Name: Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin Arabidopsis yapraklarından kloroplast alt bölmelerini (zarf, stroma, tilakoid) saflaştırma yöntemini. Bu teknik, diferansiyel santrifüjasyon ve gradyan yöntemleriyle protein yerelleştirme çalışmaları için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser INRA bitki biyolojisi ve yetiştirme bölümü ve Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01) IB için ortak bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir. Biz de ANR proje ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) LHCP ve Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) karşı antikorlar için kabul KARI karşı antikorlar için istiyorum.

1. hazırlanması arabellekleri, hisse senedi çözümleri ve gradyan
<ol><li>4 ° C'de 6 ay saklanabilir aşağıdaki hisse senedi çözümleri hazırlamak<ol>
<li>1 litre Tricine tampon (1 M, pH 8.4) ve Tricine tampon (1 M, pH 7,6) hazırlayın. PH KOH granül ekleyerek ayarlayın.</li>
		<li>Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, 0, 5 M, pH 8) 1 L ve 3-(N-morpholino) propan sülfonik asit (paspas) arabellek (1 M, pH 7.8) hazırlayın. PH NaOH Pelet ekleyerek ayarlayın.</li>
		<li>MgCl2 (1 M) 50 mL hazırlayın.</li>
		<li>50 mL proteaz inhibitörleri çözümleri hazırlamak: phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) isopropanol, 100 mM kurmak, benzamidine hidroklorid hidrat (100 mM) ve ε-amino kaproik asit (50 mM). Not: PMSF ve amino kaproik asit ay 4 ° C'de çözümde kararlı olmakla birlikte, benzamidine çözüm-20 ° C'de muhafaza edilmelidir</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki çözümleri deneyin önceki gün hazırlamak ve tüm çözümler 4 ° C'de depolayın<ol>
<li>Orta pH 8.4 Tricine-KOH (20 mM, pH 8.4), içeren öğütme 4 L hazırlamak sorbitol (0.4 M), EDTA (10 mM, pH 8) ve NaHCO3 (10 mM). PH NaOH Pelet ekleyerek ayarlayın. Sadece kullanmadan önce Sığır serum albumin (BSA) %0.1 (w/v) ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Orta (2 x) pH 7,6 Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), içeren yıkama 500 mL hazırlamak sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) ve EDTA (2.5 mM). PH NaOH Pelet ekleyerek ayarlayın. Böyle çözüm çamaşır Orta (1 x) elde etmek için hazırlanması Percoll degrade çözüm sonra sulandırmak.</li>
		<li>200 mL Percoll degrade çözeltisi kloroplast arıtma Percoll çamaşır Orta (2 x) ile karıştırılarak (v/v) Percoll % 50 son bir çözüm elde etmek için eşit bir ses seviyesinde hazırlamak / 0.4 M sorbitol.</li>
		<li>50 mL sukroz çözümleri bezleri (10 mM, pH 7.8), MgCl2 (4 mM) ve sukroz (0,3 M, 0,6 M ve 0.93 M) farklı konsantrasyonlarda karıştırılarak kloroplast ayırma için hazır olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki gradyanlar ve deney başlamadan önce arabellekleri hazırlamak.<ol>
<li>Percoll degradeler altı tüpleri hazırlayın (her %50 30 mL içeren Percoll / 0.4 M sorbitol) 38,700 x g 55 dk. 4 ° C'de için de Santrifüjü tarafından Fren degradeler karıştırma önlemek için uzak tutmak. Santrifüjü sonra soğuk bir odada ön şekillendirilmesi degradeler içeren kadar kullanmak tüpler saklayın.</li>
		<li>Sükroz degradeler, dört tüpler üç aşağıdaki sükroz katmandan oluşan her degrade ile hazırlamak: 0.93 M, 2.5 mL 0,6 M ve 0,3 M sukroz 2 mL 3 mL. Dikkatle her katmanı ile 0.93 M altındaki başlangıç ve 0,3 M ile üst kısmında finisaj peristaltik pompa kullanarak, yer paylaşımı.</li>
		<li>Hipotonik orta 50 mL bezleri (10 mM, pH 7.8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM isopropanol kurulmuş,), benzamidine hidroklorid hidrat (1 mM) ve ε-amino kaproik asit (0.5 mM) içeren kloroplast lizis için hazırlayın. Arabellek buza kullanmak kadar saklamak.</li>
		<li>50 mL bezleri (10 mM, pH 7.8), PMSF (1 mM), benzamidine hidroklorid hidrat (1 mM) ve ε-amino kaproik asit (0.5 mM) içeren bir arabellek yıkama membran hazırlayın. Arabellek buza kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. büyüme ve Arabidopsis yaprakları hasat
<ol><li>Arabidopsis bitkilerin büyüme için 4 büyük plastik tava Arabidopsis bitkilerin tohum her tavada 30 mg Ekim tarafından (0.5-1 m2bir toplam alan için) hazır olun. Arabidopsis bitkiler için 5 hafta 12 saat ışık-siklet 23 ° c (gün) / 18 ° C (gece), 150 mikron m-2 s-1bir ışık şiddeti ile büyümek.</li>
	<li>Gecede deneme (kloroplast içinde nişasta granülleri miktarını azaltmak için) önce bir karanlık ve soğuk oda (4 ° C) tesislerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Bir 1 L ölçek önceden tartmak ve yaprak malzemeden hasat başlamadan önce buza koyun.</li>
	<li>Hasat Arabidopsis toprak (kompost) kaçınarak bırakır. Kabı yeniden tartmak ve doku ağırlık kaydedin. Not: 400-500 g yaprak malzemenin dört tava bekleniyor.</li>
	<li>Yaprakları arabellek öğütme 2 L ile soğuk bir odada homojenize (BSA daha önce üç kez Ekle) / 2 s yüksek hızda bir karıştırıcıda her zaman.</li>
	<li>Homogenate soğuk bir odada muslin 4 kat ve naylon blutex bir tabaka kullanarak filtre. Tüm sıvı ayıklamak için muslin/naylon blutex içinde homogenate yaprakları yavaşça sık.</li>
	<li>Blender Kupası ikinci çıkarılması için kalan dokuda kurtarmak. 2.5 ve orta ve yeni öğütme 2 L (soğuk bir odada) 4-5 kat muslin kullanarak 2.6 numaralı adımları yineleyin.</li>
