Name: Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Öğrenin, CARIC yöntemiyle HeLa hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinleri nasıl tanımlayacağınızı. Bu protokol, tıklama kimyası destekli yakalama stratejisi kullanarak kodlayan ve kodlamayan RNA'lara bağlanan proteinleri kapsamlı şekilde belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin hibe 91753206, 21425204 ve 21521003 ve ulusal anahtar araştırma ve geliştirme projesi 2016YFA0501500 tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Adil RNA bütünlük bakımından başarılı CARIC deneyler anahtarlarına biridir. Kısmi düşme gözlendi rağmen ile uygun ligandlar Cu(I) ve dikkatli kullanım özellikleri ile RNA bozulması önemli ölçüde, azalır. AB ve deneysel örneklerinde 4SU değiştirme oranları ve % 1,18 %0,46, sırasıyla vardır (veri gösterilmez). 2.000 uzunluğu ile bozulmamış RNA'ların için nt, RNA'ların ~ %90 içeren en az bir AB ve bir 4SU. 1.000 uzunluğu ile kısmen bozulmuş RNA'ların için nt, RNA'ların ~ %70 içeren en az bir AB ve bir 4SU. Bu nedenle, şidde...

İnsan genomu çeşitli mRNA'ların, rRNA'lar, tRNA da dahil olmak üzere kodlama ve kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar), küçük nükleer RNA'ların (snRNA), küçük genelde RNA'ların (snoRNAs) ve uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs)1sentezlenir. Bu RNA'ların çoğunu RBPs giyim sahip ve Ribonükleoprotein parçacıklar (RNPs)2olarak işlev. Bu nedenle, RBPs kapsamlı bir tanımlaması çeşitli insan hastalıkları3,4,5' te karıştığı düzenleyici ağ arasında RNA'ların ve RBPs, anlamak için bir önkoşuldur.
Son birkaç yıldır insan7,8,9,10,11de dahil olmak üzere çeşitli ökaryotik sistemleri2,6' da keşfedilen RBPs büyük bir destek tanık olduk, fare12,13,14, Maya9,15,16, zebra balığı17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22ve insan parazitleri23,24,25 . Bu gelişmeler tarafından Castello vd tarafından geliştirilen bir RBP yakalama stratejisi kolaylaştırdı 7 ve Baltz vd. vivo UV RNA ve onun etkileşen proteinler, poli(a) RNA'ların oligo(dT) yakalanması ve kütle spektrometresi (MS) cross-linking birleştiren 8 2012 yılında,-proteomik profil oluşturma dayalı. Ancak, bu poli(a) çoğunlukla sadece ~ %3 - %526ökaryotik transcriptome hesaba, olgun mRNA üzerinde bulunmaktadır gerçeği göz önüne alındığında bu yaygın olarak kullanılan strateji non-poly(A) RNA'ların çoğu ncRNA'lar de dahil olmak üzere, ile etkileşim RBPs esir alma yeteneğine sahip değildir ve pre-mRNA'ların.
Burada, son zamanlarda geliştirilen strateji poli(a) ve non-poly(A) RBPs27transcriptome çapında yakalanması için ayrıntılı yordamlar raporu. CARIC olarak adlandırılan, bu strateji vivo içinde UV cross-linking ve metabolik RNA'lar (tıklayın tepki olarak katılabilir bir bioorthogonal fonksiyonel grup içeren) photoactivatable ve "tıklanabilir" nükleozit analogları ile etiketleme birleştiren 4 - thiouridine (4SU) ve 5-ethynyluridine (AB). CARIC stratejisi ile ideal sonuçlar elde etmek için anahtar olan verimli metabolik etiketleme, UV cross-linking ve tıklayın tepki ve RNA bütünlük bakımından adımlardır. Tıklayın tepki katalizör olarak kullanılan Cu(I) RNA'ların parçalanma neden olabileceğinden, RNA parçalanma azaltabilir bir Cu(I) ligand esastır. Biz verimli tıklayın reaksiyonlar şiddetli RNA bozunması neden olmadan cep lysates gerçekleştirmek açıklar.
RBP yakalamak ve kimlik HeLa hücreleri içinde sadece bu protokol için açıklanan, ancak çeşitli hücre tiplerinin ve muhtemelen canlı organizmalar CARIC strateji uygulanabilir. RBP yakalama yanı sıra, bu protokolü de MS numune hazırlama ve protein tanımlama ve o kim proteomik deneyler ile aşina olmayan için yararlı olabilir miktar için aerodinamik adım adım yordamlar sağlar.

