Name: Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Öğrenin, mikro-CT görüntüleme ile sıçan beynindeki lezyonları ve elektrot konumlarını kesme yapmadan 3D olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, sinirbilim araştırmalarında yapı-işlev ilişkilerini zararsız incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Greg Lin ve Arthur McClelland kendi uzmanlık için mikro-CT makine, David Richmond ve Hunter Elliott, görüntü ve veri analizi çekirdek (IDAC), Harvard Tıp Okulu tavsiye işleme görüntü için ve William Liberti, Boston ile teşekkür ederiz Üniversite nezaketle zebra finch beyin sağlamak için. Bu eser için nano sistemleri (CNS), bir üye, Ulusal Nanoteknoloji koordine altyapı ağı (NSF Ödülü No 1541959 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen NNCI), kısmen merkezinde gerçekleştirildi. CNS Harvard Üniversitesi'nin bir parçasıdır. Bu eser Richard ve Susan Smith Aile Vakfı ve IARPA (sözleşme #D16PC00002) tarafından desteklenmiştir. S.B.E.W. insan sınır bilim programı (HFSP; dan arkadaş grupları tarafından desteklenmiştir LT000514/2014) ve Avrupa Moleküler Biyoloji organizasyon (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. Ulusal Bilim Vakfı (NSF) yüksek lisans araştırma bursu programı (GRFP tarafından) destek verdi.

