Name: N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Keşfedin Plutella xylostella ryanodin reseptörünün N-terminal etki alanının kristal yapısını X-ray kristalografisi ile belirleme yöntemini. Bu yapısal biyoloji tekniği, insektisit direnci mekanizmalarını anlamaya ve tür-spesifik böcek ilaçları geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma tarafından sağlanan için finansman: Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme Çin Program (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), Ulusal Doğa Bilim Vakfı Çin (31320103922, 31230061) ve proje, Ulusal temel araştırma (973) programı Çin (2015CB856500, 2015CB856504). Beamline BL17U1 Shanghai sinkrotron radyasyon tesisi (SSRF), personel için minnettarız.

1. Gen klonlama, Protein ifade ve arıtma
<ol><li>PCR yükseltmek için ilgi protein karşılık gelen DNA (DBM RyR, Genbank artıkları 1-205 Hayır Hes. AFW97408) ve klon ligasyonu bağımsız klonlama (LIC)25tarafından evde beslenen hayvan-28a-HMT vektör içine. Histidin etiketi, MBP etiket ve N-terminus bir TEV proteaz bölünme sitesinde bu vektör içerir15.
	<ol>
<li>Tasarım LIC astar hedef gen LIC uyumlu 5' uzantılı amplifikasyon için: LIC astar ilet: 5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3' Ters LIC astar: 5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'</li>
		<li>Reaksiyon parçaları (50 μL) birleştirmek: 1 μL DNA şablonları (100 ng/μL), ileri astar (10 mikron), ters astar (10 mikron), DNA polimeraz (NF'leri), 10 x reaksiyon 5 μL 0.5 μL 1 μL 1 μL tampon, 1 μL dNTP (25 mM) , 40.5 μL RNase free GKD2O.<ol>
<li>Bir PCR makinesi ile reaksiyon karışımı yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştır.</li>
			<li>95 ° c 3 min için kuluçkaya ve 30 döngüleri çalıştırın (95 ° C 30 s, 15 58 ° C s, 1 dk 72 ° C). 5 min için 72 ° C'de kuluçkaya ve 4 ° C'de basılı tutun</li>
			<li>Tüm reaksiyon mix (50 μL) % 2 özel jel üzerinde çalıştırmak ve bir jel ekstraksiyon kiti ile ayıklayın. Üreticinin iletişim kuralı izleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tüp ligasyonu bağımsız (LIC) klonlama<ol>
<li>SSPI sindirim (60 μL) gerçekleştirmek: 20 μL vektörünün DNA (50 ng/μL), 10 x reaksiyon arabellek, SSPI 4 μL ve GKD2O. Incubate 3 h. tüm reaksiyon çalıştırmak için 37 ° C'de 30 μL 6 μL mix üzerinde % 1'özel jel ve bir jel ekstraksiyon kiti ile ayıklayın. Üreticinin iletişim kuralı izleyin.</li>
			<li>Yöneyin T4 DNA polimeraz tedavi gerçekleştirmek ve DNA ekleyin. Şu birleştirmek: vektör veya INSERT DNA'ın 5 μL (50 ng/μL), 10 x T4 DNA polimeraz arabelleği, dGTP (25 mM) vektör veya INSERT DNA'ın, 1 μL DTT (100 mM), 0.4 μL, T4 DNA polimeraz (LIC nitelikli), dCTP (25 mM) 1 μL 1 μL 2 μL ve 9,6 μL GKD2O. Incubate reaksiyonlar, oda sıcaklığında 20 dakika 75 ° C'de 40 dk. ısı devre dışı bırakabilirsiniz enzim için. Not: LIC vektör ve INSERT DNA ayrı tepkileri ele alınması gerekir.</li>
			<li>Reaksiyon tavlama LIC gerçekleştirin. Şu birleştirmek: T4 tedavi Ekle DNA, LIC T4 tedavi 2 μL 2 μL vektör DNA. Reaksiyon, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bl21 dönüştürmek (DE3) E. coli hücreleri bu rekombinant plazmid ile.<ol>
<li>Yetkili hücreleri (mikro-santrifüj tüpü içinde 50 μL) buz çözme.</li>
		<li>Yaklaşık 1 μL ekleyin (50 ng), plazmid tüp içine. Hücreleri ve DNA hafifçe 2-3 kez tüp flicking tarafından karıştırın. Tüp buz 20 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Şok 42 ° c için 40 s. yer buz 2 dk. eklemek 1 mL tüp oda sıcaklığında LB medya için tekrar tüp ısı.</li>