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin & Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>AB (5-etinil üridin)</td><td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS: 69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU (4-tiyoridin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10 kez; PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Su)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UV çapraz bağlayıcı</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>365 nm UV lambası ile donatılmıştır</td></tr><tr><td>DEPC (Dietil pirokarbonat)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>Suyu arıtmak için. Son derece zehirli!</td></tr><tr><td>Tris ve orta nokta; HCl, pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88265</td><td>50 mL lizis tamponu için bir tablet.</td></tr><tr><td>LDS (Lityum dodesil sülfat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ultrafiltrasyon tüpü (10 kDa kesme)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL ultrafiltrasyon tüpü (10 kDa kesme)</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin manyetik boncuklar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil sülfoksit)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>Azide-biotin</td><td>Tıklama Kimyası Araçları</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [Tris (3-hidroksipropiltriazolilmetil) amin]</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum askorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Azide-Cy5</td><td>Tıklama Kimyası Araçları</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>LDS örnek tamponu (4 kez;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>%10 bis-Tris jel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodyum dodesil sülfat)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [Polioksietilen (20) oleyl eter]</td><td>J& K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agaroz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosil ( N -Lauroylsarcosine sodyum tuzu)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>Sürüm: 1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

yakalama ve tıklama kimya destekli rna-interactome kullanarak rna bağlanıcı proteinler tanımlaması (caric) strateji yakalama

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) kapsamlı bir tanımlaması hücrelerdeki posttranscriptional düzenleyici ağ anlama anahtarıdır. RBP yakalama için yaygın olarak kullanılan bir strateji non-poly(A) RNA'ların çoğu proteinler tanımlanamayan bırakarak ökaryotik olgun mRNA üzerinde çoğunlukla oluşan Poliadenilasyon [Poli(a)] hedef RNA'ların, patlatır. Burada bir son zamanlarda bildirilen yönteminin metabolik etiketlerine göre birleştirerek poli(a) ve non-poly(A) RBPs transcriptome çapında yakalama sağlayan tıklama Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) olarak adlandırdığı ayrıntılı yordamlar açıklar RNA'ların, in vivo UV cross-linking ve bioorthogonal etiketleme.

Kalite kontrol adımları temsilcisi sonuçları sunulmuştur. Sonuçlar 2.3.2 (Şekil 1). adımda anlatılan jel floresan analizi, 4.1.3 (Şekil 2A). adımda anlatılan western blot Analizi ve gümüş boyama analiz 4.2.2 (Şekil 2B) adımda açıklanan rakamlar içerir. Kalite kontrol adımları CARIC protokolleri optimizasyonu için kritik öneme sahiptir. Her zaman büyük ölçekli RBP tanımlama deneyleri hazırlanmasında k...

Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA'ların sunulur.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Bu yöntem, CARIC, RNA bağlayıcı proteinlerin kapsamlı bir nüfus sayımı sağlayarak gen rekreasyon post-transkripsiyon alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. CARIC'in en büyük avantajı, mRNA'lar ve kodlamayan RNA'lar gibi çeşitli RNA türlerine bağlı proteinleri yakalayabilme yeteneğidir. Bu yöntem çeşitli tiplerde ve organizmada rna protein etkileşimini iş yerinde incelemek için kullanılabilir.İlk olarak, kültür HeLa hücreleri destekli DMEM 37 santigrat derece bir yüzde beş CO2 atmosferinde. Hücreler yaklaşık yüzde 80 birleştiğinde her çanak üzerinde kültür ortamı yerine 15 mililitre önceden ısıtılmış, taze ortam. Bir milimolar son konsantrasyoniçin her çanağa 100 milimolar AB 15 mikrolitre ekleyin.Deneysel ve uv kontrol numuneleri için her çanağa 7,5 mikrolitre 100 milimolar dört SU ekleyin. Önceki koşulları kullanarak 16 saat boyunca folyo ve kültür hücreleri ile bulaşıkları kaplayın. Bundan sonra, uygun plakalara önceki AB ve/veya dört SU miktarının yarısını ekleyin ve iki saat daha ekmeye devam edin.Vivo çapraz bağlama başlamak için, kültür ortamı nı çıkarın ve yıkama başına beş mililitre PBS kullanarak PBS ile her yemeği üç kez yıkayın. Kalan PBS'yi mümkün olduğunca çıkarın. Deneysel ve dört SU kontrol numunesi için, kapakları çıkarılmış buz üzerine yerleştirin.Hücreleri 365 nanometre de UV ışığıyla ve santimetre karesi iki jules'a ışınlamak için uv çapraz bağlantı cihazı kullanın. UV kontrol numuneleri olmadan bulaşıkları buza yerleştirin ve ışıktan koruyun. Sonra, her çanağa bir mililitre prelysis tamponekleyin.Hücreleri kazımak ve 15 mililitrelik bir tüp içinde prelyz süspansiyon toplamak için bir kauçuk hücre kaldırıcı kullanın. Toplam hacmi altı mililitreye ayarlayan iki tabaktan süspansiyon içeren bir tüpe prelyzis tamponu ekleyin. Sonra Eşit hacimli R lysis arabelleği ekleyin.Lysate açık ve homojen olana kadar hücre lisatını dar bir iğne ile birkaç kez şırıngadan geçirin. Lysate'yi bir saat boyunca hafif bir dönüşle dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bundan sonra seyreltme 20 hacimli seyreltme tampon ve 15 mililitre untrafiltration tüpleri 15 mililitre fraksiyonları, 10 kilodaltonmoleküler kesme bölün.Sallanan bir kova rotator kullanarak, her fraksiyon bir mililitreden daha az bir hacme yoğunlaşana kadar tüpleri 4000 kez G ve dört santigrat derecede yaklaşık 15 dakika döndürün. Her konsantre lysate fraksiyonuna 14 mililitre seyreltme tamponu ekleyin ve konsantrasyon işlemini tekrarlayın. Daha sonra kesirleri birleştirin ve daha önce açıklanan konsantrasyon işlemini kullanarak altı mililitrelik bir hacimde yoğunlaştırın.Önce metin protokolünde belirtildiği gibi reaksiyon karışımını hazırlayın. Bu reaksiyon karışımını altı mililitre önceden temizlenmiş lysate'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Reaktifi azaltmak için 162,5 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın.İki saat boyunca 800 rpm'de bir orbital shaker üzerinde oda sıcaklığında kuluçka. Bu beş milimolar EDTA ekleyerek ve beş dakika oda sıcaklığında orbital shaker inkübünle reaksiyon söndürmek sonra. Daha sonra, reaksiyon karışımını her biri önceden soğutulmuş metanol ve 30 dakika boyunca negatif 30 santigrat derecede inkübün içeren iki adet 50 mililitrelik tüp arasında bölün.4000 kez G ve 15 dakika boyunca 4 santigrat derece santrifüj. Supernatant atın ve pelet için önceden soğutulmuş metanol bir ve iki mililitre arasında ekleyin. Peletin görünür parçalar olmadan tamamen askıya alınmasından emin olmak için peleti parçalamak için yukarı ve aşağı borular.Santrifüj ve resuspension işlemini iki kez tekrarlayın. Bundan sonra, dikkatle pelet rahatsız değil emin olmak için mümkün olduğunca artık metanol dışarı çekin. 