</ol>3. ham kloroplast fark Santrifüjü kullanarak saflaştırılması
<ol><li>Aynı derecede altı 500 ml'lik şişe içine ham hücre özü dağıtabilir ve şişe buz Santrifüjü önce yerleştirin. En kısa zamanda en yüksek hızı (2,070 x g) (maksimum hızlanma ve fren üzerinde 4 ° C) ulaşıldıktan 2 dk santrifüj.</li>
	<li>Yavaşça süpernatant atmak.</li>
	<li>Bir su pompası ile kalan süpernatant Aspire edin ve buz üzerinde konsantre ham kloroplast içeren parçaları tutmak.</li>
	<li>Yavaşça bir asgari miktar çamaşır Orta (1 x) ekleyerek granül resuspend (kombine kloroplast süspansiyonlar son hacmi 36 mL =) bir fırça veya eğri bir plastik spatula kullanarak. 10 mL damlalıklı, orta her şişe yıkama 3 mL eklemek için kullanın. Not: damlalıklı kloroplast kırılma önlemek için çok güzel ipuçları ile kullanmayın. Alternatif olarak, daha büyük bir delik oluşturmak için bir tıraş bıçağı ile bir damlalıklı mavi ucu kesilmiş.</li>
	<li>Resuspended kloroplast bir tüp 10 mL damlalıklı kullanarak toplama. Karışımı yavaşça Percoll degradeler üzerinde yükleme önce homojen bir süspansiyon elde etmek için tüp ters çevirme.</li>
</ol>4. sürekli Percoll degrade üzerinde sağlam kloroplast saflaştırılması
<ol><li>Üstünde tepe-in her kloroplast kırılma önlemek için bir 10 mL damlalıklı kullanarak altı Percoll degradeler kloroplast süspansiyon 6 mL yük yavaş.</li>
	<li>Degradeler 13,300 x g, sallanan-kova rotor kullanarak 4 ° C de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Hızlanma yavaş olmalı ve fren bağlantısı (fren kapalı veya yavaş yavaşlama) Percoll degradeler karıştırma önlemek için.</li>
	<li>Kırık kloroplast ve bozulmamış mitokondri bir su pompası kullanarak içerir üst aşama Aspire edin ve bozulmamış kloroplast alt mevcut almak aşama (geniş koyu yeşil bant) ile 10 mL damlalıklı. Çekirdek ve hücre artıkları (tüp alt kısmında bulunur) sağlam kloroplast (Şekil 2A) ile Aspire değil dikkatli olun.</li>
	<li>3-4-kat çamaşır arabellek (1 x) ile bozulmamış kloroplast süspansiyon sulandırmak. En kısa zamanda en yüksek hızı (2,070 x g, 4 ° C) (maksimum hızlanma ve fren üzerinde) ulaşıldıktan 2 dk santrifüj.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant atmak.</li>
	<li>Tamamen kalan süpernatant bir su pompası ile Aspire edin ve buz üzerinde konsantre olduğu gibi kloroplast Pelet tutun.</li>
	<li>Kloroplast lizis önce yaklaşık 1 mL, Orta (1 x) Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ve western Blot kullanarak daha fazla analizleri için yıkama sağlam kloroplast kesir bir aliquot unutmayın. Küçük bir protein konsantrasyonu tayini için olduğu gibi bu kloroplast, aliquot devam et. Sağlam kloroplast kesir daha fazla deneyler için sıvı azot depolamak.</li>
</ol>5. sağlam kloroplast hipotonik tampon ve kloroplast alt bölmeler arıtma kesintili sükroz degradeler kullanarak lysis
<ol><li>Proteaz inhibitörleri (son hacim 12 mL geçmemelidir) içeren hipotonik ortamda Pelet resuspending tarafından arıtılmış sağlam kloroplast parçalayıcı. Not: kloroplast, intactness (kloroplast yukarı ve aşağı Pelet değil tamamen resuspended sürece pipetting) daha fazla gerekli olduğundan bu adıma, damlalıklı iyi ipuçları (mavi ipuçları) ile kullanımı mümkündür. Arabidopsis kloroplast (bezelye kloroplast için örneğin karşılaştırıldığında) çok kırılgan ve onların lizis kuluçka sonra hipotonik ortamda hemen hemen hemen.</li>
	<li>Yavaş yavaş lysed kloroplast peristaltik pompa kullanarak her ön şekillendirilmesi sükroz degradeler üst kısmında 3 mL yük.</li>
	<li>Ultracentrifuge (70.000 x g, 4 ° C'de) 1 h için degradeleri. Hipotonik orta tampon önce Santrifüjü kullanarak tüpler, çiftlerini dengelemeyi.</li>
	<li>Dikkatle çözünür stromal proteinler degrade (her degrade 3 mL) üst aşaması pipetting tarafından yeniden elde etmek (Şekil 2B). Bir aliquot protein konsantrasyonu7tespiti için al. Stroma daha fazla deneyler için sıvı azot depolamak.</li>
	<li>Her degrade kalan üst aşaması için bir su pompası ile sarı bant Aspire edin.</li>
	<li>Damlalıklı (yaklaşık her degrade üzerinden 1 mL) ile sarı bant (zarf) almak. Bir tüp zarflarda havuz.</li>
	<li>Her degrade kalan aşaması için bir su pompası ile thylakoid Pelet kaldırın.</li>
</ol>6. çamaşır ve konsantrasyon Thylakoid ve zarf membran sistemleri
<ol><li>Thylakoid granül (yeşil Pelet) arabellek (1 x) (proteaz inhibitörleri ile) yıkama membran en küçük birim (2 mL) resuspend.</li>
	<li>Zarf ve thylakoid süspansiyonlar seyreltik 3-4-kat membran çamaşır Orta (10 ml ses seviyesini) ve ultracentrifuge (110.000 x g, 4 ° C'de) 1 h için. Arabellek Santrifüjü önce yıkama membran kullanarak tüpler, çiftlerini dengelemeyi.</li>
	<li>Dikkatli bir su pompası ile supernatants Aspire edin.</li>
	<li>Yaklaşık 100 µL arabelleğe (ile proteaz inhibitörleri) zarf Pelet yıkama membran ekleyin. Bir aliquot protein konsantrasyonu7tespiti için al. Arıtılmış zarf membran hazırlık sıvı azot depolamak.</li>
	<li>Thylakoids Pelet önbellekle (proteaz inhibitörleri) yıkama membran 3 mL resuspend. Bir aliquot protein konsantrasyonu7tespiti için al. Thylakoid membran kesir sıvı azot depolamak.</li>
</ol>