		<li>Yer karışım tüp 37 ° C'de 250 d/d Shaker 45 dakika süreyle 150-200 µL seçimi plakalar üzerine karışımı yayılmış. Plaka ters çevir ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir koloni ve Kültür 100 mL 2YT orta 50 µg/mL sefaloridin 37 ° C'de gecede içeren hücreleri seçin. Ertesi sabah, 10 mL gecede kültür ile 50 µg/mL sefaloridin içeren 1 L 2YT orta aşılamak ve OD600 ~ 0,6 ulaşıncaya kadar 37 ° C shaker kuluçka 250 rpm'de kuluçkaya. Bundan sonra IPTG ile kültür 0.4 mM son bir konsantrasyon için ikna etmek ve başka bir 5 h 30 ° C'de için büyümek</li>
	<li>Santrifüjü 8.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından hücreleri hasat, hücreleri toplamak ve 40 mL lizis arabellek (10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL lizozim, 25 μg/mL DNaz her 10 g hücrelerde resuspend 1 mM PMSF).<ol>
<li>Sonication için 1 ile 8 dk % 65 genlik, tarafından bozabilir s s açık ve 1 kapalı. Santrifüjü 40.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de hücre artıkları çıkarın Süpernatant 0,22 mikron filtreden geçirilerek filtre ve örnek döngü içine yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füzyon proteini arındırmak, etiketi ayırmak ve hedef protein yeniden arındırmak.<ol>
<li>Ni-NTA sütun kullanarak füzyon protein arındırmak (bağlama arabellek: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl; elüsyon arabellek: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 500 mM imidazole) ve 20-250 mM imidazole doğrusal bir gradyan ile bir arıtma sistemi tarafından arındırmak.</li>
		<li>Eluted hedef protein TEV proteaz ile ayırmak (1:50 oranı) gecede 4 ° C'de</li>
		<li>Amiloz reçine sütun kullanarak bölünme tepki karışımı arındırmak (bağlama arabellek: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl; elüsyon arabellek: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM maltoz) ve Ni-NTA sütun etiketi ve TEV proteaz kaldırmak için. Hedef protein bu iki sütunu içinde akışı aracılığıyla kesir olacak.</li>
		<li>Diyaliz arabellek (10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, tuz konsantrasyonu azaltmak için β-mercaptoethanol 10 mM. karşı örnek diyaliz Örnek bir anyon Satım sütun üzerinde arındırmak (bağlama arabellek: 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 10 mM β-mercaptoethanol; elüsyon arabellek: 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 1 M KCl, 10 mM β-mercaptoethanol) tarafından 20-500 mm KCl elüsyon arabellekte doğrusal gradyan.</li>
		<li>Arıtma sürecindeki son adım, santrifüj yoğunlaştırıcı (10 kDa MWCO) kullanarak protein konsantre ve homojenliği kontrol etmek için Superdex 200 26/600 jel-filtrasyon sütun enjekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein saflığı % 15 SDS sayfa üzerinde çalıştırarak inceleyin. Not: Tüm sütunları bir bağlama akış hızı 2 mL/dk ve 4 mL/dk jel-filtrasyon 1 mL/dk dışında bir elüsyon akış hızı ile bir protein arıtma sistemi üzerinde çalışıyor.</li>
</ol>2. protein hazırlık ve kristalizasyon
<ol><li>Saf protein örnek 10 mg/ml-80 ° C'de depolamadan önce santrifüj yoğunlaştırıcı (10 kDa MWCO) ve kristalizasyon arabellek arabellek Exchange'e kullanarak konsantre</li>
	<li>Kristalizasyon tarama gerçekleştirmek (1:1 oran, 200 nL protein ve 200 nL rezervuar arabelleği) tarafından oturma 295 k bir 96-iyi biçimde robotik sistem işleme bir otomatik sıvı kullanarak birkaç kristalizasyon kitleri ile buharı difüzyon yöntemi bırak. Not: Moleküler boyutları ve Hampton Araştırma Kitleri kullandık ve Gryphon otomatik sıvı işleme sistemi.</li>
	<li>Buharlaşma önlemek ve protein bırak rezervuar arabellek ile denge etkinleştirmek için 96-şey kristalizasyon plaka mühür. Daha sonra plakaları 18 ° C'de kristal kuluçka makinesine tutmak</li>
	<li>Düzenli olarak kristal oluşumu ve büyüme izlemek için hafif bir mikroskop kullanarak 96-şey plakaları kontrol edin.</li>
	<li>Protein kristalleri tuz kristallerinin ayırt etmek için bir protein boya kullanın. Boya 1 µL hedef damla ekleyin. Yaklaşık 1 saat bekleyin ve mikroskop altında gözlemlemek. Protein kristalleri mavi dönecek.</li>