Tüm bakım ve deneysel hayvan manipülasyon gözden geçirilmiş ve Harvard kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış. Burada açıklanan perfüzyon sıçanlara özgüdür, ancak yordamı herhangi bir hayvan daha küçük veya benzer şekilde ölçekli akıllı için geçerlidir.
1. perfüzyon
<ol><li>1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hazırlamak. Bir fare için (Yaş: 0.5-1.5 yaşında, ağırlık: 250-600 g), 800-1000 mL-meli var olmak yeterli. 400 mL hayvan ve sabitleştirici sulandırmak için ek bir 400 mL sıvı için kullanın.</li>
	<li>%2 (w/v) paraformaldehyde (PFA) ve % 2.5 (w/v) oxazolidin (GA) 1 x PBS oluşan sabitleştirici hazırlayın. Bir fare için 400 mL yeterli olur. 50 mL 50 mL konik tüp beyin perfüzyon sonra sonrası fiksasyonu için kaydedin.</li>
	<li>15 dakika (0, 8 L/dk O2 21 ° c 1,0 bar), 4 – %5 isoflurane gaz fareyle anestezi.</li>
	<li>İntraperitoneally sodyum Fentobarbital öldürücü bir doz enjekte (180 mg/kg).</li>
	<li>Hayvan refleks kaybı bir ayak parmağı-çimdik refleks sınav yaparak sınayın. Hayvan onun refleks yanıt kaybedene kadar perfüzyon başlamasını bekleyin.</li>
	<li>Yukarıda açıklanan intracardial perfüzyon ve beyin ayıklama Protokolü14 aşağıdaki çözümleri ile izleyin: 400 mL 1 x PBS 125 mm Hg kan kaldırmak için hayvanla sıvı. Bir kez tüm kan kaldırılır ve 1 x PBS ile değiştirilir, İngiltere'de yılın ve 1 x PBS 125 mm Hg içinde çözünmüş % 2.5 GA ile 400 mL % 2 lik ventriküler başlar. Not: yordamı bir sıçan değil bir hayvan içinde yürütülmektedir, perfüzyon yordamı yalnızca önemli bileşenleri 1 x PBS ve % 2 kullanımı vardır PFA, 1 x PBS % 2.5 GA. Çözüm birimleri ve perfüzyon basıncı türler göre ayarlanabilir.</li>
</ol>2. sonrası fiksasyon
<ol><li>Ayıklanan beyin % 2 yer PFA, 1 PBS çözüm (hayvan daha önce sıvı için kullanılan aynı çözüm) x % 2.5 GA. Çözüm birimin en az 10 beyin hacmi x olduğundan emin olun. Fareler için bir 50 mL konik tüp 50 mL çözeltisi ile beyin yerleştirin. Örnek 2-3 gün, 4 ° C'de hafifçe sallayarak sonrası fiksasyon saklayın Not: örnek bir 50 mL konik tüp içinde ise, yatay bir orbital çalkalayıcı yerleştirerek en iyi sonuçları garanti eder.</li>
	<li>Örnek uzun süre yeterli sonrası sabit olmuştur sonra örnek çift distile su (GKD2O), de-iyonize su (diH2O) veya Ultrasaf Su yıkama ( Tablo malzemelerigörmek) dört kez aşağıdaki süreler için: 1, 1, 1 ve 15 dak. Not: Bu iletişim kuralı için GKD2O, diH2O veya Ultrasaf Su değiştirilebilir olmalıdır. Kolaylık olması için GKD2O arıtılmış su için bundan böyle başvurmak için kullanılır.</li>
</ol>3. boyama
Dikkat: Bu adımda, eldiven kullanırken bir başlık altında tüm çözüm hazırlıklarını yaparlar.
<ol><li>En az 10 çözüm boyama beyin hacmi x hazırlamak. Sıçan beyin yerine %2 (w/v) osmiyum tetroxide (OsO4) 50 mL GKD2içinde O 25 mL hisse senedi % 4 OsO4 çözeltisi ve 25 mL GKD2O. birleştirerek hazırlamak Dikkat: osmiyum tetroxide uçucu ve geçici körlük ve solunum sorunlarına neden olabilir eğer değil gerektiği gibi. Osmiyum tetroxide ikincil bir kapsayıcı içindeki bir uygun kimyasal tehlike kapsayıcıda başvurun tüm malzemeleri atmak.</li>
	<li>Beyin bir yeni 50 mL konik tüp içinde yerleştirin ve OsO4 çözüm ekleyin. Beyin dokusunda lipidler ile4 tepki OsO olarak kahverengi açmak başlamalıdır.</li>
	<li>Tüp kapatın ve iyice parafin ile mühür kuluçka sırasında kaçak değil emin olmak için (bkz. Tablo reçetesi) film. Not: Osmiyum kırılgandır ve tüp düzgün mühürleme çok önemlidir bu yüzden hafif Tüp, plastik ile tepki olacaktır. Ek koruma için alüminyum folyo ile tüp kaydırılmış olabilir.</li>
