 etanol ile temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. doku hazırlık immunohistokimyasal boyama için
<ol><li>
Doku koleksiyonu
	<ol>
<li>Fare ile % 3 kloral hidrat (0.1 mL/10 g) 21 gün sonrası enjeksiyon, derin mayi enjeksiyonu ile anestezi.</li>
		<li>Transcardially ile buz gibi 0.01 M PBS (NaCl 147 mM; 20 mL sıvı NaH2PO4 1.9 mM; K2HPO4 8.1 mM, pH 7,4) ilk olarak, o zaman % 4 buz gibi paraformaldehyde (içinde 0.01 M PBS) pompası (10 mL/dk'ya 1 dk, sonra 5 mL/dk'ya 9 dk.) ile. Uyarı: Paraformaldehyde kanserojen ve zehirli. Sadece duman mahallede eldiven giyerken başa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Omurilik ve beyin diseksiyon
	<ol>
<li>Bacaklarda ve her hayvan Başkanı yüzükoyun bir köpük kutusunun kapağında şırınga iğneleri ile fix sonra şerit ve cilt başından sakrum için makas ile kaldırın.</li>
		<li>Kafatası gözler arasında küçük, kafatası ve beyincik üzerine yatay çizgi orta rotası yanında kesmek sonra kafatasının her iki tarafı için açın.</li>
		<li>Oksipital kemiğin cımbız ile Asansör ve spinal kanal bilateral oftalmik makasla açın. Her iki tarafta kaburga kesti ve vertebra üst yarısı dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
		<li>Beyin eğri cımbız ile kaldırın ve kafatası tabanı sinirleri sever, sonra tüm beyin ve omurilik dikkatle incelemek. Dokular %4 paraformaldehyde için 24 saat sonrası düzeltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dokusu dilimlerin hazırlanması
	<ol>
<li>Cryoprotect beyin ve servikal ve lomber spinal kord % 30 sükroz çözüm 4 ° C'de gecede Doku optimum kesim sıcaklığında (OCT) bileşik katıştırmak ve hızlı sıvı azot ile dondurma.</li>
		<li>Doku bir cryostat kullanarak 25 µm kesme ve donmuş bölümleri 0.01 M PBS kullanmak için 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. immünhistokimya
<ol><li>%1 H2O2 10 min için serbest yüzer bölümlerde pretreat sonra 10 dk. Incubate %5 serum ve %0,3 1 h için PBS içinde non-iyonik deterjan içeren bir engelleme çözüm için PBS içinde yıkayın.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de karşılık gelen birincil antikorlar dilimlerle kuluçkaya PBST bölümlerde yıkayın (% 0,2 ara 20 dakika sonra PBS) 30 dk (3 kez için 10 dk) için.</li>
	<li>Karşılık gelen biotin-ikincil antikor 1 h. PBST makinaya 30 dk (3 kez için 10 dk) için oda sıcaklığında dilimlerle kuluçkaya.</li>
	<li>Benzeşme biotin peroksidaz 40 min için karmaşık bölümlerle kuluçkaya ve achromogenic Ajan ile leke. Düzgün, Kuru ve bölümler slaytlar üzerine monte.</li>
	<li>5 min için susuz etanol ve Ksilen 10 min için slaytları emmek, o zaman bir montaj orta slaytlarla mühür. Son olarak, slaytları bir şarj kuplajlı cihaz ile (CCD) donatılmış bir mikroskop ile 100 x 200 x ve 400 x büyütme görüntü.</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+a+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).</li>
<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teknik olarak, uyanık farelerde BT enjeksiyon sırasında birkaç önemli adımlar vardır. İlk, uygun jest ve firma denetimi tüm operasyon boyunca farelerin başarılı teslimat için bir ön koşul olduğunu. İkinci olarak, değil çok fazla direniş olmadan eklemek veya zorla hayvanlar yaralanmasına veya iğne ucunu bükme durumunda güçlü direnç altında eklemek için gerekli olduğu gibi en zor nokta intervertebral alanı iğne ucu ile hissediyor. Üçüncü olarak, lidokain nedeniyle geçici felç objektif bir gösterge için enjeksiyon kalite sa...