<ol><li>Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosymbiotic+theory+for+organelle+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Endosymbiotic theory for organelle origins.</a> Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).</li>
<li>Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315522">Plastid evolution.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).</li>
<li>Linka, N., Weber, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20038549">Intracellular metabolite transporters in plants.</a> Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).</li>
<li>Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+envelope+membranes%3A+a+dynamic+interface+between+plastids+and+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol.</a> Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).</li>
<li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li>
<li>Agrawal, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+organelle+proteomics%3A+collaborating+for+optimal+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function.</a> Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).</li>
<li>Chua, N. -H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687980690429">[40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins.</a> Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).</li>
<li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+intact+chloroplasts+from+Arabidopsis+and+spinach+leaves+by+isopycnic+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 30 (2008).</li>
<li>Ferro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%2C+a+comprehensive+chloroplast+proteome+database+with+subplastidial+localization+and+curated+information+on+envelope+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins.</a> Molecular & Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).</li>
<li>Seigneurin-Berny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMA1%2C+a+new+Cu-ATPase+of+the+chloroplast+envelope%2C+is+essential+for+growth+under+adverse+light+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).</li>
<li>Vallon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+redistribution+of+cytochrome+b6%2Ff+complexes+along+thylakoid+membranes+upon+state+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).</li>
<li>Douce, R. J. J. Purification of the chloroplast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouce%2C+RJJ+%22Methods+in+Chloroplast+Molecular+Biology%22">Methods in Chloroplast Molecular Biology</a>. Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -H. , Elsevier Science Publishers BV. Amsterdam. 239-256 (1982).</li>
<li>Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+the+isolation+of+intact+chloroplasts+of+high+photosynthetic+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity.</a> Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).</li>
<li>Kunst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+physiologically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Protein+Import+into+Chloroplasts+Isolated+from+Stressed+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percoll-purified+and+photosynthetically+active+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).</li>
<li>Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+proteomic+analysis+of+chloroplasts+and+their+sub-organellar+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments.</a> Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).</li>
<li>Walker, D. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.129.2517&rep=rep1&type=pdf">The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis</a>. , Oxygraphics Ltd, University of Sheffield. South Yorkshire, UK. (1990).</li>
<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+membrane+fractions+enriched+in+outer+and+inner+envelope+membranes+from+spinach+chloroplasts.+II.+Biochemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization.</a> Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).</li>
<li>Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteins+and+protein-kinase+activity+in+isolated+envelopes+of+pea+%28Pisum+sativum+L.%29+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 166 (3), 394-400 (1985).</li>
<li>Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Membrane+Fractions+%28Envelope%2C+Thylakoids%2C+Grana%2C+and+Stroma+Lamellae%29+from+Arabidopsis+Chloroplasts+for+Quantitative+Proteomic+Investigations+and+Other+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).</li>
<li>Tomizioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+thylakoid+sub-compartments+using+a+mass+spectrometry-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).</li>
<li>Spicher, L., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+roles+of+plastoglobules+%28plastid+lipid+droplets%29+in+vitamin+K1+and+E+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut madde kloroplast (ve onların alt bölmeler) arındırmak için kullanılan adım adım iletişim kuralı detaylara Arabidopsis thalianaamaçlamaktadır. Ve kullanıma sunulması, komple genom sıra neredeyse yirmi yıl önce büyük koleksiyonları topluma sunulan ekleme mutantların beri Arabidopsis şimdi yaygın bir modeli bitkisi olarak kabul edilir. Ancak, bu bitki genetik yaklaşımlar için mükemmel adapte iken, gelişmekte olan bu model biyokimyasal ve fizyolojik araçlarına uyum için gerekli bilim adamları bitki. Böylece yaprak ıspanak12 veya bezelye13 gibi köklü biyokimyasal modellerin üzerinden omnivor etkin kloroplast arındırmak için izin iletişim kuralları adapte gerekiyordu. İlk yöntem Arabidopsis kloroplast arıtma 199814, Arabidopsis genom dizisi sürümünden önce yayımlandı. Birkaç yıl sonra basit yöntemleri Arabidopsis kloroplast arıtılmış organelleri proteinler alınmasıyla vitro analiz amaçlayan çalışmalar ile uyumlu izole için kullanılabilir15,16yapılmıştır. Ancak, bu yöntemleri yüksek saflık ve arıtılmış kloroplast fotosentetik etkinlik korunması birleştirmek için izin vermedi. Son zamanlarda17, hızlı bir yöntem, Percoll degradeler kullanımına dayanıyor ve ölçülen Arabidopsis başlangıç yapraklarda fotosentez oranı neredeyse % 90 tutulacağı sağlar kurulmuştur.
Burada açıklanan iletişim kuralı Arabidopsis kloroplast saflık mükemmel bir düzeyde arındırmak için izin verir. Gerçekten de, diğer hücre bölmeleri gelen kirletici immünolojik algılama arıtılmış organelleri mitokondrial yoksun olduğunu gösterdi ve plazma zarı işaretleyicileri9,10. Bu iletişim kuralı da birkaç Arabidopsis ecotypes18, Columbia (Col) veya Wassilewskija (WS), Yani, gibi kloroplast arındırmak için verimli genom için kullanılan veya ifade ecotypes sıra Etiketler (ESTs) sıralama Ayrıca Arabidopsisiçinde T-DNA ekleme mutantlar oluşturmak için ama projeleri. Proteomik çalışmalar yapılması gerektiğinde, diğer bir deyişle, mevcut Protokolü Arabidopsisgelen bu iki başvuru ecotypes ile uyumludur. Son olarak, mevcut iletişim kuralını kullanarak kloroplast verim--dan ıspanak veya bezelye yaprakları (Yani, Percoll saf kloroplast fazla ile karşılaştırıldığında klorofil içeriğinde üzerinden ölçülen % 3, başlatma sırasında elde edilen bir benzer klorofil tutar yaprakları başlayan mevcut). Ne zaman organelleri 5-hafta-yaşlı Arabidopsis yaprakların 500 g Saf protein açısından, kloroplast proteinlerin yakın 50 mg verimidir.
Böyle bir iyi verim (ve kloroplast bütünlüğü), ulaşmak için bir ancak özen özel birkaç adım mevcut protokolünü kullanırken. Arabidopsis kloroplast (Bu durum için bezelye kloroplast, örneğin değildir) son derece kırılgan bir yapıdır. Belirli dikkat böylece arıtma sırasında organelleri büyük ölçekli rüptürü önlemek için gereklidir. Nişasta granülleri kloroplast içinde mevcut boyutunu ve sayısını sağlam kloroplast hazırlanması için kritik öneme sahiptir. Nitekim, büyük nişasta tahıl içeren kloroplast genellikle ham kloroplast kesirler12konsantre amaçlayan ilk fark centrifugations adımları sırasında kesilir. Bu nedenle, bitkiler gecede bir karanlık ve soğuk oda (4 ° C) nişasta miktarını azaltmak için deneme önce tutulmalıdır.
Mevcut iletişim kuralının yeni kullanıcılar daha büyük miktarlarda yaprak malzeme (daha büyük yaprakları ile eski Arabidopsis bitkilerden büyük rozet) başlatmak için cazip saf kloroplast kurtarılması geliştirmek çalışıyor. Ancak, bizim ellerde, Genç yapraklarından (5-hafta-yaşlı) verim, saflık ve arıtılmış organelleri bütünlüğünü birleştirmek için en iyi uzlaşma ulaşıyor. Gerçekten de, çok eski yaprakları çok kloroplast bütünlük19üzerinde olumsuz bir etkisi olarak gösterildi fenolik bileşikler olarak zenginleştirilmiş.
Son olarak, (doku bileme) ilk ayıklama adım başka bir kritik adım olduğunu. Karıştırma işlemi birkaç saniye için sınırlı olmalıdır. Yukarıda belirtildiği gibi yeni kullanıcıların daha uzun karıştırma, kullanmak için böylece güçlü arıtılmış organelleri verimini artırmak bekliyor meyillidir. Ancak, daha uzun etkili karıştırma yaprakları daha fazla malzeme yayımlarsa, kırık kloroplast oranı hızla ham hücre hulâsa içinde artar görünür. Bu yüksek oran orta sağlam kloroplast kırık nedeniyle daha fazla arıtma adımları (ayrılık Percoll degradeler üzerinde) şiddetle etkilenir ve arıtma verimi beklenmedik bir şekilde düşüktür.
Kullanılabilirlik organelleri arındırmak için belirli iletişim kurallarının kloroplast örnekleri üzerinde yapılacak deneyler proteomik tabanlı yüksek üretilen iş bir dizi izin. Bu veri böylece alanında biyologlar için doğru bir hücre altı (ve subplastidial) yerelleştirme için birçok kloroplast protein sağlayan birkaç ortak veritabanları6, sunuldu. Bu kimliği zarf proteinleri özellikle doğruydu ve kloroplast içinde önemli bir rol oynarken küçük kloroplast bileşeni (kloroplast proteinlerin % 1-2) zarf membranlar temsil ettiğinden konum çoğunlukla bu analizleri daha önce bilinmeyen kaldı metabolizma ve dipnotlar5,20. Burada açıklanan protokol kullanılarak, son zamanlarda Arabidopsis üzerinden üç ana kloroplast bölmeleri bileşimi analiz (Yani, stroma, thylakoids ve zarf membran sistemi)9. (Spektral sayma) bir yarı kantitatif proteomik yaklaşım üzerinde bağlı olarak, biz bu üç kloroplast bölmeleri proteinler yüzlerce bölümleme değerlendirmek başardık.
Kloroplast Arabidopsisüzerinden üç ana bölmeleri arındırmak için mevcut protokol izin verirken, kloroplast içinde ek alt bölmeler ayırt etmek de mümkündür. Nitekim, zarf membran sistemi iç ve dış zarf membranlar (Şekil 1) yapılır. Ancak, bizim bilgi en iyi şekilde kurulacak bir yöntem iç ve dış zarf membranlar Arabidopsis kloroplast üzerinden arındırmak için kalır. İç ve dış zarf membranlar ıspanak bezelye veya21 22 kloroplast saf. Arabidopsis ana sınırlandırılması çoğunlukla malzeme başlayan sınırlayıcı tutarlardan sonuçlanır. 500 g Arabidopsis yaprak (ki zaten bir büyüme odası 1 m2 yüzey gerektirir) başlayarak zarf proteinlerin sadece 100 µg arındırıcı sağlar. Öte yandan, o ile başlayan piyasa, kloroplast8 büyük miktarda arındırmak için ve bir verim bu malzemeden zarf proteinlerin 3-10 mg ile kesmek için 5-10 kg ıspanak yaprakları kolaydır.
Aynı thylakoid alt bölmeler için geçerlidir. Gerçekten de, thylakoids ışık yapılmış membran veziküller (lamellae) ve yoğun yapıları (grana) (Şekil 1). Belirli iletişim kuralları Arabidopsis23,24iki bu bölmeleri ayırt etmek kullanılabilir. Yine, bir nicel proteomik analize dayalı, biz son zamanlarda bu iki alt bölmeler24saat içinde mevcut proteinler kaydediliyor. Bu yaklaşımlar, edebiyat, derinlemesine bir araştırma ile birlikte doğrulamadan veya hipotezler yüzlerce thylakoid proteinler, subplastidial konumu için teklif izin. Ancak, ek membran microdomains thylakoids eğri boşluklarında bulunduğunu unutmamak gerekir. Bu lipoprotein alt bölmeleri veya plastoglobules, thylakoid membran için kalıcı olarak birleştiğinde ve proteinler25belirli bir kümesi içerir. Mevcut iletişim kuralını kullanarak, böylece bu belirli proteinler diğer thylakoid bileşenlerinden ayırt etmek mümkün değil.
Bazı orijinal (bilinen) zarf, stroma ve thylakoid bileşenleri hala algılanan proteinler listelerinden eksik vardır. Hedeflenen biyokimyasal ve immünolojik analizleri ile birlikte MS duyarlılık sürekli iyileştirilmesi kloroplast içerik, çeşitli alt bölmeler bileşimi tam bir repertuar doğru tekrar çok yardımcı olacaktır.