	<li>Kapalı tüp hafifçe bir orbital çalkalayıcı 50 RPM 2 hafta boyunca sallayarak 4 ° C'de depolayın. Yatay olarak en iyi karıştırma sağlamak için tüp yerleştirin. Örnek tamamen sallayarak süre çözümde batık emin olun. Not: osmiyum sürekli dolaşmaya izin verilmiyorsa, shaker yatay yerleşim çok önemlidir bu yüzden bunu tam olarak örnek zorlayarak elde değil.</li>
</ol>4. katıştırma
<ol><li>Örnek 2 hafta boyunca OsO4 ' te inkübe sonra GKD2O 5 kat, oda sıcaklığında (RT) ile aşağıdaki süreler için temizleyin: 1, 1, 1, 15 ve 60 dk tüm ilişkisiz OsO4 örnek kaldırmak için. Not: son 60 dk değişimi dahil birden çok değişim tüm osmiyum dolaşım sisteminin dışarı diffüz izin vermek gereklidir.</li>
	<li>GKD2O 30 dk için örnekle 4 ° C'de yıkama Not: Osmiyum örnek dışında diffüz devam edebilir, ancak onun miktarı büyük ölçüde önceki adımından azaltılmalıdır.</li>
	<li>Sonunda reçine ile sızmak için etanol ile örnek kurutmak. Kurutmak için aşağıdaki etanol dilutions (30 min için her 4 ° C'de) 10-20 mL GKD2O değiştirin: % 20 (v/v) etanol ve %80 (v/v) GKD2O; % 50 (v/v) etanol ve % 50 (v/v) GKD2O; % 70 (v/v) etanol ve %30 (v/v) GKD2O; % 90'ı (v/v) etanol ve % 10 (v/v) GKD2O; % 100 etanol.</li>
	<li>Aseton/reçine dilutions aşağıdaki gibi hazırlayın.<ol>
<li>Reçine 100 mL ( Tablo malzemelerigörmek) gömmek için üreticinin talimatina hazırlayın.</li>
		<li>% 33 (v/v) reçine - %67 aseton çözüm yapmak, reçine 15 mL 50 mL konik tüp içine dökün ve % 100 cam distile aseton 30 mL ekleyin.</li>
		<li>% 50 (v/v) reçine - %50 aseton yapmak, reçine 22,5 mL 50 mL konik tüp içine dökün ve % 100 cam distile aseton 22,5 mL ekleyin.</li>
		<li>%67 (v/v) reçine-% 33 aseton çözüm yapmak, reçine 30 mL 50 mL konik tüp içine dökün ve % 100 cam distile aseton 15 mL ekleyin.</li>
		<li>Reçine kalan 32,5 mL % 100 reçine aşağıdaki ilk çözüm olarak kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek 10-20 mL aşağıdaki aseton ve aseton/reçine dilutions ile hareket ettirerek reçine infiltrasyon işlemine başlamak: % 100 aseton 30 dk 4 ° c; 4 ° C'de 30 dk için % 100 aseton; ve % 100 aseton (RT) Oda sıcaklığında 30 dakika. Not: İnfiltrasyon işlemi geri kalanı RT. yer alacak</li>
	<li>Örnek % 33 (v/v) reçine % 67 aseton RT, 3 h için o zaman % 50 (v/v) reçine - %50 aseton, RT, %67 (v/v) reçine % 33 aseton RT, 3 h için ve % 100 reçine için RT. 12 h 3 h için bırakın</li>
	<li>Tabi belgili tanımlık öğretim şişesinde reçine bir taze 50 mL toplu iş yapmak. Örnek içinde bu tedavi edilebilir kaba transfer (Örn., Malzemeler tabloiçinde açıklanan tek kullanımlık kalıpları). Örnek 4 saat RT. taze % 100 reçine ile demlemek Not: taze reçine kullanılırsa, önceki gün yapılan reçine zamanından önce sertleşmesine başlar ve örnek işlemek zor olacak.</li>
	<li>Degas örnek bir vakum fırında 45 ° C'de 15 dakika Not: Bu adım herhangi bir kapana kısılmış hava kabarcıkları örnek içinde kaldırmak yardımcı olacaktır, ama gerekli olmayan ve verilerin kalitesini etkilemez.</li>
	<li>Son olarak, örnek bir fırın 60 ° C'de 48 h için tedavi</li>
</ol>5. mikro-CT
<ol><li>Bir kez tedavi örnek tek kullanımlık kalıp soyma ve mikro-CT makine ile tarayın. Not: kullanılan makine bağlı olarak ayarları farklı olacaktır. Malzemeleri tablodalistelenen yazarlar tarafından kullanılan tarayıcı için önerilen ayarları 130 olan kV, 135 µA 0,1 mm bakır filtre ve molibden kaynak, 1 saniye pozlama ve ortalama bir projeksiyon 4 kare ile. Birçok faktör optimum ayarlar belirli bir oturum sırasında etkileyecek gibi ancak, Denemecileri tarayıcı ayrı ayrı ayarlamak.</li>
	<li>Tarama tamamlandığında, tarayıcı yazılımı ile bir bilgisayarda deneyci'nın tarayıcı/yazılım birleşimi için önerilen parametrelerle örnek yeniden.</li>
	<li>Son olarak, görselleştirmek ve deneyci'nın yazılım kullanarak yeniden oluşturulan dijital ses analiz (örnekler için bkz: Tablo malzeme ).</li>
</ol>