AAV CNS iletim birkaç yan etkisi ile uzun vadeli ve yaygın gen ifadesinde aracılık ve bu nedenle amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington'ın da dahil olmak üzere CNS hastalıkları tedavi etmek gen tedavisi için en umut verici araçlar haline gelmiştir hastalığı (HD), Alzheimer hastalığı (Ah), lizozomal hastalıklar (LSD), Gaucher hastalığı (GD) ve nöronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. Halen, 100'den fazla AAV serotipleri insan ve hayvan izole edilmiştir. Bunlar arasında en az 12 içinde Preklinik kullanılmıştır ve en çok da dahil olmak üzere klinik çalışmalarda kullanılan gen vektörel çizimler gibi AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ve rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Farklı CNS hastalıkları nedeniyle çeşitli etkilenen CNS bölgeler ve hücre tipleri farklı AAV teslim stratejileri gerektirir. CNS bölgeler ve hücre AAV transduce türleri değişir bağlı olarak serotip yanı sıra teslimat yöntemi. Örneğin, rAAVrh10 nöronlar ve ne zaman intratekal enjeksiyon4,7tarafından teslim glia transduced ise ağırlıklı olarak sistemik damar içi enjeksiyon (IV), tarafından teslim astrocytes transduce gösterilmiştir. İntraventriküler aracılığıyla beyin-omurilik sıvısı (BOS) içine enjeksiyon veya intratekal enjeksiyon yaygın CNS iletim8 sonuçlandı, ancak buna ek olarak, parankimi enjeksiyon enjeksiyon yeri çevresinde için yerel iletim sonuçlandı . Çalışmalar de AAV teslim gen tedavisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi edici etki gücü tarafından Yönetim9,10,11göstermiştir. CNS ALS gibi geniş alanlarda etkileyen hastalıklarda intratekal enjeksiyon bos içine bir sistemik teslim Yöntem4,10' a kıyasla daha düşük bir dozda hastalıkla tarafından tutulmuş çoğu alanları kapsayacak şekilde gösterilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu lomber ponksiyon laminektomi ve intratekal kateterizasyon4ile ilişkili olası yaralanmaları önler ALS için fare modellerinde AAV enjekte için kullanılan göstermiştir.
Deneysel doğrudan lumbar ponksiyon ilk ajanlar, özellikle anestezi, spinal kord analjezi ve anestezi 188512,13için teslim etmek için kullanılmıştır. Bu raporda, lomber ponksiyon BT enjeksiyon yöntemi %1 lidokain hidroklorür, bir yerel Amid kaynaklı anestezi, değerlendirmek ve enjeksiyon kalite izlemek için enjeksiyon çözümde yardımı ile yetişkin farelerde göstermektedir. Başarısız olan iğneleri bu davranışı belli etmedi, ancak başarılı enjeksiyonları lidokain kaynaklı geçici felç tarafından işaretlenen. Enjeksiyon verimliliği tahmin yardımcı olmak için beş sınıflarda biri olarak geçici zayıflık düzeyini gizli. Son olarak, biz rAAVrh10 iletim düzeyi felç sınıf tarafından tahmin edilebilir gösterir. Bu nedenle, bu kulaklıklar AAV teslim yöntemi AAV aracılı gen-teslimat için deneysel tedavi CNS hastalıkları geliştirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>FVB/NJ fareleri</td><td>Charles River Laboratuvarları Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidokain hidroklorür monohidrat</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>AAV</td><td>Viral Vektör Çekirdeği Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi</td><td></td><td></td>Gen Terapi Merkezi</tr><tr><td>25 & L&nbsp; Hamilton şırınga / 27-30 G iğne</td><td>GASTIGHT</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>OCT havuzu</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2 O 2 </td> <td>SHUI HUAN PAI</td><td></td><td></td></tr> 170401 <tr><td>Keçi serumu</td><td>Solarbio</td><td>S9070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>YAŞAM BİLİMLERİ</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>G10362</td><td>1:333 seyreltme</td></tr><tr><td>İkinci antikor (keçi-anti tavşan)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC REAKTIFI</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroksidaz Substrat Kiti</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td>NaCl<td>ile floresan için montaj ortamı</td></tr><tr><td></td><td>Yong Da Kimyasal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH 2 PO 4 & orta nokta; 2H < alt > 2 O</td><td>Yong Da Kimyasal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na 2 HPO 4 ve orta nokta; 12H2O</td><td>Yong Da Kimyasal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Yong Da Kimyasal</td><td>307699</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma Mikroskobu Slaytları</td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>SÜPER KAYMALI MİKRO-CAM Elektro</td><td>Mikroskopi Siences</td><td>72236-60</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj tüpü</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu hücre kültürü kümesi</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu hücre kültürü kümesi</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gazlı bez</td><td>Wei AN</td><td>05171112</td><td>8 cm x 10 cm x 12 cm</td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Hong Da</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüpler</td><td>Plazmlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peppet ipuçları</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centirifuge</td><td>eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Regerator</td><td>Haier</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>MILLEX GP</td><td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td>Pompası</td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Donma mikrotomu</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