	<li>Daha fazla asılı kullanarak kristallerin en iyi duruma getirmek için olumlu kristalizasyon koşullar (1.5 M amonyum sülfat, 0.1 M Tris pH 8.0) kullanma 24-şey levha buharı difüzyon yöntemi bırak.<ol>
<li>PH 7,0 üzerinden 8,5 0,5 pH birim aralığı ile için her adımda en iyi duruma getirme. Konsantrasyonu 1.7 m 1.2 m amonyum sülfat 0,1 M aralığı ile her adım optimize edin. (Bizim durumumuzda büyük levha biçimli kristaller üreten en iyi durumda 0.1 M HEPES pH 7,0 ve 1.6 M amonyum sülfat idi)</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kristal montaj, x-ışını veri toplama ve yapı belirlenmesi
<ol><li>Bir cryoloop kristaller ve flash-serin sıvı azot % 20 gliserol cryo-koruyucu olarak içeren rezervuar çözüm kullanarak bağlayın. Unipuck depolama ve nakliye için kristalleri yerleştirin.</li>
	<li>Protein kristalleri Rigaku in-house x-ışını diffractor kullanarak önceden görüntüleme. (Bizim veri kümesi BL17U1 Shanghai sinkrotron radyasyon tesisi de toplanmıştır) en yüksek çözünürlükler için veri toplama sinkrotron tesisleri ile en iyi olanları seçin.<ol>
<li>Mount ve kristalleri otomatik veya el ile ortalama işlevi tarafından merkezi BluIce26 beamline kontrol yazılımı kullanın. Başlangıç açısı, pozlama süresi, dedektör mesafe, çerçeve genişliği ve numaraları da dahil olmak üzere veri toplama stratejisini belirlemek için test Etkilenmeler gerçekleştirin.</li>
		<li>Veri kümesi buna göre toplamak (1 s çekim hızı, 1 ° çerçeve genişliği ve dedektör mesafesi 350 mm 180 çerçevelerle topladığımız).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dizin, entegre ve HKL2000 Süit27kullanarak veri kümesi ölçek. İlk kırınım noktalar bulmak için en yüksek arama iþlevini gerçekleþtirmek ve noktalar dizin ve doğru alan grubunu seçin. Tepe Tümleştirme sonra veri kümesi uygun hata modeli ile ölçekli ve çıkış .sca dosyayı kaydedin.</li>
	<li>Moleküler değiştirme fazer28 PHENIX29kullanarak tarafından faz sorunu çözmek.<ol>
<li>Xtriage30' protein molekülleri asimetrik biriminde mümkün kopya sayısını hesaplayın.</li>
		<li>Edebiyat veya modelleri yapısı tahmin Phyre231 gibi sunucu tarafından üretilen bilinen yapıları kullanarak hedef protein olarak yüksek sıra kimlik ve yapısal benzerlik ile uygun yapısı şablonları için bak (tavşan RyR1 nöral tüp defekti kullanılan olarak bir ara modeli, PDB kimliği 2XOA).</li>
		<li>Fazer kırınım veri dosyası, şablon yapısı dosyası ve protein dizi dosya bulmak belgili tanımlık eriyik kullanarak çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer çıkış dosyasından ve hedef protein sıra dosyasından kullanarak ilk modeli oluşturmak için PHENIX29 AutoBuild32 gerçekleştirin.</li>
	<li>El ile Coot33 kullanarak değiştirilmiş deneysel elektron yoğunluğu yapısını oluşturmak ve phenix.refine34 yinelemeli döngüleri kullanarak rafine.</li>
	<li>PHENIX18' doğrulama Araçları'nı kullanarak son modeli doğrulama.</li>
</ol>

<ol><li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li>
<li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor%2Fcalcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li>
<li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+ryanodine+receptors%3A+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li>
<li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+spread%2C+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li>
<li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%2C+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li>
<li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+%28L.%29+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li>
<li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li>
<li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer%2C+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li>