Kloroplast bitki hücrelerinin önemli bileşenleridir. Onlar bir endosymbiosis geçirmiş ve sonunda bir organel evrim1,2sırasında gelişti siyanobakteriyel bir atadan türetmek. Böyle organelleri üç ana bölmeleri (Şekil 1) içerir. Zarf sistem bir iç ve bir dış membran organel çevreleyen yapılır. Bu çift cidarlı sistem çeşitli enzimler lipidler ve pigmentler üretimiyle içerir ve çoğunlukla Plastitler sitozol arasındaki iletişimi denetlemek için ayrılmıştır. Nükleer kodlanmış proteinlerin alma ve iyonları ve metabolitleri sitozol ve böylece bitki hücre3,4 temel metabolik işlevleri düzenleyen kloroplast arasındaki değişimi izin çeşitli taşıma sistemleri içerir . Stroma, kloroplast, çözünür aşaması Calvin döngüsü (CO2 asimilasyon), enzimler içeren amino asit ve vitamin ve Plastit transkripsiyon ve translasyon makineleri de dahil olmak üzere çeşitli metabolitleri sentezi. Thylakoid membran nerede fotosentez ışık aşamasında yer alan bir yaygın olarak organize iç zar ağdır. Böylece, kloroplast temel metabolik yollar5oluştuğu yerlerdir.
Kloroplast dinamiği ve Fizyoloji kontrol yeni düzenleyici mekanizmaları çözmek için alt plastidial yerelleştirme kloroplast proteinlerin tanımlama böylece hedeflenen çalışmalar proteinler işlevleri daha iyi anlamak için amaçlayan desteklemek için önemlidir Model organizmalar6'. Bu proteinler hakiki subplastidial lokalizasyonu erişmek için bu nedenle son derece saf subplastidial kesirler (zarf membranlar, stroma ve thylakoids) başlatmak için esastır. Bu bağlamda, mevcut Protokolü Arabidopsis yaprakları fark centrifugations ve sürekli Percoll degradeler kullanarak üzerinden sağlam kloroplast arındırmak ve onları fractionate amaçtır kesintili sükroz degradeler, üç kullanma alt bölmeler (Yani, zarf, stroma ve thylakoids). Burada açıklanan yöntemi ayrıca çeşitli kloroplast alt bölmeler için ilişkili işaretçileri kullanarak arıtılmış alt organellar kesirler saflığı değerlendirmek için yönergeler sağlar. Bu iletişim kuralı subplastidial yerelleştirme immunoblotting kullanarak proteinlerin ve arıtılmış kesirler kütle spektrometresi (MS) kullanarak daha iyi inceleyebilmemiz için değerlidir-tabanlı Proteomik çalışmaları.