<ol><li>Scoville, W., Milner, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10678523">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).</li>
<li>Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+Phineas+Gage%3A+clues+about+the+brain+from+the+skull+of+a+famous+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient.</a> Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).</li>
<li>Kawai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+is+required+for+learning+but+not+for+executing+a+motor+skill%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill.</a> Neuron. 86, 800-812 (2015).</li>
<li>Otchy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+off-target+effects+of+neural+circuit+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acute off-target effects of neural circuit manipulations.</a> Nature. 528, 358-363 (2015).</li>
<li>Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+the+anterior+thalamus+in+directing+attention+to+task-relevant+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli.</a> Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).</li>
<li>Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+exposure+to+combination+paradigm+of+environmental+enrichment%2C+physical+exercise+and+diet+reverses+the+spatial+memory+deficits+and+restores+hippocampal+neurogenesis+in+ventral+subicular+lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).</li>
<li>Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+NBM-+lesion+on+synaptic+plasticity+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats.</a> Brain Research. 1655, 122-127 (2017).</li>
<li>Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+visual+motion+representation+in+mouse+area+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex visual motion representation in mouse area V1.</a> Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).</li>
<li>Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28063155">Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).</li>
<li>Wood, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+honeycomb+maze+provides+a+novel+test+to+study+hippocampal-dependent+spatial+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation.</a> Nature. , (2018).</li>
<li>Vermaercke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+in+rat+occipital+and+temporal+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551, 232-236 (2017).</li>
<li>Masís, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((micro-CT-based+method+for+quantitative+brain+lesion+characterization+and+electrode+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization.</a> Scientific Reports. 8, 5184(2018).</li>
<li>Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, 3564(2012).</li>
<li>Helander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+formaldehyde+binding+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue.</a> Biotechnic & Histochemistry. , (1994).</li>
<li>Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+aldehyde+fixation+for+electron+microscopy%3A+stabilization+of+rat+brain+tissue+to+withstand+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress.</a> Histochemical Journal. , (1979).</li>
<li>Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X91902315">Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds.</a> Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).</li>
<li>Bahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+and+ruthenium+tetroxide+and+their+reactions+with+biologically+important+substances%3A+electron+stains+III%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III.</a> Experimental Cell Research. , (1954).</li>
<li>Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+of+osmium+tetroxide+with+lipids+and+other+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).</li>
<li>Riemersma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+fixation+of+lipids+for+electron+microscopy+a+possible+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).</li>
<li>Mikula, S., Binding, J., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+embedding+the+whole+mouse+brain+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy.</a> Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).</li>
<li>Mikula, S., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-brain+staining+for+electron+microscopic+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction.</a> Nature Methods. 12, 541-546 (2015).</li>
<li>Crespigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+micro-CT+imaging+of+the+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D micro-CT imaging of the postmortem brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+Iodine-Based+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast.</a> PLoS One. 10, 0142974(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027284">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532, 122-126 (2016).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+reveals+mekk3+heterozygosity+prevents+cerebral+cavernous+malformations+in+Ccm2-Deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice.</a> PloS One. 11, 0160833(2016).</li>
<li>Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+Micro-CT+imaging+of+cerebral+cavernous+malformations+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10860789">Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain.</a> Neuroimage. 11, 601-611 (2000).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+episcopic+microscopy%3A+a+rapid+technique+for+high+detailed+3D+analysis+of+gene+activity+in+the+context+of+tissue+architecture+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol%22%5BJournal%5D)">High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology.</a> Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).</li>
<li>Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+magnetic+paragraph+sign+resonance+imaging+of+mouse+embryonic+paragraph+sign+anatomy+using+a+fast+gradient-echo+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22MAGMA%22%5BJournal%5D)">high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence.</a> MAGMA. 16, 43-51 (2003).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Three-Dimensional+microelectrode+brain+mapping+using+stereo+microfocal+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging.</a> Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).</li>
<li>Borg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+metal+electrodes+in+the+intact+rat+brain+using+registration+of+3D+microcomputed+tomography+images+to+a+magnetic+resonance+histology+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas.</a> eNeuro. 2, (2015).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+chronic+brain+mapping+at+the+single-neuron+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level.</a> Nature Methods. 13, 875-882 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protokol için önemli adımlar şunlardır: ilk olarak, İngiltere'de yılın ve GA hayvan sıvı ve daha sonra beyin sonrası düzeltmek için bir arada kullanımı tutarlı tam osmiyum penetrasyon dokusunun ulaşmak için her şeyden. Her ne kadar biz bu açıkça did değil sınav, GA fiksasyon değil tersinir16,17ise makul bir açıklama PFA fiksasyon tersinir15, olmasıdır. Bir iki haftalık kuluçka osmiyum tetroxide içinde tam doku infiltrasyonu için gerekli ol...