<li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li>
<li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li>
<li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506(2013).</li>
<li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397(2014).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors%3A+insights+into+disease+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li>
<li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li>
<li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/cr201699">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamondback+moth+ecology+and+management%3A+problems%2C+progress%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors%3A+Insights+into+Disease+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li>
<li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li>
<li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HKL-3000%3A+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.378.2281&rep=rep1&type=pdf">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+model+building%2C+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li>
<li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coot%3A+model-building+tools+for+molecular+graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li>
<li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yazıda, recombinantly express, arındırmak, kristalize ve DBM RyR nöral tüp defekti yapısını belirlemek için bu yordamı açıklar. Kristalizasyon için yüksek çözünürlük, saflık ve homojenliği ile protein elde etmek çok önemli bir gereksinimdir. Bizim iletişim kuralında, bir hexahistidine etiketi ve MBP etiketi, ikisi de daha yüksek bir kat saflık elde etmek arıtma için yararlanılabilir içerdiğinden evde beslenen hayvan-28a-HMT vektör kullanmayı seçtiniz. Ayrıca, hedef protein çözünürlük MBP etiketi AIDS. Son derece saf v...

Ryanodine reseptörleri (RyRs) Permeasyon Ca2 + iyonlarının kas hücrelerindeki sarcoplasmic retikulum (SR) membranlar arasında arabuluculuk belirli iyon kanalları vardır. Bu nedenle, işlem kaplin uyarma daralmaya önemli bir rol oynuyorlar. İşlevsel haliyle, bir homo tetramer moleküler kütlesi ile olarak RyR çeviren > her alt birim ~ 5000 amino asit kalıntıları eklenmesi oluşan ile 2 MDa. Memelilerde, üç izoformlarının vardır: RyR1 - kas iskelet tipi, RyR2 kalp kası tipi ve RyR3-ubiquitously farklı dokular1' dile getirdi.
Böcekler RyR, kas ve sinir dokusu2' de gösterilen tek bir türü yoktur. Böcek RyR memeli RyR2 bir sıra kimliğini yaklaşık % 47 ile daha benzer3. Diamide böcek RyR Lepidoptera ve Coleoptera hedefleyen geliştirilmiştir ve Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) ve Syngenta (cyantraniliprole) gibi büyük şirketler tarafından pazarlanan. Nispeten son başlatılmasından bu yana, diamide böcek böcek öldürücüler en hızlı büyüyen sınıf biri haline gelmiştir. Şu anda, bu üç böcek öldürücüler yıllık satış 2009 yılından bu yana (Agranova) 2 milyar ABD Doları % 50'den fazla bir büyüme oranı ile kesişti.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu böcek öldürücüler4,5,6,7,8kullanımı, birkaç kuşak sonra böceklerde direnç gelişimi bildirdin. Direnç mutasyonlar transmembran etki alanındaki RyRs diamondback güve (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) ve domates leafminer ilgili pozisyonlarda, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) bu bölge göster Bu bölge kanal4,8,9geçişi için kritik olduğu bilinmektedir olarak diamide böcek ilacı bağlamasında dahil olabilir. Bu alanda kapsamlı bir araştırma rağmen diamide böcek öldürücüler tam moleküler mekanizmaları zor kalır. Ayrıca, direnç mutasyonları diamides ile etkileşimi doğrudan veya allosterically etkiler belirsizdir.