<table><tbody><tr><td>Percoll</td><td>GE Sağlık</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Trisin</td><td>Roth</td><td>6977.2</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Promega</td><td>H5032</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Roth</td><td>8551.1</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Roth</td><td>8076.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>Sigma</td><td>B6506</td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-amino kaproik asit</td><td>Fluka</td><td>21530</td><td></td></tr><tr><td>3- (N-morfolino) propan sülfonik asit (MOPS)</td> <td>Roth</td><td>6979.3</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Roth</td><td>9286.2</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid stoğu: %30 (a/h) akrilamid, %0,8 (a/h) bisakrilamid</td><td>Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T-8133</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Roth</td><td>9592.1</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>USB</td><td>US12370</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>Jel boyama ortamı</td><td>Clini-sciences</td><td>GEN-QC-STAIN</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>CARLO ERBA</td><td>528151</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu</td><td>R&eacute; gilait</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>H/1150/PB15</td><td></td></tr><tr><td>KOH peletleri</td><td>Sigma</td><td>1.05012</td><td></td></tr><tr><td>NaOH peletleri</td><td>CARLO ERBA</td><td>480507</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HMA1 antikoru</td><td></td><td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td><td>1:1000 seyreltmede kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-KARI antikoru</td><td></td><td>Ferro ve al, 2010</td><td>1:1000 seyreltmede kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-LHCP antikoru</td><td></td><td>Vallon ve al, 1991</td><td>1: 25.000 seyreltme</td></tr><tr><td>P-kumarik asit</td><td>Sigma</td><td>C-9008</td><td></td></tr><tr><td>Luminol (3-aminofalhidrazin)</td> <td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO) kullanılır.</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Büyük (30 cm ve 45 cm) plastik kasalar</td><td>Puteaux</td><td>162135</td><td></td></tr><tr><td>A. thaliana tohumları</td><td></td><td></td><td>Bütün bir kasa için yaklaşık 30 mg tohum</td></tr><tr><td>Kompost "Floragard"</td><td>Puteaux</td><td>16311770</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme odaları</td><td></td><td></td><td>12 saatlik ışık döngüsü, 23 ° C'ye ayarlanmış; C (gün) / 18&derece; 150 &mu ışık yoğunluğu ile C (gece); mol/m2/s.</td></tr><tr><td>Müslin veya tülbent</td><td>Raffin</td><td>70116</td><td>80 cm genişliğinde</td></tr><tr><td>Naylon blutex 50 &mu; m diyafram</td><td>açıklığı Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td><td></td><td>50 &mu; m diyafram</td></tr><tr><td>açıklığı Motor tahrikli blender, üç hız, 1 galon (4 L) kapasite</td><td>Waring Blender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sabit açılı rotorlar JLA-10.500 (6 ve kez; 500 mL plastik şişeler)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman JA-20 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JA-20 (6 ve kez; 50 mL polipropilen tüpler)</td><td>Sorvall aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sallanan kova rotoru JS-13.1 (6 ve kez; 50 mL polikarbonat tüpler)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor (6 kez ve 13,2 mL ultra şeffaf tüpler)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor tüpleri (13,2 mL ultra şeffaf tüpler)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj (Beckman L7)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (Beckman JSE-06D18)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf 5415D veya eşdeğeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik bir tüp aracılığıyla bir Pasteur pipetine bağlı su pompası.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membranlar</td><td>BA85, Schleicher ve Schuell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>3MM, Whatman, Maidstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez cihazı elektroforez ile protein ayrımı için gerekli çeşitli aksesuarlarla (taraklar, plakalar ve döküm aparatı).</td><td>Bio-Rad Protean 3 veya eşdeğeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membranlara protein transferi için sistem</td><td>Bio-Rad Protean 3 veya eşdeğeri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kloroplast alt bölmeler arabidopsis üzerinden hazırlanması protein yerelleştirme immunoblotting veya proteomik analizi için

