Name: HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Keşfedin CRISPR-Cas9 ile HIV-1 proviral entegrasyon modelleri oluşturmayı. Jurkat hücrelerinde spesifik genomik lokuslara hedeflenen reporterler sayesinde gen ifadesi üzerindeki etkileri inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Britta Weseloh ve Bettina Abel teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz de Arne Düsedau ve Jana Hennesen (akış sitometresi teknoloji platformu, Heinrich Pette Institut) Teknik destek için teşekkür ederiz.

1. Mühendislik ve vektör (tv) tasarımı hedefleyen genom için strateji hedefleme
Not: İlk adım genom mühendislik seçimi ve CRISPR-Cas9-aracılı hedefleme için gerekli araçları nesil içerir. Genomik tümleştirme sitesi locus yelpazesi, hedefleme için hücre tipi seçimi ve tasarım bir HIV kaynaklı muhabiri tümleştirme için bu adımı öncesinde. Bu iletişim kuralı bir HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA en az muhabir Jurkat hedef hücrelere hedefleme açıklar. CRISPR-Cas9-esaslı hedefleme, üretimi, tarama ve klonal satırları doğrulanması için iş akışının bir akış şeması Şekil 1' de tasvir edilir. S. pyogenes Cas9 açıklanan hedefleme stratejisi kullanır (SpCas9) gRNA Yönetmen: dsDNA sonları seçili tümleştirme sitesinde oluşturmak için. Muhabir sonra sözde 5' ve 3' Homoloji silah (HA)11tarafından çevrili muhabir sıra içeren bir sigara Doğrusallaştırılmış hedefleme vektör (tv) sağlayarak Homolog rekombinasyon yoluyla seçilmiş genomik locus içine hedeflenmektedir.
<ol><li>
Çeşitli hedeflenen odağı, gRNA ve vektör tasarımı hedefleme
	<ol>
<li>Thegenomic odağı olmak hedef için bireysel bilimsel soru üzerine dayalı seçin. Tekrarlayan tümleştirme site HIV yayımlanmış listesi bulunan hastalarda farklı kullanım olarak2,3,4,5,6,7,8 çalışmalar bir kılavuz. Silico ayıklamak hedeflenen (dizisi tam gen) veya en az 5 kb genomik sırası olmak istenen genomik locus genomik dizisi UCSC genom tarayıcı (http:// genome.edu.ucsc.edu) kullanarak.</li>
		<li>20 (gRNAs) RNA'ların Kılavuzu seçin E-net webtool (http://www.e-crisp.org) kullanarak seçilen genomik odağı hedefleme için nt.<ol>
<li>"Homo sapiens GRCh38" organizma olarak seçin. 1.1.1. adımda elde istenen genomik locus kapsayan genomik sırası giriş 2.000 bp.</li>
			<li>(Herhangi bir PAM, herhangi bir 5' temel, hedefleri kapalı uyuşmazlıkları tahammül ve intron/CPG Adaları hariç) orta uygulama ayarları kullanarak bir gRNA arama başlatın. Mümkün gRNA tasarımları ile liste görünür sıralama yüksekten özgüllük ve verimliliği için bir puan daha düşük.</li>
			<li>Tercihen özgüllük ve verimliliği yüksek bir puan gösterir ve var olmak hedef için istenen genomik odağı için mümkün olduğu kadar yakın olan bir gRNA seçin. Not: Bulunmak istenilen genomik locus yakınlığı ve belirli ve verimli gRNA tasarımını arasında bir uzlaşma vardır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Patlama seçilen gRNA dizi benzersizliğini gRNA bağlama sitesini kontrol etmek için NCBI patlama tarayıcı (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) kullanarak başvuru genom karşı.<ol>
<li>"İnsan genom" seçin. Sorgu sırası gRNA sýrasýný girdi. "Son derece benzer dizileri" seçin (megablast) programı olarak. GRNA sıra benzersiz olduğundan emin olun. Aksi takdirde, farklı bir gRNA tekrar adım 1.1.2.3 ve patlama açmadı.</li>
		</ol>
</li>
		<li>GRNA dizisi seçilir sonra silico 1000 bp akış yukarı ve aşağı akım gRNA sırası 1.1.1. adımda 5' ve 3' HA buna göre çıkarılan genomik serisinden seçeneğini belirleyin. Not: GRNAs seçilen genomik tümleştirme sitesi locus homolog olmalı ve bitişiğindedir ve protospacer bitişik motifi (PAM; örneğin, NGG SpCas9 için) (Şekil 2a). Tv 5' ve 3' HAs tarafından çevrili olan muhabir sırasını içerir. Kapak 1000 bp akış yukarı ve aşağı akım gRNA sıra11vardır. Tam gRNA sıra içinde HA dahil edilmemesini. 5'e kadar bir çakışma nt olan kabul edilebilir (Şekil 2a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nesil gRNA ve vektörel çizimler hedefleme Not: İçin vektör düzenleri, Şekil 2bbakın.<ol>
<li>SpCas9 ve gRNA ifadesi için bir vektör üretmek için pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 hangi SpCas9 ve tek Kılavuzu RNA (sgRNA) aynı anda ifade edilebilir bel kemiği olarak kullanın. GRNA sıra omurga içine clone BbsI kısıtlama siteleri12kullanın.</li>
		<li>Tv üretmek için bir yüksek-kopya plazmid bel kemiği olarak (, pMK veya cDNA3.1 gibi) seçin.<ol>
<li>İlk olarak, muhabir montajı (Bu protokol: LTR_tdTomato_BGH-PA) yapı omurga Gibson derleme clong ile içine klonlama ticari bir derleme kullanarak13 kiti ve 5' ve 3' kısıtlama siteleri kanat tanıtmak (örneğin, 5' PacI ve 3' SmaI) sonraki kısıtlama sindirim HAs klonlama için.</li>
			<li>1000 bp, adım 1.1.4 genomik DNA (gDNA) seçilen HA parçacıkları var olmak hedef için hücre türü yükseltmek (Bu protokol: Jurkat hücreleri) etkinlik düzelti ile DNA polimeraz kullanarak (bkz: Tablo 1 ve 2 için PCR malzemeler ve «««Bisiklet) koşulları. O zaman, kısıtlama siteleri her HA (PacI üzerinde 5' HA her iki ucundaki SmaI üzerinde 3' HA her iki ucundaki) 5' ve 3' ucunda kanat muhabir tanıtmak.</li>
			<li>Sırayla klon zaten Restriksiyon enzimi tarafından14,15klonlama (1.2.2.1 adımda oluşturulan) muhabir içeren yapı omurga içine vardır. İlk olarak, 5' HA klon PacI kısıtlama sites'ı kullanarak, sonra 3' HA klon SmaI kısıtlama sites'ı kullanarak. Not: Tv omurga ek bir floresan muhabir içeriyorsa, istenmeyen omurga tümleştirme akış sitometresi tarafından tespit edilebilir (3.2.2 ve 3.2.3 adımlara bakın). TV omurga floresan hiçbir gazeteci içeriyorsa, omurga tümleştirme, PCR kullanarak değerlendirilmesi gerekir (bkz. Adım 3.2.8).