Daha önceki çalışmalar memeli türlerden birkaç RyR etki alanı yapısını ve yapısı tam uzunlukta memeli RyR1 ve RyR2 x-ışını kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu, sırasıyla10,11tarafından bildirdin, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Ama şimdiye kadar hiçbir yapısını böcek RyR, bizi moleküler inceliklerini reseptör işlevinin yanı sıra böcek ilacı eylem moleküler mekanizmaları ve böcek ilacı direnç gelişimi anlamak yasaklayan bildirilmiştir.
Bu makale, biz N-terminal β-trefoil etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve, yıkıcı bir haşere turpgillerden bitkileri dünya çapında22bulaşmasını gelen yapısal karakterizasyonu için genel bir iletişim kuralı mevcut. Yapı dizayn edilmiştir yayımlanan tavşan RyR1 nöral tüp defekti kristal yapıları23,24ve cryo-EM yapısal modelleri16,17,18,19, göre 20 , 21. bu böcek RyR, hangi kanal geçişi için mekanizma ortaya çıkarır ve uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım kullanarak species-specific böcek öldürücüler geliştirmesi için önemli bir şablon sağlar için bildirilen ilk yüksek çözünürlüklü yapısıdır. Yapısı aydınlatma için 'altın standart' protein yapı tayini için atomik çözünürlük yakın olarak kabul edilir x-ışını kristalografisi çalıştırmaya başladık. Kristalizasyon işlem öngörülemeyen ve emek yoğun olmakla birlikte, adım adım bu protokolü araştırmacılar hızlı, arındırmak ve böcek RyR ya da herhangi bir diğer proteinler diğer etki alanlarındaki genel olarak karakterize etmek için yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>pET-28a-HMT vektörü</td><td></td><td></td><td>Bu modifiye pET vektörü, N-terminalinde bir hekzahistidin etiketi, bir MBP füzyon proteini ve bir TEV proteaz bölünme bölgesi içerir (Lobo ve Van Petegem, 2009)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) suşu</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>HisTrapHP sütunu (5 mL)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>Amiloz reçine sütunu</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Q Sefaroz yüksek performanslı kolon&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Amicon yoğunlaştırıcılar (10 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 26/600 jel filtrasyon kolonu&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik sıvı işleme robotik sistemi&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>Monteli CryoLoop - 20 mikron</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Puck dewar yükleme aracı</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>Nano damla</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop Bir</td><td></td></tr><tr><td>Kristal inkübatör</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>X-Işını difraktörü</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>Eppendorf</td><td>Nexus GX2</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid mini hazırlık kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyonu kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI kısıtlama endonükleaz</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraz</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Bilimsel Kimyasal</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>Sorvall LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>Protein arıtma sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta Saf</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>IzIt kristal boya</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez ünitesi</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı İnkübatör</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>İndeks kristal ekran</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Yapı kristal ekran</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>ProPlex kristal ekran</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>PACT premier kristal ekran</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus kristal ekran</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

n-terminal etki alanı ryanodine reseptör plutella xylostella gelen kristal yapısı

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Güçlü ve verimli böcek böcek ryanodine reseptörleri (RyRs) hedefleme geliştirilmesi tarımsal haşere kontrolü alanında büyük ilgi olmuştur. , Birkaç diamide böcek haşere RyRs ticari hedefleme bugüne kadar olan 2 milyar dolarlık yıllık gelir elde. Ama eylem RyR hedefleme böcek öldürücüler, modu, anlama böcek RyR ilgili yapısal bilgi eksikliği ile sınırlıdır. Bu sırayla anlama zararlıları böcek ilacı direnç gelişimi sınırlar. Diamondback güve (DBM) da diamide böcek öldürücüler direnç göstermek için rapor yok turpgillerden bitkileri dünya çapında, yıkıcı bir zararlı olduğunu. Bu nedenle, roman böcek öldürücüler DBM RyR, özellikle geleneksel diamide bağlama Web sitesinden farklı bir bölge hedefleme hedefleme geliştirmek için pratik büyük önem taşımaktadır. Burada, yapısal olarak RyR DBM üzerinden N-terminal etki alanını tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut. X-ışını kristal yapısı moleküler yedek bir çözünürlükte tarafından çözüldü 2,84 Å, hangi, bir beta-trefoil katlama motif ve bir kanat alpha sarmalının gösterir. Bu iletişim kuralı ifade, arıtma ve diğer etki alanları veya proteinler yapısal karakterizasyonu için genel olarak adapte edilebilir.