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Kloroplast bitki hücrelerinin önemli bileşenleridir. Böyle Plastitler asimilasyon karbon, kükürt ve azot gibi temel metabolitler sentezi gibi birçok önemli işlevleri yerine getirmek. Bu organelleri aşağıdaki üç anahtar alt bölmeler oluşur. İki membranlar tarafından karakterize zarf, organel çevreleyen ve diğer hücre bölmeleri ile Plastit iletişim denetler. Stroma kloroplast ve karbon dioksit karbonhidrat nerede dönüştürülür ana site çözünür aşamasıdır. Thylakoid membran grana (düz sıkıştırılmış keseleri) oluşan iç zar ağ ve lamellae (daha az yoğun yapıları), nerede temel fotosentez alır yer. Mevcut iletişim kuralı fark centrifugations ve Arabidopsisve onların ayırma sağlam kloroplast, Percoll degradeler kullanarak, sukroz degradeler, üç kullanarak arıtma gerekli adım adım yordamlar açıklanır alt bölmeler (Yani, zarf, stroma ve thylakoids). Bu iletişim kuralı da çeşitli kloroplast alt bölmeler için ilişkili işaretçileri kullanarak bu kesirler saflığı değerlendirmek izlenecek yönergeleri sağlar. Burada açıklanan yöntemi immunoblotting, ama aynı zamanda için kullanarak proteinlerin subplastidial yerelleştirme için değerlidir hücre altı ve subplastidial proteomik ve diğer çalışmalar.

Birbirini izleyen adımları arıtılmış kloroplast ve onların alt bölmeler ile sonuçlanan yordam Şekil 2' de sürdürülür. Percoll gradyan (Şekil 2A) sağlam kloroplast kırık kloroplast ve mitokondri (üst degradenin) veya çekirdek ve hücre artıkları (alt geçişin) ayırt sağlar. Bir ozmotik şok sayesinde Percoll saf organelleri rüptürü sonra ortaya çıkan kesirler sükroz degradeyi (Şekil 2B) ayrılır. Stroma (çözünür parçası kloroplast) sükroz geçişin yüzeyi ölü olarak yatıyor. Hafif zarf membran veziküller 0,6/0.93 M Sükroz arabiriminde ayrı bir sarı bant olarak kazanılmaktadır. En ağır thylakoid membranlar veziküller tüp alt kısmında yoğunlaşmıştır. Kurtarma, çamaşır ve iki membran kesirler konsantrasyon sonra proteinler sayılabilir ve tüm dört kesirler bileşimi bir SDS-sayfasında (Şekil 2C) analiz edilir. Şerit bir eşit protein olarak (her saf kesir 20 µg) yüklenir. Kloroplast yalnızca zarf proteinlerin % 1 ve % 50 proteindir stroma veya thylakoids içeren bilmek, bu çapraz bulaşma arıtılmış zarf hazırlıkların diğer kloroplast alt bölmeler ile abartma eğilimindedir. Ancak, bu yöntem zarf kesir çapraz kirletici proteinlerin dakika miktarları tespit etmek için izin verir. İşaretleyicileri her bölmesi (Yani, bol protein) üzerinden kesirler çapraz bulaşma değerlendirilmesinde çok faydalıdır. Gerçekten de, thylakoid ve zarf membran kesirler çok düşük miktarlarda büyük alt birimi, RuBisCO (RBCL), (50 kDa) stroma en bol protein içeren bekleniyor. Kırık kloroplast nedeniyle bu stromal protein8kaybı sağlam kloroplast üzerinden kolayca ayırt edilebilir. Karmaşık proteinleri (LHCP) hasat ışık zar zor gerekir 25-kDa bol thylakoid bileşen vardır (% 3 daha az) zarf membranlar9kontamine. Son olarak, fosfat Trioz fosfat ışınlama (trompet), yani ancak saf zarf kesir onun güçlü zenginleştirme nedeniyle görülür bir 30-kDa proteinidir (Yani, 50-100 x) için bütün kloroplast karşılaştırıldığında zarf kesir ayıklar. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, kloroplast alt bölmeler genellikle kötü çapraz-western-blot analizleri (2D rakam) yönettiği tüm üç alt bölmeler bilinen işaretleri karşı antikorlar güvenerek kullanarak doğruladı olarak kirlenmiş: stroma dan çözünür ketol-asit reductoisomerase (KARI), kloroplast zarf bakır ATPaz (HMA1) ve karmaşık proteinleri (LHCP) hasat ışık thylakoid membranlar. Üç alt bölmeler çapraz bulaşma immunoblotting ve kütle spektrometresi analizleri9kullanarak sayılabilir. Stroma genellikle zarf veya thylakoid fraksiyonları tarafından kontamine değil, saflaştırılmış zarf kesirler %3 thylakoid protein içerir ve proteinlerin % 10 ilâ stroma üzerinden. Proteinler stroma gelen kötü thylakoid membranlar (az % 1) kontamine ancak thylakoids zarf membran proteinlerinin % 3'e kadar içerir. Böylece kloroplast proteinler, mevcut yöntemi hakiki subplastidial konumunu belirlenmesinde önemli bir rol olması da subplastidial yerelleştirme kaynaklanan proteinlerin hakkında hatalı sonuçlar sınırlar daha contaminations çapraz.
<img alt="Kloroplast yapı diyagramı; zarf membranları, tilakoid membranlar, grana, stroma detayları." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: kloroplast alt bölmeler temsilcisi düzeninin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Kloroplast izolasyon deneyi; Kloroplast fraksiyonlarının analiz edildiği SDS-PAGE ve Western blot sonuçları." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: sağlam kloroplast arınma ve onların üç ana alt bölme Percoll ve sukroz degradeler kullanarak. A. kırık ve bozulmamış kloroplast ayrılması sağlayan Percoll gradyan. B. stroma, zarf ve thylakoid kesirler ayrılması sağlayan sükroz degrade. C. temsilcisi SDS-sayfa proteinlerin sağlam kloroplast ve her alt kartı yuvası üzerinden bol işaretleri görselleştirmek için izin üç ana alt bölmeler. Her lane proteinlerin 10 µg içerir. Moleküler Ağırlık işaretleri: RBCL, RuBisCO (stroma için işaretleyici); in büyük alt birimi Trompet, fosfat/Trioz-fosfat ışınlama (zarf için işaretleyici); LHCP, karmaşık proteinleri (thylakoid için işaretleyici) hasat ışık. D. her alt kartı yuvası belirli işaretleri (belirli antikorları kullanarak) tespit etmek için izin Western-blot deneyler: kloroplast zarf bakır ATPaz HMA110, karmaşık proteinleri LHCP thylakoid dan hasat ışık Membranlar11ve stroma9ketol-asit reductoisomerase KARI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Burada, Arabidopsis yaprakları ve onların üç ana alt bölmeler (zarf, stroma ve thylakoids) sağlam kloroplast arındırmak için bir yöntem tarif fark centrifugations, sürekli Percoll degradeler, bir arada kullanarak ve iş öğelerinin sürekli olmayan sükroz degradeler. Subplastidial ve immunoblotting ve proteomik proteinlerin hücre altı yerelleştirme için önemli bir yöntemdir.