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58572/58572fig1.jpg"> Şekil 1: CRISPR-Cas9-aracılı hedefleme, üretimi ve klonal muhabir yelpazesi için iş akışı hatları ile tanımlanmış tümleştirme site. (A)hedef vektör oluşturmak ve Jurkat T hücreleri hedef vektör ve Cas9/gRNA ifade plazmid transduce. (B) zenginleştirin transfected hücreleri 72 h mesaj transfection FACS tarafından. Hücreleri 10-14 gün boyunca büyümeye ve oluşumu olayları PCR tarafından hedefleme onaylamak ve akış sitometresi (C) Let. 3 hafta boyunca tek hücre klonlar seyreltme ve izin klonlar sınırlandırarak büyümeye (D) oluştur. (E) doğru PCR tarafından hedefleme için klonlar ekran ve akış sitometresi 96-şey biçiminde. Seçili klonlar genişletin. (F) Doğrula Southern blot, PCR ve sıralama ve Cas9 endonükleaz faaliyet hedef dışı olayların analizi tarafından seçilen klonlar hedefleme doğru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58572/58572fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58572/58572fig2.jpg"> Şekil 2: strateji ve vektör tasarım hedefleme. (bir) gRNA ve Homoloji silah seçimi. 20 nt gRNA seçilen genomik hedef siteye homolog olması ve silah için 1000 bp up - tamamlayıcı ve gRNA aşağı ve gRNA sıra içermemesi gerekir bir mısınız Homoloji bitişik. (b) şemaları vektör ve gRNA/Cas9 vektör hedefleme. Hedefleme vektör 5' ve 3' Homoloji kolu tarafından çevrili olan seçilmiş muhabir sırasını oluşur. GRNA/Cas9 vektör pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 omurga üzerinde temel alır. (c) tarafından Homolog rekombinasyon hedefleme şematik. Hedef vektör ve guideRNA/Cas9 vektör Jurkat hücrelere transfected. Cas9 aracılık eder genomik hedef site Çift Kişilik strand tatilinde (belirttiği *) ve Homolog rekombinasyon ve genomik hedef locus muhabir dizisi entegrasyonunu kolaylaştırır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58572/58572fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
2. CRISPR Cas9-tabanlı Jurkat hücrelerinin hedefleme
<ol><li>
Jurkat hücre transfection
	<ol>
<li>RPMI % 10 (v/v) fetal buzağı serum (FCS) ile ve 4 mM L-glutamin ["RPMI w.o. antibiyotik (AB)" 6-şey hücre kültür plaka kuyu sevk] 1640 2.5 ml 24 saat önce transfection, Plaka 1,25 x 106 Jurkat T hücreleri. Tek bir hedefleme deneme için bir tam 6-şey plaka hazırlamak (yani, 6 kuyuları her hücre süspansiyon 2.5 mL).</li>
		<li>Ertesi gün, dairesel tv ve pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/Jurkat hücreler için belirli bir transfection reaktif kullanarak gRNA hücrelerle birlikte transfect.<ol>
<li>2 µg dairesel TV ve pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA şey başına 2 µg ticari RPMI orta 250 µL için indirimli serum konsantrasyonu transfection (RPMI serum % 50 azalma) için en iyi duruma getirilmiş bir tepki tüp ve karıştırmak iyi olarak ekleyin.</li>
			<li>Transfection reaktif 12 µL yavaş ekleyin DNA/orta olarak tüp duvarına dokunmadan ve girdap. 15 dakikadır kuluçkaya ve dropwise hücrelerinin bir şey eklemek karışım izin. 37 ° C ve % 5 CO2hücreleri kuluçkaya. Not: Tepki transfection hazırlanması ölçeklendirilebilir. Hiçbir orta değiştirmek transfection sonra gereklidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zenginleştirme floresans aktif hücre (FACS) sıralama transfected hücre
	<ol>
<li>72 h sonrası transfection, havuz transfected hücreleri, onları saymak ve zenginleştirme FACS tarafından hazırlamak. 50 mL konik Tüp, santrifüj vasıl 300 x g ve oda sıcaklığında (RT) içinde hücreleri toplamak için 4 dk, PBS hücrelerde bir kez yıkamak, tekrar santrifüj kapasitesi, 1 x 10 Pelet FACS arabellek (PBS takıma % 1 FCS + 1 mM EDTA ile) uygun bir miktarda askıya 7 hücre/mL ve nihayet bir FACS tüp içine aktarın.</li>
		<li>Hücreleri FACS için konu ve bu da tv (örneğin, tdTomato bu protokolü) Floresan muhabir hızlı sıralayın. RPMI % 10 FCS, 4 mM L-glutamin ve 50 U/mL penisilin ve streptomisin ("RPMI w / AB" anılacaktır) ile takıma 1640 hücrelerde toplamak.</li>
		<li>Sıralama FACS sonra bir kez 20 mL RPMI w / AB sıralanmış hücrelere ekleyerek hücreleri yıkayın ve 300 x g 4 dk RT. Resuspend az için de AB w / RPMI uygun bir miktarda hücre Pelet santrifüj kapasitesi ve hücre kültür plaka ile bir şey hücrelerde plakası uygun birim hücre sayı yazı-FACS göre. Not: Kültür küçük hacimli (örneğin, </li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li></li><li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li></li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><ol><li><li></ol></li><li></li><li><li></li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li>
<li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498(2017).</li>
<li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li>
<li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4%2B+T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li>
<li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li>
<li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li>
<li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li>
<li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li>
<li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li>
<li>ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013).</li>
<li>Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ ">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ </a> (2013).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+intuitive%2C+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+%28PLoS%29+ONE%22%5BJournal%5D)">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li>
<li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).</li>
<li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li>
<li>Jensen, K. T., Fløe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li>
<li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+CD4+%2B+T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li>
<li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+effects+influence+HIV+latency+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik uygulama seçilen proviral tümleştirme sitelerle HIV-1-türetilmiş Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için bir protokol açıklayın.
İletişim kuralı birkaç puan planlama aşamasında dikkat gerektirir. Gibi bazı loci diğerlerinden daha hedef için daha kolay olabilir ilk olarak, var olmak hedef için odağı dikkatli seçilmelidir (örneğin, bölge ve hedef kromatin durumuna bağlı olarak kendisi sıra). Tekrarlayan dizileri hedefleme vektör clone zordur...