Arıtma
DBM RyR N-terminal etki hexahistidine etiketi, MBP etiket ve TEV proteaz bölünme site bir füzyon proteini olarak ifade edildi. Kristalizasyon amaç için uygun bir son derece saf protein elde etmek için beş adım arıtma strateji takip ettik. İlk başta, Füzyon proteini hücre lysate çözünür kısmını Ni-NTA sütun (HisTrap HP) tarafından saflaştırıldı. Ardından, Füzyon protein TEV proteaz bölünme için maruz kaldığı ve hexahistidine-...

Bu makalede, protein ifade, arıtma, kristalizasyon ve yapı tayini N-terminal etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve (Plutella xylostella) üzerinden iletişim kuralları açıklar.

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Ryanodine reseptör etki alanının yapısını çözmek, protein fonksiyonunun moleküler mekanizmasını, insektisit eylemini ve insektisit direnci gelişimini anlamamıza yardımcı olabilir. Bu ölçü, yakın atomik çözünürlükte protein yapısı tayini için altın standart olarak kabul edilen yapı illüstrasyonu için X-ışını kristalografisinin kullanılmasını ifade eder. Böcek ryanodin reseptör etki alanının bu yüksek çözünürlüklü yapısı kanal gating mekanizmasını ortaya koymaktadır ve yapı tabanlı ilaç tasarım yaklaşımları kullanarak türe özgü insektisitlerin gelişimi için önemli bir şablon sağlar.Potansiyel protein kristalografları biyokimya, biyofizik, bilgisayar bilimleri ve matematik te yeterli olmalıdır, çünkü genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek. Polimeraz zincir reaksiyonu ile ilgi proteinine karşılık gelen DNA'yı yükselterek başlayın. Reaksiyonsonunda, reaksiyon karışımının tümünü %2 agarose jel üzerinde çalıştırın ve standart protokollere göre jel çıkarma kiti ile DNA ayıklayın.Daha sonra, vektör DNA'sının 20 mikrolitresini 6 mikrolitre 10X reaksiyon tamponu ve 4 mikrolitre SspI restriksiyon enzimini 30 mikrolitre çift distile su ile karıştırarak LIC vektör DNA'sını doğrusallaştırın. Bu reaksiyon karışımını 37 derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti ile doğrusallaştırılmış vektör DNA çıkarma, bir % 1 agarose jel üzerinde tüm reaksiyon karışımı çalıştırın.Daha sonra, standart protokollere göre doğrusallaştırılmış vektör DNA'sının 5 mikrolitresi ve PCR güçlendirilmiş insert DNA üzerinde ayrı T4 DNA polimeraz tedavileri yapın. Oda sıcaklığında 40 dakika kuluçka, ardından 75 santigrat derecede 20 dakikalık enzim ısı inaktivasyonu. Ligasyondan bağımsız klonlama reaksiyonunu, oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için T4'ün 2 mikrolitresi ile t4 tedavi edilen insert DNA'sının 2 mikrolitresini birleştirerek gerçekleştirin.BL21(DE3)E. Coli hücrelerini rekombinant plazmid ile dönüştürmek için, buz üzerindeki 50 mikrolitre yetkili hücreyi eritin ve tüpe yaklaşık 1 mikrolitre annelik plazmid ekleyin. Hücreleri ve DNA'yı karıştırmak için tüpü 2-3 kez hafifçe kaydırın ve tüpü 20 dakika boyunca tekrar buza yerleştirin.Kuluçka sonunda, 42 santigrat derecedeki hücreleri 40 saniye boyunca ısı şoku, ardından iki dakika sonra buza geri döndü. Sonra, tüp oda sıcaklığında LB orta bir mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece 45 dakika boyunca 250 RPM shaker hücreleri yerleştirin. Sallayarak kuluçka sonunda, plaka 150-200 mikrolitre bu karışımın seçim plakaları