Nörologlar lezyonlar uzun süre üzerinde işlev ve beyin konumda arasındaki ilişkiyi anlamak için güveniyorlar. Örneğin, öğrenme ve hafıza için vazgeçilmez olarak hipokampus ve dürtü kontrol için anahtar olarak prefrontal korteks anladığımız kadarıyla her iki ürün insanlar1,2serendipitous lezyonların edildi. Ancak, hayvan modelleri kullanımını nörologlar lezyonlar serendipity ötesine giderek yararlanmak izin verdi ve sayısız beyin bölgeleri fonksiyonu yapı-fonksiyon ilişkilerin sistematik çalışmalar aracılığıyla aydınlatılmamıştır lezyonlar3,4.
Doğru işlevi için bir yapı atamak için ancak, eksik bir alandır kesin miktar yordamlar lezyon çalışmaları gerektirir. Bölüm, bağlama, bir ışık mikroskobu ile görüntü beyin lezyonlar miktarının geçerli altın standart etmektir. Görüntülü dilimleri sonra bir atlas en yakın bölümleri için eşleştirilir ve konular arasında lezyonların yaklaşık koordinatları dolaylı olarak, genelde kamera lucida görüntüleri veya örnek histolojik dilimler3,4 kullanılarak raporlanır ,5,6,7,8,9,10.
Tutarsızlık mevcut lezyon miktar yordamlar, bu teknikleri zaman alan ve hata eğilimli. Küçük değişiklikler beyin sertlik, bıçak netlik ve sıcaklık berbat, çarpık ya da bozuk bölümleri için yol açabilir. Bölümleri de düzensiz leke olabilir ve yanlış montaj orta kabarcıkları nedeniyle yansıması. Önemlisi, kesit üzerine, beyin konumda lezyon'ın üç boyutlu bağlamında, beyin zorlu lezyon kesin 3D yeniden yapım kaybolur.
Lezyonlar için başka bir ortak uygulama tek ve birden çok elektrot kayıtları beyindeki konumunu belirlemek için olmuştur. Son kayıt oturumu sonunda, araştırmacılar küçük elektrolitik lezyonlar elektrot uç teşvik ve beyin histolojik olarak bir geleneksel lezyon deneme11' olarak işlemek. Bu teknik elektrolitik lezyonlar genellikle onları yapmak için kullanılan elektrotlar büyüktür ama genellikle küçük varlık ki ek sorunları yukarıda açıklanan aynı dezavantajları bu histolojik olarak bulmak için meydan uğrar. Birden çok elektrotlar eklendiğinde tetrot dizi durumunda olduğu gibi doğrulama elektrolitik lezyon üzerinden bile daha zordur. Daha sonra histolojik olarak12doğrulamak için elektrot üzerine boya kullanımı elektrolitik lezyonlar için bir diğer seçenek olmakla bu tekniği ile geleneksel Histoloji gel aynı sakıncaları çekiyor.
Burada, biz ayrıntılı tarif elektron mikroskobu (EM) ve x-ışını teknikleri boyama dayalı bir son zamanlarda açıklanan yöntemi13 bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) lezyonlar quantifies ve akım daha iyi küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulur yöntemleri. Mikro-CT içinde bir scintillator tarafından örnek olamaz değil röntgen toplarken 360 ° döndürülmüş bir örnek x-ışınları ateş bir görüntüleme tekniğidir. Herhangi bir yönde görüntülenir ve tam sayısal örnek bir yüksek çözünürlüklü dijital 3D yeniden yapılanma sonucudur. Birçok akademik kurum are da elde edilebilir ticari olarak mikro-CT tarayıcıları var.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>15710</td><td>2X PBS'de %1 (a/h/)</td></tr><tr><td>Glutaraldehit (GA)</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>1x PBS'de %2,5 (a/h) GA</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>Çeker ocakta çalışma</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>Koptec</td><td>140, 190, 200 kanıt</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>EMS</td><td>10015</td><td>Camla damıtılmış</td></tr><tr><td>Durcupan ACM reçinesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44610</td><td>A, B, C ve D bileşenleri, gömme için reçine</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık kalıplar</td><td>Ted Pella</td><td>27114</td><td>Önerilen</td></tr><tr><td>milliQ su (ultra saf su)</td><td>Millipore Sigma</td><td>QGARD00R1 (veya ilgili arıtıcı)</td><td>Önerilen</td></tr><tr><td>Parafilm (parafin filmi)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td>Önerilen parafin filmi</td></tr><tr><td>Mikro-CT tarayıcı</td><td>Nikon Metrology Ltd., Tring, Birleşik Krallık</td><td>X-Tek HMS ST 225</td><td>Yazarlar tarafından kullanılır</td></tr><tr><td><güçlü>Mikro-CT taramalarını görselleştirmek ve analiz etmek için yazılım: </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Hacimli Grafikler</td><td>VG Studio Max</td><td>Yazarlar</td></tr><tr><td></td> tarafından kullanılır <td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Avizo</td><td>Yazarlar</td></tr><tr><td></td> tarafından kullanılır <td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Amira</td><td>, Avizo</td></tr><tr><td></td><td>Mark Sutton'a Benzer & Russell Garwood</td><td>Spiers Ücretsiz</td><td>, http://spiers-software.org/</td></tr> <tr><td></td><td>Pixmeo Sarl</td><td>Osirix Lite</td><td>Ücretsiz, https://www.osirix-viewer.com/</td></tr> <tr><td></td><td>Açık Kaynak</td><td>FIJI</td><td>Ücretsiz, https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td></td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td>Her seferinde bir dilimi analiz etmek için iyi</td></tr></tbody></table>

lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-ct-esaslı yöntem

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lezyon ve elektrot konumu doğrulama geleneksel yolu ile histolojik inceleme lekeli Beyin dilimleri, el ile tahmini gerektirir zaman alıcı bir işlem yapılır. Burada, lezyonlar miktarının ve elektrotlar daha az zahmetli ve daha ayrıntılı sonuçlar verir beyin bulmak için basit, kolay bir yöntemi açıklanmaktadır. Bütün beyin osmiyum tetroxide ile lekeli, reçine gömülü ve mikro-CT tarayıcı ile görüntüsü. 3D dijital birimleri kararları ve sanal bölüm kalınlıkları örnek boyutu üzerinde bağımlı ile beyin taramaları sonucunda (voxel sıçan ve zebra finch için başına 12-15 ve 5-6 µm beyin, sırasıyla). Yüzey ve derin lezyonlar ile karakterize ve tek tetrodes, tetrot diziler, elektrolitik lezyonlar ve silikon sondalar de yerelleştirilmiş olabilir. Özgür ve özel mülk yazılım Denemecileri el ile veya otomatik olarak herhangi bir uçak ve segment birim numune hacmi incelemek izin verir. Bu yöntem tüm beyin hacmi oluşturduğu için lezyonlar ve elektrotlar karşılaştırmaları içinde ve çalışmalar arasında standart hale getirmek yardımcı olacaktır geçerli yöntemleri çok daha yüksek derecede sayısal.

Geleneksel olarak, beyin kesitli ve lezyonlar ölçmek ve elektrotlar bulmak için lekeli, ancak bu yöntem hataya, emek yoğun ve genellikle tahmin sonuçları gerektirir. Bütün beyin mikro-CT görüntüleme için hazırlanıyor tarafından örnekleri zarar verme olasılığını önemli ölçüde azalır, ilgilendiğiniz olanakları tüm beyin bağlamında analiz edilebilir ve Yöntem birçok örnekleri, paralel işleme için önemli ölçüde ödünç vermek kendisi numune hazırlama hız.
<p class="jove_content" fo:keep-tog...