Ana bilgisayar genom enfeksiyon üzerine proviral DNA entegrasyonu insan immün yetmezlik virüsü (HIV) yaşam döngüsünün kritik bir adımdır. Tümleştirme, HIV uzun ömürlü CD4 + T hücre alt kümeleri bellek CD4 + T hücreleri gibi gecikme süresi kurarak devam ederse. HIV tümleştirme rasgele1,2gibi görünüyor. Akut ve kronik olarak enfekte bireylerin2,3,4 entegrasyon sitelerin nasıl yapılacağını aracılığıyla çeşitli çalışmalarda yerleştirilmiştir entegre proviral DNA ile genomik etkin noktaları bir dizi algılandı ,5,6,7,8. İlginçtir, entegrasyon sitelerin bazıları enfekte hücreleri, tekrarlayan sitelerin entegrasyon klonal genişleme1olumlu etkileyebilir fikir önde gelen büyük bir kısmını aynı locus algılandı.
Tekrarlayan tümleştirme siteleri önemi bizim anlayışı ilerletmek için proviral tümleştirme site seçim keşfedilmeyi gerekir. Ancak, birkaç teknik yönleri eğitim HIV tümleştirme engel site seçimi ve sonuçları. Geniş JLat hücre hatları klinik tekrarlayan tümleştirme siteleri9yansıtmıyor gibi hücre kültür modelleri HIV gecikme süresi için kullanılır. Çalışmalar birincil hasta elde edilen hücrelerde, bir yandan, entegrasyon sitesi peyzaj açıklaması sıralama tarafından etkinleştirir, ancak fonksiyonel analiz için izin vermez. Bilgimizi, yeterli bir deneysel model işlevsel olarak seçilen klinik entegrasyon siteleri analiz etmek kullanılabilir.
Burada CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak HIV enfeksiyonu için roman modelleri oluşturmak için ayrıntılı bir iş akışı mevcut. Burada açıklanan iş akışı HIV enfeksiyonu, genomically entegre proviral muhabir seçilen tümleştirme sitesinde taşıyan model T hücre kaynaklı muhabiri hücre satırlarını oluşturmak için kullanılabilir. Böylece proviral tümleştirme sitesi HIV biyoloji nasıl etkileyebilir ve provirus farklı tedavi stratejileri (örneğin, inducibility gecikme süresi ters kayıt ajanları tarafından) nasıl yanıt vereceğini keşfetmek için yeni araçları olarak hizmet vermekteyiz. Bizim Yöntem CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik, muhabir hangi Wuppertal'de sırası Homolog rekombinasyon tarafından bir Cas9 nükleaz kaynaklı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırdı avantajları kullanır. Hedef siteleri tümleştirme için HIV enfekte bireylerin ve Cas9-aracılı genom Mühendisliği için uygun PAM motifleri varlığı üzerine çalışmalar açıklanan tekrarlayan tümleştirme sitelere yakınlık göre seçilir.
Örnek sonuçlarımızda BACH2 gen odağı, BTB ve CNC Homoloji transkripsiyon regülatör 2 için hangi kodları üzerinde odaklanmıştır. Kronik olarak HIV enfekte bireylerin antiretroviral tedavi, BACH2 zenginleştirme entegre HIV-1 dizileri3,6,7,8,10gösterilen loci biridir. Uzun terminal tekrar (LTR) HIV-1-türetilmiş, tdTomato kodlama dizisi ve sığır büyüme hormonu (BGH) Poliadenilasyon sinyal (PA), biz BACH2 intron 5 iki belirli sitelere hedef içeren en az bir HIV kaynaklı muhabir seçtik. Sunulan Protokolü Jurkat hücreleri, bir insan CD4 + T hücre kaynaklı süspansiyon hücre kültürünü, ama diğer hücre hatları kullanılabilir ve buna göre uyarlanmış protokolü için optimize edilmiştir. Biz hedef site, inşaat hedef vektörünün Homoloji silah, CRISPR-Cas9-aracılı seçilen genomik, üretimi ve site seçimi klonal satırlarının muhabir hedefleme ve kapsamlı ile seçim için ayrıntılı bir iş akışı mevcut doğrulama Yeni oluşturulan, hedeflenen muhabiri hücre satırı.