üzerine, ve 37 santigrat derece bir gecede plakaları ters.Ertesi gün, kültür 2-YT orta 100 mililitre tek bir koloni, kanamisin ile takviye, bir shaker inkübatör bir gecede 37 derece santigrat. Ertesi sabah, 2-YT orta bir litre inoculate, kanamisin ile takviye, gecede kültür 10 mililitre ile, ve OD600 okuma yaklaşık ulaşana kadar sallayarak 37 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, IPTG ile kültürü 0.4 milimolar son konsantrasyona ikna ve 30 santigrat derece beş saat boyunca hücreleri büyümek.Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj le hasat edin ve peleti 40 mililitre likis tampon konsantrasyonu başına 10 gram bakteriye yeniden askıya alın. Hücre duvarlarını %65 genlikte sonication ile bozun ve bir saniye kapalı bir saniye, sekiz dakika boyunca. Santrifüj ile hücre enkaz kaldırın.Ardından, 22 mikrometrelik bir filtre olsa da süpernatant'ı filtreleyin ve çözümü bir örnek döngüye yükleyin. Füzyon proteinini arındırmak için, örnek döngüden filtrelenmiş süpernatantı 20 ila 250 milimolar imidazol lineer gradyan ile arıtma sistemi üzerinde beş mililitrenini-nitrolotriacetic kolona enjekte edin. Cleave tütün etch virüs proteaz ile eluted hedef protein, bir-to-50 oranı, bir gecede 4 santigrat derece, ve bir amylose reçine sütunüzerinde dekolte reaksiyon karışımı arındırın, ve bir nikel-nitroriacetic sütun, etiketi ve tütün etch virüs proteaz kaldırmak için.Tuz konsantrasyonunu azaltmak için diyaliz tamponuna karşı nikel-nitrolotriacetic kolondan akan akışı diyalize verin ve elüsyon tamponunda 20 ila 500 milimolar potasyum klorür lineer bir degrade ile bir aniyon değişim sütunundaki numuneyi arındırın. Sonra, bir santrifüj konsantratörü protein konsantre. Homojenliği kontrol etmek için konsantre proteini Superdex 200 26/600 jel filtrasyon sütununa enjekte edin ve proteinin saflığını %15 SDS-PAGE ile değerlendirin.Proteini kristalizasyona hazırlamak için, saflaştırılmış protein örneğini santrifüj konsantratöründe mililitre başına 10 miligrama konsantre edin ve 80 santigrat derece depolamadan önce tampon değişimini kristalizasyon tamponuna verin. Kristalizasyon taraması yapmak için, 295 Kelvin'de birkaç kristalizasyon kitleri ve 96 kuyulu formatta otomatik sıvı işleme sistemi ile oturma damlası buhardifüzyon yöntemini kullanın. Damla ayarının sonunda, buharlaşmayı önlemek ve rezervuar tamponu içindeki protein damlasının dengelemesini sağlamak için 96 kuyulu kristalizasyon plakasını kapatın.Plakaları 18 derecede kristal bir kuluçka makinesine yerleştirin. Kristal oluşumunu ve büyümesini izlemek için plakaları ışık mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edin. Tuz kristalleri protein kristalleri ayırt etmek için, hedef damla protein kristal boyabir mikrolitre ekleyin ve bir saat sonra mikroskop altında kristalleri gözlemlemek.Protein kristalleri mavi görünür. Kristalleri daha da optimize etmek için, pozitif kristalizasyon koşullarını ve 24 kuyulu plakalarda asılı damla buhardifüzyon yöntemini kullanın, ardından 18 santigrat derecede kristal kuluçka makinesinde kuluçka yada. Protein yapısını belirlemek için, sıvı nitrojende flaş soğutma için bir ışık mikroskobu altında bir kriyoloop kristalleri monte ve depolama ve taşıma için bir unibuck kristalleri