İntratekal (BT) enjeksiyon adeno ilişkili virüs (AAV) içinde CNS CNS gen terapisi Emanet, noninvasiveness ve mükemmel iletim etkinliği sayesinde önemli ilgi çekmiş olmalı. Önceki çalışmalarda AAV teslim gen terapisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi potens tarafından yönetim gösterdi. Ancak, öngörülemeyen hatası BT yönetim küçük hayvanlarda teknik sınırlandırılması nedeniyle yüksek oranlarda bildirilmiştir. Burada, %1 lidokain hidroklorür enjeksiyonu çözüm içine ekleyerek lumbar ponksiyon küçük hayvanlarda başarı kapsamını belirtmek için bir skorlama sistemi kurduk. Biz daha fazla geçici zayıflık enjeksiyon takip ölçüde AAV iletim verimliliği tahmin edebilirsiniz göstereceğim. Böylece, BT ekleme Buyöntem fare modelleri MSS geniş bölgelerinde eziyet CNS hastalıkları tedavi edici çalışmalarda en iyi duruma getirmek için kullanılabilir.

Fareler farklı derecelerde geçici zayıflık değil peşini enjeksiyon AAV çözüm %1 lidokain hidroklorür nedeniyle çeşitli intratekal enjeksiyon kalitesini gösterdi. Biz kurduk yarı kantitatif 5 dereceli Puanlama sistemine göre AAV iletim şekillerinin farelerde lidokain kaynaklı uzuv zayıflık farklı derecelerde ile test ettik (0, n puan edinildi = 2; 1, n puan edinildi = 1; 4, n puan edinildi = 4; puan edinildi 5, n = 3). EGFP immunostaining spinal iplerden gösterdi ya hiç veya çok az 0 Puanl...

Burada %1 lidokain hidroklorür viral bir çözümde küçük hayvanlar için verimli adeno ilişkili virüs teslim edilmesini sağlamak ve iletim verimliliği merkezi tahmin etmek için bir skorlama sistemi kurmak için bir doğrudan intratekal enjeksiyon tekniği mevcut sinir sistemi geçici zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesine göre.