<table><tbody><tr><td>SpCas9 ve gRNA'nın ekspresyonu için</td> <td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td> vektörü</tr><tr><td>cDNA3.1</td><td>klonlama için Invitrogen</td><td>V79020</td><td>memeli ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td>kısıtlama enzimi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>NEBuilder Hifi DNA <td></td></tr><tr><td> Montaj Klonlama Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520S</td><td>Hedef vektör üretimi için kullanılan montaj klonlama kiti</td></tr><tr><td>TaqPlus Hassas PCR Sistemi</td><td>Agilent Technologies</td><td>600210</td><td>Homoloji kollarının amplifikasyonu için kullanılan düzeltme okuma aktivitesine sahip DNA polimeraz (adım 1.2.2.2), entegrasyon bölgesi ve raportör dizisinin doğrulanması (adım 3.3.3 ve 3.3.5), Southern blot için genomik prob üretimi (adım 3.4.1.5) ve hedef dışı olayların analizi için kullanılır (Adım 3.5.4)</td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakası (yuvarlak altlı)</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>seyreltme kaplaması için doku kültürü plakaları</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530 L</td><td>DNA polimeraz (adım 2.4.2) ve Southern blot için muhabire özgü prob oluşturulması (adım 3.4.1.4)</td></tr> <tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9170</td><td>PCR olarak dimetil sülfoksit katkı maddesi</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (MgCl2) Çözeltisi</td><td>New England Biolabs</td><td>B9021S</td><td>PCR katkı maddesi olarak MgCl2 çözeltisi</td></tr><tr><td>Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti Karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td>PCR reaksiyonları için her nt'den 10 mM içeren dNTP karışımı</td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>PCR</td><td></td><td>taraması için kullanılan kullanıma hazır PCR karışımı (adım 3.2.11)</td></tr><tr><td>QIAamp DNA kan mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td>DNA izolasyon ve saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR Saflaştırma Kiti</td></tr><tr><td>RPMI 1640 glutamin içermez</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td>hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Güney Afrika Şarjı</td><td>PAN Biotech</td><td>P123002</td><td>hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Biochrom</td><td>K 0282</td><td>hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin 10.000 U / mL / 10.000 ve mikro; g/mL</td><td>Biochrom</td><td>A 2212</td><td>hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>transfeksiyon için optimize edilmiş azaltılmış serum konsantrasyonuna sahip hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>TransIT-Jurkat</td><td>Mirus Bio MIR2125</td><td></td><td>transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>phorbol 12-miristat 13-asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>hücre kültürü reaktif</td></tr><tr><td>İyonomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>hücre kültürü reaktifi</td></tr><tr><td>Şırınga tahrikli filtre ünitesi, PES membranı, 0,22 ve mikro; Steril</td> filtrasyon için m <td>Millex</td><td>SLGP033RB</td><td>filtre ünitesi</td></tr><tr><td>Heracell 150i inkübatör</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026280</td><td>doku kültürü inkübatörü</td></tr><tr><td>Amershan Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1520B</td><td>DNA ve RNA lekeleme için pozitif yüklü naylon membran</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV çapraz bağlayıcı</td></tr><tr><td>High Prime</td><td>Primer</td><td>olarak rastgele oligonükleotidler kullanılarak DNA'nın radyoaktif dCTP ile etiketlenmesi için</td>Roche <td>11585592001</td> kiti</tr><tr><td>illustra ProbeQuant G-50 Mikro Sütunlar</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td>etiketli DNA'nın saflaştırılması için kromatografi spin-kolonları</td></tr></tbody></table>