yerleştirin.Kristalleri monte etmek ve merkeze almak için manuel merkezleme işlevini kullanarak, kristalleri şirket içi X-ışını difaktöründe ön ekrana getirin. Ardından, verileri toplamak için X-ışını kırınım yazılımını kullanın. HKL-2000 paketini kullanarak veri kümesini dizine koymak, tümleştirmek ve ölçeklendirmek için önce dedektörü seçin ve veri kümesini yükleyin.Daha sonra, kırınım lekeleri bulmak için tepe arama işlevini yürütmek. Noktaları dizine dizine ekin, doğru boşluk grubunu seçin ve en yüksek tümleştirmeyi gerçekleştirin. Ardından, veri kümesini ölçeklendirin.Hata modelini yeniden ayarlayın ve ölçeklendirin. Çıktı sca dosyasını kaydedin. Phenix yazılım paketini kullanarak yapıyı belirlemek için yeni bir proje oluşturun.İlk olarak, asimetrik birimdeki protein moleküllerinin olası kopya sayısını hesaplamak için Extriage'ı sca dosyasıyla çalıştırın. Daha sonra, moleküler değiştirme ile faz problemini çözmek için Phaser'ı çalıştırın, kırınım veri dosyasını kullanarak Phaser'ı çalıştırın, hedef protein olarak yüksek sıralı kimlik ve yapısal benzerliğe sahip şablon yapı dosyası ve çözüm bulmak için protein dizisi dosyası. Phaser'dan gelen çıktı dosyasını ve hedef proteinden gelen sıra dosyasını kullanarak ilk modeli oluşturmak için Phenix'te otomatik yapı yı gerçekleştirin.Yapıyı COOT kullanarak modifiye edilmiş deneysel elektron yoğunluğuna elle oluşturun ve yinelemeli döngülerde Phenix rafine kullanarak rafine edin. Phenix'teki doğrulama araçlarını kullanarak son modeli doğrulayın. Bu temsili deneyde, diamondback güve ryanodin reseptör proteininin son terminal etki alanının saflaştırılması, gösterildiği gibi, STS-PAGE analizi ile yaklaşık 21 kilodalton tek bir bant vermiştir.Jel filtrasyon sütunundan gelen elüsyon hacmi saflaştırılmış ryanodin reseptör son terminal etki alanının monomer olduğunu doğruladı. Kristalizasyon için, yüksek kaliteli plaka şeklinde kristallerin oluştuğu en uygun koşullar pH 7'nin 1 azı HEPESi ve 1.6 molar amonyum sülfat varlığında ydı. Gösterildiği gibi yazılımları kullanan kırınım veri setinden protein yapısının belirlenmesi, 1'den 205'e kadar kalıntıları kapsayan diamondback güve ryanodin reseptör son terminal etki alanını ortaya çıkarmıştır.Büyük bozukluğu, esnek bölgeleri veya zayıf yakınlıkları olan proteinlerkristalize etmek zordur. Bu senaryolarda, yüzey entropisi azaltma, döngü kesilme ve çapraz bağlama gibi protein mühendisliği stratejileri, daha iyi protein kristalleri elde etme olasılığını artırabilir. Yüksek çözünürlüklü protein yapılarını ortaya çıkarmanın yanı sıra, X-ışını kristalografisi de protein-pestisit etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir, hangi yapı tabanlı pestisit tasarımı ile yardımcı olabilir.

crystal-structure-n-terminal-domain-ryanodine-receptor-from-plutella

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp).

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Keşfedin Plutella xylostella ryanodin reseptörünün N-terminal etki alanının kristal yapısını X-ray kristalografisi ile belirleme yöntemini. Bu yapısal biyoloji tekniği, insektisit direnci mekanizmalarını anlamaya ve tür-spesifik böcek ilaçları geliştirmeye yardımcı olur.

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Daha fazla video keşfet