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Bu yöntem, ALS gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarının deneysel tedavisi için uyanık küçük hayvanlarda adeno-ilişkili viral transgenlerin etkin intratekal teslimini kolaylaştırır. Bu yöntemin en büyük avantajı viral çözelti başarılı bir enjeksiyon dan sonra geçici bir felç neden olur% 1 lidokain hidroklorür içerir olmasıdır. Bu yöntem intratekal otomatik durumun başarısını değerlendirmek için görsel bir gösterge sağlasa da, teslimatın başarı oranını artırmak için yeterli uygulama şarttır.İşleme başlamadan önce, 25 mikrolitrelik Hamilton şırıngasına 27 kalibrelik bir iğne takın ve iğnenin yontucuucunu şırıngadaki hacimsel ölçekle hizala. Daha sonra, virüs çözeltisinin 10.genom kopyalarını şırıngaya dikkatlice yükleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen din. Sonra, bir biyogüvenlik başlık eğilimli pozisyonda bir yatak parçası üzerinde bir uyanık 30 ila 70 günlük 12-30 gram fare yerleştirin ve fare sakin ve ısırılmadan kaçınmak için steril gazlı bez ile üst vücut kapağı.Sıkıca bir tarafta başparmak ve diğer tarafta işaret parmağı ve orta parmak bir başparmak ve işaret parmağı ile ikili pelvik korseler arasında cilt tutmak ile pelvik korse üzerinde fare kavrama. Sonra ikili pelvik korseler arasında kürk tıraş ve bir iyot bazlı scrub ve% 70 etanol ile maruz kalan cilt sterilize. Adeno ile ilişkili virüs çözeltisinin doğrudan intratekal iletimi için, bilateral pelvik korseler arasındaki orta hat boyunca intervertebral uzayı palpate ve L5-L6 intervertebral uzayı göstermek için cilde bir girintiyi bastırmak için bir tırnak kullanın.Omurganın orta çizgisini ortaya çıkarmak ve iğnenin eğimini hayvanın kafasına doğru ayarlamak için kuyruk tabanını hafifçe ve hafifçe döndürün. Fare sıkıca konumlandırılırken, iğneyi omurganın orta hattı boyunca hizalayın ve iğneyi girintinin merkezine yavaşça ve dikey olarak yerleştirin ve şırıngayı merkezi bir sagittal düzlemde tutarak yerleştirin. İğne kemikle temas ettiğinde, açıyı yavaşça yaklaşık 30 dereceye düşürün ve iğneyi omurgasız uzaya kaydırın.Ani bir kuyruk hareketi intradural alana başarılı bir girişin işaretidir. İğne intervertebral uzaya girdiğinde, ucu sıkıca kenetlenmiş hissedeceksiniz. Vektör çözeltisini enjekte edin ve iğneyi intradural boşlukta bir dakika koruyun.Daha sonra sızıntıyı en aza indirmek için yavaşça dönme ile iğneyi geri çekin. Enjeksiyon kalitesini değerlendirmek için fare uzuvlarının geçici zayıflığını hemen skorlayın ve felcinden kurtulması için fareyi kafesine geri döndürün. Uygun deneysel bitiş noktasında, bir köpük kutusu kapağı üzerinde eğilimli pozisyonda ekstremite ve enjekte farenin başını düzeltmek ve şerit ve sakrum için baş deri kaldırmak için makas kullanın.Kafatasını gözler inara, kafatasının orta çizgisi boyunca ve beyincik üzerindeki yatay çizgiyi kesve kafatasını her iki tarafta da açın. Oksipital kemik kaldırmak ve bilateral spinal kanal açmak için oftalmik makas kullanmak için cımbız kullanın. Her iki tarafta kaburga kesin ve dikkatle omurüst kısmını