Bu makalede küçük hayvan beyin mikro-CT görüntüleme, hangi lezyonlar sayılabilir ve tüm beyin bağlamında yüksek hassasiyetle yer alan elektrotlar hazırlamak için basit bir yöntem.

Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Bu yöntem, lezyonları doğrulamak ve elektrot konumlarını bulmak için daha basit, daha az hataya yatkın ve daha nicel bir yöntem sağlayarak nöroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kesite gerek kalmadan tüm beyindeki lezyonların ve elektrot bölgelerinin doğrulanmasına olanak sağlamasıdır. Son ürün beynin dijital bir 3D hacmi ve birden fazla beyin paralel olarak işlenebilir.Bu yöntem sıçanda gösterilecek olsa da, fareler ve zebra ispinozları gibi diğer organizmalara da uygulanabilir. Bazı adımlar en iyi sonuçları sağlamak için özel bakım gerektirdiğinden, genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecektir. Başlamak için, 50 mililitrelik konik tüp profüzyon çözeltisi bir çıkarılan beyin yerleştirin.Dört santigrat derecede hafif sallayarak iki ila üç gün boyunca örnek saklayın. Osmiyum suda seyreltilmiş değil, bir tampon olduğundan emin olun. Su hafif bir deterjan olarak hareket edecek, osmiyum doku içine derin nüfuz sağlayan olmasıdır.Çift distile suda %2 osmiyum tetroksit 50 mililitre hazırlayın. Sonra yeni bir 50 mililitre konik tüp beyin yerleştirin ve osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin. Tüpü kapatın ve sızıntıları önlemek için parafin filmi ile kapatın.İki hafta boyunca hafifçe sallayarak dört derece santigrat de mühürlü tüp saklayın. Tüpün yatay olarak yerleştirildiğinden emin olun. Beyin çok kalın ve difüzyon ile seyahat etmek için uzun bir yol.Tüpü yatay olarak yerleştirmek osmiyumun dokuya daha derinden girmesini sağlayacaktır. Numune iki hafta boyunca incubates sonra, numuneden tüm bağlanmamış osmiyum tetroksit kaldırmak için beş kez çift distile su ile yıkayın. Daha sonra, dört santigrat derece 30 dakika boyunca çift distile su ile örnek yıkayın.Numuneyi susuz leştirmek için çift distile suyu dört seyreltme etanol ile değiştirin. Rekarn infiltrasyon işlemine başlamak için, numuneyi üç aseton ve üç aseton rezorn seyreltme yoluyla hareket ettirin, ardından infiltrasyon işlemine devam etmek için numuneyi oda sıcaklığında %100 rezorna batırın. Bundan sonra, tek kullanımlık bir kalıp için örnek aktarın.Numuneyi oda sıcaklığında dört saat boyunca taze %100 reşin ile aşılayın. Numuneyi vakumlu fırında 15 dakika 45 derecede gazdan arındırın. Sonra 60 santigrat derece 48 saat boyunca bir fırında örnek tedavi.Son olarak, numune kürleme tamamlandığında, tek kullanımlık kalıbı soyup Micro-CT makinesiyle tarayabilirsiniz. Geleneksel kesitlerde, beynin oryantasyonu önceden belirlenmelidir. Bu Mikro-CT yöntemi kullanılarak, örnek beynin dijital hacmi üç boyutlu olarak manipüle edilebilir ve neredeyse herhangi bir yönde dilimlenebilir.Hazırlanan sıçan beyninin taramalı elektron mikroskobu, dokunun Mikro-BT görüntüleme amacıyla önemli ölçüde zarar görmediğini doğrulamaktadır. Bir zebra ispinoz beyin de hazırlandı ve diğer küçük hayvan beyinleri üzerinde bu yöntemin yarar test etmek için bu protokole göre tarandı. Bu teknik beyinde yüzey lezyonları bulmak için kullanılabilir, yanı sıra beyin içinde derin lezyonlar.Bu teknik aynı zamanda yerinde tek tetrodların konumuna, elektrolitik lezyonlara, elektrot izlerine, yerinde tetrode dizilerine ve silikon probların yerinde ki konumuna da uygulanabilir. Bu işlemi denerken, beynin yeterince uzun süre kuluçkaya yatmasını ve yeterince ajitasyon la kuluçkaya yatmasını unutmamak önemlidir. Bu işlemin ardından, farklı beyin bölgelerinin farklı davranışlarda oynadığı rol hakkında ek soruları cevaplamak için optogenetik ve iki foton görüntüleme gibi diğer yöntemler de uygulanmaktadır.Bu teknik, nöroloji alanında araştırmacılar daha iyi sıçanlar, fareler, ötücü kuşlar ve diğer küçük hayvanlarda beyin ve davranış arasındaki yapı-fonksiyon ilişkilerini keşfetmek için izin verebilir. Osmiyum ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven takmak ve vakum kaputunda çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