hiv-1 enfeksiyonu seçili proviral tümleştirme siteleri ile jurkat muhabir modelleri oluşturmak için crispr-cas9-esaslı genom mühendislik

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) proviral DNA'sının ana hücre genomu tekrarlayan siteleri ve genomik etkin noktaları olmayan rasgele tümleştirir. Burada ayrıntılı bir protokol roman tüp bebek modelleri üretimi için HIV enfeksiyonu için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak seçilen genomik tümleştirme siteleri ile mevcut. Bu yöntemle, seçim bir muhabir dizi bir hedefli, seçilen genomik locus klinik entegrasyon siteleri yansıtan entegre edilebilir.
İletişim kuralında, HIV kaynaklı bir muhabir tasarımı ve bir hedef site ve gRNA dizi seçme açıklanmıştır. Hedefleme vektör Homoloji silah ile inşa edilmiştir ve Jurkat T hücre içine transfected. Muhabir sıra Homolog rekombinasyon bir Cas9-aracılı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırılmış tarafından seçilen genomik siteye hedeflenmektedir. Tek hücre klonlar oluşturulan ve olaylar hedefleme için ekranlı akış sitometresi ve PCR tarafından. Seçili klonlar sonra genişletilir ve doğru hedefleyen PCR, sıralama ve Southern Blot tarafından doğrulanır. CRISPR-Cas9-aracılı genom mühendislik potansiyel hedef kapalı olayları analiz edilir.
Bu iletişim kuralı, roman hücre kültür sistemleri kullanarak bu modeli HIV enfeksiyonu klinik entegrasyon sitelerde oluşturulabilir. Tek hücre klonlar oluşturma ve doğrulama doğru muhabir sıra entegrasyon zaman alıcı olsa da, elde edilen klonal satırları işlevsel olarak proviral tümleştirme site seçim analiz etmek için güçlü araçlardır.