çıkarın.Beyni kaldırmak ve kafatası tabanının sinirlerini kesmek için kavisli cımbız kullanın. Sonra dikkatle tüm beyin ve omurilik ayıklayın ve 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit dokuları düzeltmek. Fiksasyon döneminin sonunda, 4 santigrat derecede bir gecede %30 sakaroz çözeltisinde beyni ve servikal ve lomber omuriliği kriyoprotectt ve ardından sıvı nitrojende ani donma işleminden önce optimum kesme sıcaklığı bileşime katıştırma sağlar.Daha sonra her dokunun 25 mikrometre kalınlığında kesitleri elde etmek için bir kriyostat kullanın, onlar elde edilir gibi 0.01 molar PBS dondurulmuş bölümleri depolamak. Dokuların immünohistokimyasal analizi için, 10 dakika boyunca %1 hidrojen peroksit ile serbest yüzen bölümleri ve ardından PBS'de 10 dakikalık bir yıkama yapın. Daha sonra pbs%5 serum ve %0.3 non-iyonik deterjan içeren bloklama solüsyonundaki numuneleri 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve ardından uygun primer antikorlarla 4 santigrat derecede geceleme etiketi ni takip edin.Ertesi gün, PBS artı Tween 3 10 dakikalık yıkar ile bölümleri yıkayın ve son yıkamadan sonra 1 saat boyunca oda sıcaklığında uygun biyotinylated ikincil antikorlar ile slaytlar inkübül. Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi taze PBST bölümleri 3 kez yıkayın ve sonsuzbiotin peroksidaz kompleksi ile örnekleri kuluçka 40 dakika sonra uygun bir kromojenik ajan ile boyama. Etiketli bölümleri cam mikroskop slaytlarına monte edin ve atlı bölümler tamamen kuruduktan sonra slaytları 5 dakika boyunca susuz etanolle ıslatın.Daha sonra slaytları 10 dakika ksilene batırın ve uygun bir montaj ortamı ile kapatın. Daha sonra slaytları 100, 200 ve 400 kat büyütülmüş bir şarjlı cihazla donatılmış bir ışık mikroskobuyla görüntüleyin. servikal ve lomber omurilik kesitlerinin eGFP immünboylelemi, 0 zayıflık skoru olan farelerin lomber omuriliğinde çok az veya hiç transdüksiyon, zayıflık skoru 1 olan farelerde biraz gelişmiş transdüksiyon ve 4 veya 5 zayıflık puanı olan farelerde güçlü ve yaygın transdüksiyonu ortaya koymaktadır.Geçici ekstremite zayıflığı nın çeşitli derecelerde gösteren farelerden omurilik dokusu bölümlerinin GFP boyama yoğunluğunun ölçülmesi, virüs çözeltisi enjeksiyonundan sonra zayıflığın şiddetinin omurilik transdüksiyonunun kapsamıyla yakından ilişkili olduğunu gösterir. Beyinde, sağlam eGFP sinyalleri koku ampul tespit edilir, dorsolateral prefrontal korteks, dentate girus, ve hipokampus CA3 bölgesi, serebellar korteks, ve beyin sapının marjinal alanları, yüz çekirdeği de dahil olmak üzere, koroid pleksus, ve ependymal epitel hücreleri. Ön boynuzlarda motor nöronlar da güçlü omurilik farklı düzeylerde transdükelenir.Ayrıca, kortekste, piramidal hücreler de dahil olmak üzere GFP pozitif nöronlar yanı sıra mikroglia, astrositler ve oligodendrocytes dahil olmak üzere çeşitli glial hücre tipleri tespit edilir. Bu teknik, nöroloji alanındaki araştırmacıların küçük uyanık hayvanlarda doğrudan intratekal doğumun merkezi sinir sistemi hastalıkları üzerindeki terapötik etkilerini keşfetmelerini sağlar.