10 mililitre yeniden yapılanma tamponu ekleyin ve peleti eritmek için yukarı ve aşağı borular.4000 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derece santrifüj. Daha sonra supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve kalite kontrolü için numunenin 20 mikrolitresini topladığızdan emin olun. Temizlenmiş ve yeniden oluşturulmuş numuneyi hazırlanan streptavidin agarose boncuklara aktarın.Bir gecede hafif bir dönüşle dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Boncukları 4000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve kalite kontrolü için numunenin 20 mikrolitresini topladığız dan emin olun.10 mililitre yıkama tamponu A.Incubate ile boncukları 12 rpm'de ve oda sıcaklığında 10 dakika hafif bir dönüşle yıkayın. Sonra boncukları 4000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant çıkarın ve yıkama ve santrifüj işlemini bir kez daha tekrarlayın.Bu yıkama işlemini, metin protokolünde belirtildiği gibi yıkama tamponu B ve yıkama tamponu C için tekrarlayın. Bundan sonra, 50 milimolar Tris hidroklorür 10 mililitre ile boncuk yıkayın. Boncukları 4000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı çevirin.Supernatant çıkarın ve iki 1,5 mikrosantrifüj tüpler arasında eşit boncuk bölün. Yakalanan RNP'lerden sıyrılmaya başlamak için, 400 mikrolitre yıkanmış, yerleşmiş boncuklara 400 mikrolitre hazırlanmış biotin elüsyon tamponu ekleyin. 1500 rpm'de oda sıcaklığında 20 dakika boyunca orbital shaker'da kuluçkaya yat.Sonra 1500 rpm ve 65 santigrat derece 10 dakika boyunca bir ısı bloğu ile bir yörünge shaker inkübate. Bir dakika için 7800 kez G boncuk santrifüj ve kaçan RNP toplamak. Boncuklar taze biotin elüsyon tampon 400 mikrolitre ekleyin.İkinci bir elute toplamak ve tek bir 15 mililitrelik tüp iki elutes birleştirmek için kuluçka ve santrifüj işlemi tekrarlayın. Daha sonra, SDS konsantrasyonu azaltmak için kombine RNP eutes seyreltme tampon üç cilt ekleyin. 0,5 mililitrelik ultra filtrasyon tüpü kullanarak, örneği metin protokolünde belirtildiği gibi yaklaşık 40 mikrolitreye yoğunlaştırın.Mikrolitre RNase A başına 0,5 mikrogram ekleyin ve çapraz bağlı RNase'den RbPs'i serbest bırakmak için iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kalite kontrol için iki mikrolitre RP toplayın. CARIC protokolleri optimize edilirken, kalite kontrol adımları çok önemlidir.Tıklama etiketli numunelerin temsili kalite kontrolü jel floresan analizleri ile gerçekleştirilir. Sadece iki katı etiketli örnek çapraz bağlı RNP sinyalini temsil eden yüksek molekül ağırlığında güçlü bir yayma bandı gösterir. RNP sinyali dört SU veya AB'yi atlayarak kaldırılır. Ayrıca rnase ile sindirim ile kaldırılabilir A.In bazı durumlarda güçlü bir bulaşmış bant hiçbir dört SU kontrol örneğinde gözlenir.Bu bant, çoğu durumda ısı yalıtımı sırasında bozulacak olan çapraz olmayan RNase etiketli temsil eder. Yakınlık anketi verifisinin kalite kontrolü, numunelerde hem aşağı çekmeden önce hem de aşağı çekildikten sonra biyotin sinyallerini gösteren batı leke analizi ile değerlendirilir. Yakalanan RP'lerin gümüş boyama analizi, HeLa hücreleri için toplam yakalama veriminin giriş proteinlerinin yüzde 0,05 ila yüzde 0,1'i arasında olduğunu ortaya koymaktadır.Bu prosedürü denerken RNase ribonükleazduyarlı olduğunu hatırlamak önemlidir. RNase'nin bozulmasını azaltmak için deneysel ortamı mümkün olduğunca temiz tutun. Bu işlemden sonra, kütle spektrometresi kullanılarak protein tanımlaması, demire bağlı proteinleri ortaya çıkarmak için önceden oluşturulabilir.Geliştirilmesinden sonra, CARIC tekniği iş yerinde posta transkripsiyon OT yönetmelik daha kapsamlı bir anlayış için önünü açacaktır.

capture-identification-rna-binding-proteins-using-click-chemistry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

Bu videoda, ilgilenilen bir hedef protein için spesifik RNA bağlama dizilerini tanımlamak için üstel zenginleştirme (SELEX) yöntemiyle ligandların sistematik evrimini açıklıyoruz. Protein, geniş bir randomize RNA dizileri havuzu ile inkübe edilir ve protein bağlayıcı RNA dizileri izole edilir, PCR ile çoğaltılır ve protein bağlama bölgelerini tanımlamak için dizilenir.

RNA-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için SELEX Tabanlı İn Vitro Bağlanma Testi

Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Öğrenin, CARIC yöntemiyle HeLa hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinleri nasıl tanımlayacağınızı. Bu protokol, tıklama kimyası destekli yakalama stratejisi kullanarak kodlayan ve kodlamayan RNA'lara bağlanan proteinleri kapsamlı şekilde belirlemenizi sağlar.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

Daha fazla video keşfet