Temsilcisi bu deneyde LTR, tdTomato kodlama dizisi ve iki loci intron 5 BACH2 gen17dizisine polyA-sinyal oluşan en az bir HIV-1-türetilmiş muhabir hedeflemek seçtiniz. Hedefleme için loci yayımlanmış tekrarlayan tümleştirme yerler HIV infekte hastaların2,4,5,6birincil T hücreleri üzerinde farklı çalışmalarda bulundu göre seçilmiş olu...

Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Bu yöntem, HIV provirüs entegrasyonunun androjen gen ekspresyonunu nasıl etkilediği ve son zamanlarda HIV ile enfekte olmuş hücrelerde bazı genomik entegrasyon alanlarının neden seçildiği sorusunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, CRISPR/Cas9 tabanlı genom mühendisliği kullanılarak seçilmiş entegrasyon bölgelerine yönelik pro-viral muhabirleri taşıyan HIV enfeksiyonu için in-vitro modellerin üretilebiliyor olmasıdır. Prosedürü gösteren Thomas Walther, bir doktora öğrencisi ve Julia Bialek, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır.UcSC Genom Tarayıcısı kullanarak hedef alınması istenen genomik lokus genomik dizisini in-silico-ayıklamak için başlayın. Seçilen genomik lokus hedeflemeiçin 20 nükleotit kılavuzu RNA'larını seçmek için E-CRISP web aracını kullanın. Sonra seçin, Homo Sapiens Genom Referans Konsorsiyumu İnsan Genomu:Build 38.Organizma olarak referans genom ve daha önce çıkarılan istenilen genomik lokusu kapsayan genomik dizinin 2,000 baz çiftini girin. Herhangi bir PAM, herhangi bir beş asal taban, off-targets uyumsuzlukları tolere ve dışlanmış introns ve CPG adaları ile orta uygulama ayarlarını kullanarak bir rehber-RNA arama başlatın. Görünen olası kılavuz-RNA tasarımları ile listeden, hedeflenen istenilen genomik lokus mümkün olduğunca yakın özgüllük ve verimlilik için yüksek puan ile bir rehber RNA seçin.Seçilen kılavuz-RNA dizisini referans genomuna karşı patlatmak için NCBI Blast tarayıcısını açın. Seçili kılavuz-RNA bağlama alanının benzersizliğini kontrol etmek için, önce genom olarak insan seçin ve ardından kılavuz-RNA dizisini sorgu sırası olarak girin. Ardından, kılavuz-RNA dizisinin benzersiz olduğundan emin olmak için program olarak son derece benzer dizileri veya Mega Blast'ı seçin.Bundan sonra, başlangıçta çıkarılan genomik diziden in-silico 1, 000 baz çiftlerini, kılavuz-RNA dizisini yukarı ve aşağı doğru seçin. Bu seçilen 1.000 baz çifti, yukarı ve aşağı akım vektör yapımı ve bitişik muhabir dizisi hedef için hedef için beş asal ve üç-prime homoloji silah olarak kullanın hedeflenecek. Jurkat T-hücrelerinin transfeksiyonundan 24 saat önce, tek bir hedefleme deneyi için hücrelerin tam 6 kuyulu bir plakasını hazırlayın.Başlamak için, plaka 1, 250, 000 hücreleri RPMI 2.5 mililitre 1640 takviyeleri ile ve antibiyotik olmadan, başına. Ertesi gün, dairesel hedefleme vektörü ve iki mikrogram Cas9 ve kılavuz-RNA ekspresyonu plazmidini, transfeksiyon için optimize edilmiş 250 mikrolitre ticari RPMI ortamına, bir reaksiyon tüpünde ekleyin ve girdap ile iyice karıştırın. Daha sonra tüp duvarına dokunmadan DNA ortamına yavaş yavaş 12 mikrolitre transfeksiyon maddesi ekleyin.Tüp ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka flick. Karışımı bir hücre kuyusuna damlayla ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Transfeksiyondan 72 saat sonra transfected hücreleri çekin, sayılayın ve FACS ile zenginleştirmeye hazırlanın. Karışık hedefli hücre popülasyonundaki hedefleme olaylarını doğruladıktan sonra, sağlıklı, tedavi edilmemiş jurkat T-hücrelerinden alınan antibiyotiklerle RPMI'yi toplayarak, jurkat koşullu ortamı önceden hazırlayarak tek hücreli klonlar üretmeye başlayın. Tüpleri 300 G'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı yeni, 50 mililitrelik konik tüplere 0,22 mikrometre filtre kullanarak 25 mililitrelik şırıngayla filtreleyin.Daha önce FACS tarafından zenginleştirilmiş hedeflenen hücreleri sayın, genişlemeden 10 ila 14 gün sonra, ve