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Bu tekniğin en büyük avantajı, zarf, stroma veya thylakoid membranlarda lokalizasyona bağlı olarak, farklı rollere sahip benzer aktivitelerin proteinlerinin ayırt edilebilmektedir. Genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek, onlar çok eski bitkiler kullanacak, çok uzun süre yaprak karışımı, ya da bozulmamış pelet yeniden askıya alırken yeterince dikkatli olmayacaktır, ama kırılgan, kloroplast. Bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir, çünkü percoll'dan veya sakaroz gradyan basamaklarından kesirin yüklenmesi veya kurtarılması nı öğrenmek zordur.Çünkü degradelerin karıştırılmariski ve böylece çeşitli kloroplast alt fraksiyonları çapraz kontamine. Prosedürü gösteren Imen Bouchnak, bizim laboratuvar ve Lucas Moyet, bir kapalı mühendis bir doktora öğrencisi tarafından olacaktır. Başlamak için, günde 23 derece santigrat ve gece 18 santigrat derece 12 saatlik ışık döngüsü ile beş hafta boyunca arabidopsis bitkileri büyümek, saniyede metrekare başına 150 mikromoler Bir ışık yoğunluğu ile.Ertesi gün, beş litrelik bir kabı önceden tartın ve sonra buzüzerine yerleştirin. Hasat arabidopsis yaprakları, herhangi bir toprak toplama önlemek için emin olun. Kabı yeniden tartın ve doku ağırlığını kaydedin.Hasat edilen yaprakları soğuk bir odaya aktarın. Yaprakları iki litre öğütme tamponu içeren bir blender yerleştirin ve her seferinde iki saniye süreyle yüksek hızda üç kez karıştırarak onları homojenize edin. Bir süzgeç içine muslin ve naylon mavi tex bir tabaka dört kat yerleştirin ve bu homojen filtre.Yavaşça muslin ve mavi tex içinde sıvı tüm ayıklamak için karışık yaprakları sıkmak. Blender kabında kalan doku kurtarmak ve taze taşlama tampon kullanarak homojenizasyon işlemi tekrarlayın. Daha önce açıklandığı gibi yeni bir beher bu yeni homogenate filtrelemek için yeni muslin dört ila beş kat kullanın.Ham hücre ekstresini altı adet 500 mililitrelik şişeye eşit olarak dağıtın. Şişeleri buza koy. Soğutulmuş şişeleri 2070 G ve dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin.Bundan sonra, yavaşça supernatant atın. Kalan supernatant aspire ve konsantre ham kloroplast içeren pelet tutmak için bir su pompası kullanın, buz üzerinde. 10 mililitrelik pipet kullanarak, her şişeye üç mililitre yıkama ortamı ekleyin ve kloroplastları kırmamak için ince pipet uçları kullanmamaya özenli olun.Daha sonra, peletleri yavaşça yeniden askıya almak için bir boya fırçası veya kavisli plastik spatula kullanın. 10 mililitrelik pipet kullanarak, tek bir tüpte yeniden askıda kloroplastları toplayın. Homojen kloroplast süspansiyonu elde etmek için tüpü hafifçe ters çevirin.Başlamak için, 10 milileter pipet kullanarak altı mililitre kloroplast süspansiyonunu hazırlanan altı percoll gradyanının her birine yavaşça yükleyin. Sallanan kova rotor kullanarak, 13, 300 G ve dört derece santigrat derece 10 dakika degradeleri santrifüj. Kırık kloroplastlar ve bozulmamış mitokondri içeren üst faz, aspire etmek için bir su pompası kullanın.Daha sonra, alt fazda bulunan bozulmamış kloroplastları almak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın, sağlam kloroplastlar ile birlikte tüpün dibinde bulunan çekirdekleri ve hücre enkaz aspire değil dikkatli olmak. Yıkama ortamı ile bozulmamış kloroplast süspansiyonu 3-4 kat seyreltin. SDS-Page ve Batı lekeleme tarafından daha fazla analiz için bozulmamış kloroplast fraksiyonu bir aliquot yaklaşık 10 mililitre tutun.Santrifüj 2070 G ve dört santigrat derece iki dakika. Bundan sonra, yavaşça supernatant atın. Kalan supernatant aspire ve konsantre ham kloroplastlar içeren pelet tutmak için bir su pompası kullanın, buz üzerinde.Saflaştırılabilen kloroplastları yumuşatmak için, proteaz inhibitörleri içeren hipotonik ortamda peleti yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan kloroplastları 10 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Metin protokolünde belirtildiği gibi sakaroz degradesini hazırlayın.Peristaltik bir pompa kullanarak, önceden oluşmuş sakaroz degradelerinin her birinin üzerine üç mililitre lysed kloroplast yükleyin. Tüp çiftlerini dengelemek için hipotonik orta tampon kullanın ve ardından bir saat boyunca 70, 000 G ve dört santigrat derecede degradeyi ultra-santrifüj edin. Protein konsantrasyonunun belirlenmesinde kullanılmak üzere çözünür stromal proteinlerin bir aliquot alın.Daha sonra, sarı bant kadar degrade kalan üst faz aspire etmek için bir su pompası kullanın. Bir pipet kullanarak, zarf olan sarı bandı alın. Zarfları tek bir tüpe çek.Daha sonra, thylakoid pelet kadar degrade kalan faz kaldırın. Proteaz inhibitörleri ile membran yıkama tamponundaki thylakoid peletleri yeniden askıya alın. Tylakoid süspansiyon u seyreltin ve zarf yıkama ortamı ile üç ila dört kat, 10 mililitre için son hacmi ayarlayarak.Membran yıkama tamponu ve ultra-santrifüj ile tüpler denge çiftleri 110, 000 G ve bir saat için dört derece santigrat onları. Bundan sonra, dikkatle supernatant aspire etmek için bir su pompası kullanın. Zarf peletine yaklaşık 100 mikrolitre membran yıkama tamponu ekleyin.Sonra, thylakoid tüpten supernatant aspire. Membran yıkama tamponüç mililitre thylakoid pelet yeniden askıya. Diğer deneylerde kullanılmak üzere üç saf alt bölmeyi sıvı nitrojende saklayın.Membran fraksiyonları kurtarıldıktan, yıkandıktan ve yoğunlaştıktan sonra, SDS-Page proteinleri ölçmek ve dört fraksiyonun bileşimini analiz etmek için kullanılır. Stromadan en bol protein RBCL'dir ve temsili sonuçlar beklenen sonucu gösterir, bu proteinin büyük alt ünitesinin çok azı thylakoid ve zarf membran fraksiyonları içerir. Işık hasat karmaşık proteinler ancak zarf membranlar kontamine olmalıdır bol thylakoid bileşenleridir.Son olarak, fosfat triose fosfat translocator sadece saflaştırılmış zarf fraksiyonu görülebilir, zarf fraksiyonu güçlü zenginleştirme nedeniyle tüm kloroplast özleri ile karşılaştırıldığında. Üç alt bölmenin çapraz kontaminasyonu, stromadan çözünür ketol-asit reduktoisomeras, kloroplast zarf bakır ATPase ve thylakoid membranlardan gelen ışık toplama karmaşık proteinleri hem immünoblotting hem de kütle spektrometresi analizi kullanılarak ölçülebilir. Stroma genellikle zarf veya thylakoid fraksiyonları ile kontamine olmasa da, saflaştırılmış zarf fraksiyonları % 3 thylakoid proteinler ve stromadan proteinlerin %10'a kadarını içerir.Thylakoidler stromadan gelen proteinler tarafından kötü kontamine edilirler, ancak zarf membran proteinlerinin %3'ünü içerirler. Kloroplastlar karbon asimilasyon gibi birçok önemli işlevleri gerçekleştirmek, kükürt, ve azot, yanı sıra temel metabolitlerin sentezi. Kloroplast fizyolojisini kontrol eden yeni düzenleyici mekanizmalarıde deşifre etmek için, kloroplast proteinlerinin surplast lokalizasyonunun tanımlanması süper hedefli çalışmalar için çok önemlidir.Kloroplastlar çeşitli alt bölmeler içerir. Bu yöntem, spesifik kloroplast proteininin organel içinde bulunduğu yer gibi kloroplast alanındaki anahtar soruların yanıtlatılabılabilir. Bu prosedürü çalışırken, protea saf fraksiyonları içine direnmek emanet etmek için dört derece kloroplast izolasyon adımlarını tüm yapmak için hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, plastid alt bölmelerinin proteomunun bileşimi ve dinamiği gibi ek soruları cevaplamak için lascare proteomik yaklaşımlar gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra bitki fizyolojisi alanında araştırmacıların plastid alt bölmelerinde tanımlanan aday proteinlerin hedefli analizini kullanarak kloroplast biyogenezinin ve fonksiyonunun birçok farklı yönünü keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Proteaz inhibitörleri gibi belirli bileşikler üzerinde hacim blender, sıvı nitrojen ile çalışmanın özel bakım gerektirdiğini unutmayın.Bu işlemi yaparken eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takmagibi önlemler her zaman alınmalıdır.