direct-intrathecal-injection-recombinant-adeno-associated-viruses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada görsel korteks nöronlar ve glia floresan etiketlenmesi için AAV vektörleri intrakranial enjeksiyon sunuyoruz.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Kaynak: Li, D., et al. Yetişkin Farelerde Rekombinant Adeno İlişkili Virüslerin Doğrudan İntratekal Enjeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, adeno-ilişkili virüslerin (AAV) uyanık bir farenin beyin omurilik sıvısına (BOS) intratekal enjeksiyonu için şırınga hazırlığı, omurga hizalaması ve hassas iğne yerleştirmeyi kapsayan prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, CNS tedavileri için potansiyelini destekleyerek hedeflenen gen iletimini doğrular.

Merkezi Sinir Sistemi Hastalıklarının Tedavisi için Bir Fare Modelinde Virüslerin İntratekal Verilmesi

Kaynak:Pourshafie, N., et al. Kemirgenlerde nöromüsküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant adeno ile ilişkili virüs serotip 9 kullanılarak mikroRNA'nın sistemik dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2018).Bu videoda, spinal ve bulbar kas atrofisi veya SBMA'dan etkilenen bir fare, terapötik mikroRNA'yı kodlayan bir plazmid taşıyan rekombinant AAV (Adeno ilişkili vektörler) vektörlerinin kuyruk veni enjeksiyonuna tabi tutulur. Vektör, mutant AR (Androjen reseptörü)-mRNA'ya (haberci ribonükleik asit)...

Spinal ve Bulbar Kas Atrofisi Fare Modelinde Rekombinant Adeno İlişkili Vektörlerin Enjekte Edilmesi

Kaynak: Grames, M. S., et al. Adeno İlişkili Virüsün Sıçanlara İntravenöz Uygulanması ve Merkezi Sinir Sistemi Transdüksiyonunun Değerlendirilmesi için Yöntemler ve İpuçları. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, sıçanlarda rekombinant adeno-ilişkili virüsün (AAV) kuyruk veni enjeksiyonunu göstermektedir. Lateral kuyruk venine enjeksiyondan sonra, virüs kan dolaşımına girer, kalpte dolaşır ve beyne ulaşır, burada nöronlara girer ve nöroterapötik uygulamalar için hedef protein üretimini kolaylaştırır.

 Bir Sıçan Modelinde Rekombinant Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin İntravenöz Uygulaması 

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Bu çalışmanın amacı yetişkin farelerde yeni bir subpial gen dağıtım tekniği kullanarak spinal adeno-ilişkili virüs 9 (AAV9) aracılı gen dağıtımının potensi ve güvenliğini geliştirmek ve doğrulamaktı.

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

Mevcut protokol, gen düzenleme ve ilaç dağıtımı için yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatları özetlemektedir.

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.

Juvenil Sıçanlarda Lomber Sarnıç Enjeksiyonu ile İntratekal Vektör Verilmesi

Burada, yetişkin farelerde adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak uygulamak için fare lateral kuyruk veni enjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırıyoruz. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tahlillerin protokollerini açıklıyoruz.

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Lomber intratekal enjeksiyon, gen terapisini merkezi sinir sistemine iletmek için translasyonel olarak ilgili bir uygulama yolunu temsil eder. Yenidoğan, juvenil ve yetişkin farelerde ve sıçanlarda lomber intratekal enjeksiyonlar için bu kapsamlı standartlaştırılmış protokol, araştırmacılara klinik öncesi gen tedavisi çalışmaları için bu tekniği benimsemede rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Farelerde ve Sıçanlarda Merkezi Sinir Sistemi Hedeflemesi için Gen Tedavisi Vektörlerinin Lomber İntratekal Enjeksiyonu

Subaraknoid virüs infüzyonu kullanan adeno ilişkili virüsün yaygın olarak verilmesi için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Bu yöntem sadece fare neokortikal nöronlarının yüzeysel katmanlarda yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda seçici olmayan bir promotör kullanıldığında bile beşinci katman piramidal nöronlarında transgenin seçici ekspresyonu ile sonuçlanır.

AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu

Öğrenin, yetişkin farelerde intratekal enjeksiyonla adeno ilişkili virüsün merkezi sinir sistemine etkili teslimatını. Lidokain içeren bu yöntem, ALS gibi hastalıklarda gen tedavisi araştırmalarını optimize eder.

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Daha fazla video keşfet