sonra rpmi antibiyotik ile seyreltmek 100, mililitre başına 000 hücre. Seyreltmek 100 mikrolitre bu hücre seyreltme ile 9.9 mililitre orta mililitre ulaşmak için 1,000 mililitre başına. Sonra mililitre başına 100 hücre konsantrasyonu için orta dokuz mililitre ile bu seyreltme bir mililitre seyreltin.Plaka 96 iyi plakalar iyi başına bir hücre içeren, hafifçe bir mililitre 100 hücre başına mililitre çözelti silikat beş mililitre orta ve dört mililitre taze orta ile karıştırın, steril bir reaktif rezervuar. Daha sonra, iyi seyreltme başına bir ve iki hücre elde etmek için yeni 96-iyi yuvarlak alt plakalar kuyu başına ilgili hücre seyreltme 100 mikrolitre eklemek için çok kanallı pipet kullanın. 96 kuyu plakasını istifleyin ve her desteyi her kuyubaşına üç mililitre PBS içeren altı kuyulu bir plakayla kaplayın.Plakaları 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksitle üç hafta kuluçkaya yatırın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, dört kat büyütme ile ışık mikroskobu kullanarak yetiştirilen kolonilerin varlığını görsel olarak doğrulayın ve yetiştirilen koloniler ile kuyuları işaretleyin. Borulama ile iyi işaretlenmiş bir hücreyi yavaşça yeniden askıya alın.Bu hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini, 100 mikrolitre RPMI'nin 100 mikrolitresini antibiyotiklerle birlikte yeni hazırlanmış 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın, her iyi ve işaretli tüm kuyular için tekrarlayın, pipetleme ile hafifçe karıştırın. Plakayı çoğaltmak için, bu hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini ikinci bir boş, 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın ve bu işlemi işaretli tüm kuyular için tekrarlayın. Son olarak, antibiyotikler ile RPMI 200 mikrolitre ile boş kuyuları doldurun.Plakaları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Yinelenen plaka 24 ila 48 saat boyunca kuluçkaya yattıktan sonra her kuyuya 100 mikrolitre RPMI antibiyotik ekleyerek tekrar kopyalanır. Yavaşça karıştırmak ve yeni bir 96-kuyu yuvarlak alt plaka her kuyuya 100 mikrolitre aktarmak için çok kanallı pipet kullanın.Bu iki plakadan birini kuvöze yerleştirin. Hücreleri uyarmak için, ilk pma / Ionomycin Master Mix beş mikrolitre ekleyerek, akış sitometri için yeni yinelenen plakalar ikinci kullanın. 24 saat kuluçka ya da metinde açıklandığı gibi akış sitometrisi için hücreleri hazırlayın.İleri ve yan dağılımboyutuna göre herhangi bir canlı tek hücre kapısı. Floresan muhabir gen ekspresyonunu akış sitometrisi ile analiz edin. PCR tarafından tek hücreli klonları taramak için, seçilen muhabir sırasına göre PCR tarama için p5 ve P6 tasarım astarları, muhabir dizisinin 500 ila 800 baz çiftleri yükseltmek için.Pozitif kontrol PCR için, p7 ve P8 tasarım astarları bir vahşi tip, hedefsiz genomik lokus 630 baz çiftleri güçlendirir. Hedefleme vektör omurga dizilerinin spesifik olmayan entegrasyonu için bir kontrol olarak hedefleme vektör omurgasının 500 ila 600 baz çiftini güçlendiren üçüncü bir astar çifti tasarla. İkinci yinelenen plakadaki klonlar yeterince büyüdükten sonra, oda sıcaklığında 300-G'de plakayı 10 dakika santrifüj ederek PCR taraması için hazırlayın.Dikkatlice supernatant çıkarmak, hücre pelet rahatsız değil emin olun. Hücreleri 100 mikrolitre PBS ile hafif pipetleme ile yıkayın ve tabağı oda sıcaklığında 300 G'da beş dakika santrifüj edin. PBS çıkarın ve kuyu başına lysis tampon 200 mikrolitre ekleyin.Pipet yavaşça karıştırın ve süspansiyonu yeni bir PCR plakasına aktarın. Plakayı parafin filmle kapatın ve bir termocycler içinde 55 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Hücre enkazını maksimum hızda 10 dakika santrifüj ettikten sonra, supernatant'ı yeni bir PCR plakasına aktarın.Her kuyuda 110 mikrolitre distile H2O ile dolu 96 kuyulu PCR plakanın her kuyuya bu hücreli lysate'den 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra bir termocycler 99 derece santigrat 10 dakika kuluçka, proteinaz K.Use 2 mikrolitre bu hücre lizat bir şablon olarak inaktive ve tarama, kontrol ve omurga PCR için ticari bir PCR ana karışımı kullanın. PCR'yi 96-iyi formatta 38 ila 40 devir PCR amplifikasyonu için çalıştırın.PCR ürünleri beş mikrolitre kullanın ve analiz etmek ve akış sitometri ve PCR sonuçlarını birleştirmek için% 1.5 agarose TAE jel üzerinde çalıştırın, tek hücreli klonlar onaylamak için. PMA/İonomisin indüksiyonu sonrası muhabir gen ekspresyonu, entegrasyon bölgesine bağlı olarak hücrelerin %4-12'sinde hem akış sitometrisi hem de PCR ile doğrulandı. Beş-prime ve üç-prime entegrasyon kavşak için astar kullanarak genomik DNA PCR analizi, hedefleme olayları meydana geldiğini doğrular.Akış sitometrisi ile doğru hedefleme için tek hücreli klonların taranması ndan sonra, yüksek, düşük ve floresan muhabir gen ekspresyonu olmayan klonlar gözlendi. Tek hücreli klonlar da PCR tarafından muhabire özgü astarlar ve kontrol astarları kullanılarak doğrulandı. Klonlar tarama PCR pozitif doğruladı harcanan ve daha güney leke tarafından doğru hedefleme için analiz, bir muhabir özel prob ve muhabir dışında bir genomik sonda bağlayıcı kullanarak.Sadece bir kısmı Güney leke analizinde doğru bant boyutları gösterdi ve heterozigously muhabiri entegre vardı, Güney leke tarafından PCR sonuçlarını doğrulamak için önemli olduğunu gösteren. Klonlar da daha pozitif tek hücreli klonlar onaylamak için sıralama ile analiz edildi. Hedef alanın dizilimi: homolog alel, muhabirentegre değildi, Cas9 kaynaklı mutasyonlar ortaya.Bir kez hakim, HIV muhabir hatları nesil iki ila üç ay içinde gerçekleştirilebilir. Hedeflemeden önce, uğraşmak istediğiniz araştırma sorusuna bağlı olarak, bir entegrasyon sitesi ve uygun bir muhabir seçmek için yeterli zaman harcamak önemlidir. Muhabirler örneğin, istenirse farklı HIV düzenleyici unsurlar içerebilir.Bu yordamı takiben, hücre hatları, örneğin, entegrasyon sitesine bağlı olarak, muhabir LTR transkripsiyonel etkinliği üzerinde farklı gecikme yükselen ajanların etkisini test etmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kılavuz RNA'lar ve hedefleme vektörü tasarlamak, jurkat hücrelerinde CRISPR/Cas9 tabanlı genom mühendisliği yapmak, tek hücreli klonlar üretmek ve FACS ve PCR taraması ile doğru hedeflenmiş klonlar için seçim yapmak için entegrasyon sitesine özgü HIV muhabiri hatlarının nasıl oluşturacağınızı iyi anlamanız gerekir. Unutmayın, eğer bir çoğaltma-yetkili HIV muhabiri ile çalışmayı seçerseniz, BSL3 güvenlik koşulları altında çalışmak gerekir.

crispr-cas9-based-genome-engineering-to-generate-jurkat-reporter

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Günümüzde HIV-1 stratejileri, viral bir yaşam döngüsü bastırmak için değil, etkili bir şekilde enfeksiyonu ortadan kaldırmak hareket ederler. Burada göstermektedir ki enfekte hücreleri genom bir mühendislik recombinase verimli tüketim entegre HIV-1 proviral DNA.

Röportaj: Evolved Recombinase kullanarak HIV-1 Proviral DNA eksizyonu

CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

İntegrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) üretim stratejisinin CRISPR/Cas9 hücrelere teslim etmek için Araçlar açıklanmaktadır. Hücrelerde hızlı ve sağlam gen düzenleme arabuluculuk için bir yetenek ile IDLVs bir daha güvenli sunmak ve eşit derecede etkili vektör platformu'gen dır integrase yetkili vektörlerinin karşılaştırıldığında.

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Keşfedin CRISPR-Cas9 ile HIV-1 proviral entegrasyon modelleri oluşturmayı. Jurkat hücrelerinde spesifik genomik lokuslara hedeflenen reporterler sayesinde gen ifadesi üzerindeki etkileri inceleyin.

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik (Video) | JoVE Journal

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

Daha fazla video keşfet