preparation-chloroplast-sub-compartments-from-arabidopsis-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Burada stres altında izole kloroplastların içine protein ithalat incelemek için yeni bir yöntem tarif. yöntemi hızlı ve basittir ve kloroplast protein alma için farklı stres koşullarında sonuçlarını ve ilgili düzenleyici mekanizmaları incelemek için uygulanabilir.

Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Biz burada fizyolojik aktif thylakoids yüksek verimli izolasyon için protokoller ve protein taşıma deneyleri kloroplast ikiz arginin translocation (cpTat), salgı (cpSec1) ve sinyal tanıma parçacık (cpSRP) yolu için mevcut.

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

Bu protokol, virüs-plazmodesmata etkileşimleri veya plazmodesmal transport sırasında plazmodesmataya protein hedeflemenin konfokal mikroskopi tabanlı analizleri için optimal plazmodesmal belirteçlerin seçimini açıklar.

Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

Bu protokol, Arabidopsis thaliana tohumlarında endosperm hücre tabakasının sağlam örneklerinin hazırlanmasını açıklar. Yöntem, yalnızca enjeksiyon iğnesi ve hassas forseps gibi yaygın laboratuvar ekipmanı gerektirir ve hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlardaki endosperm hücrelerinin yüksek çözünürlüklü floresan canlı hücre görüntülemesini sağlar.

Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Öğrenin Arabidopsis yapraklarından kloroplast alt bölmelerini (zarf, stroma, tilakoid) saflaştırma yöntemini. Bu teknik, diferansiyel santrifüjasyon ve gradyan yöntemleriyle protein yerelleştirme çalışmaları için güvenilir bir protokol sunar.

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Daha fazla video keşfet