a-micro-ct-based-method-for-characterizing-lesions-locating

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, çok kanallı sinir ağlarını kaydetmek ve uyarmak için bir sıçan beynine kablosuz çift yönlü çok kanallı bir elektrot ünitesi implante etme prosedürünü göstermektedir.

Bir Sıçan Beynine Kablosuz Çift Yönlü Mikroelektrot Sistemi Yerleştirilmesi

Kaynak: Choi, J. P.  ve diğerleri.  Fare Modelinde Serebral Kavernöz Malformasyonların İndüksiyonu ve Mikro-BT Görüntülemesi. J. Vis. Uzm.  ( 2017)Bu video, bir fare beynindeki serebral kavernöz malformasyon (CCM) lezyonlarını görselleştirmek için mikro-BT görüntülemenin kullanımını göstermektedir. Beyin dokusundaki CCM lezyonlarının yoğunluğunu ve yerini değerlendirmek için numune hazırlama, görüntüleme ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu adımlarını detaylandırır.

Bir Fare Beyninde Serebral Kavernöz Malformasyon Lezyonlarının Kontrastlı Mikro-BT Görüntülemesi

Burada optik temizleyerek, ve kemirgen beyin dokusunda kronik implante Mikrocihazlarda çevresindeki görüntüleme sağlam beyin dokusuna arayüzü, etiketleme, yakalamak için bir histolojik yöntem sunuyoruz. Bu yöntem oluşan tekniklerden elde edilen sonuçlar, çevreleyen doku ile ilgili çeşitli nüfuz edici beyin-implant etkisini anlamak için yararlıdır.

Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı bir fare modeli hastalığında serebral derin malformasyon indüksiyon gösterir ve kullanır kontrast mikro bilgisayarlı tomografi lezyon yük ölçmek için geliştirilmiş. Bu yöntem moleküler temelini ve serebral derin malformasyon için potansiyel tedaviler ve diğer serebrovasküler hastalıklar çalışmaya kurulan fare modelleri değerini artırır.

İndüksiyon ve fare modeli serebral derin malformasyon mikro-CT görüntüleme

Multifoton görüntüleme sadece doku yüzeyinden sınırlı derinliklerde etkili olurken, pCLE ile herhangi bir derinlikte 3 μm çözünürlükte görüntüleme elde etmek mümkündür. Burada, iktal ve vahşi tip farelerin hipokampusundaki mikrovasküler dinamikleri ölçmek için pCLE görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Uyanık Farelerde Hipokampal Kılcal Damarların İn Vivo Fiber Bağlantılı Klinik Öncesi Konfokal Lazer Taramalı Endomikroskopisi (pCLE)

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Burada, bir minipig modelinde yumuşak subdural elektrot dizilerinin uzun süreli performans ve güvenlik değerlendirmesi için cerrahi yöntem ve araçları, postoperatif manyetik rezonans görüntülemeyi, işitsel korteksin elektrofizyolojisini, implantın elektrokimyasal özelliklerini ve postmortem immünokimyayı açıklayan bir yöntem sunuyoruz.

Minipiglerde Subdural Yumuşak Elektrokortikografi (ECoG) Dizisi İmplantasyonu ve Uzun Süreli Kortikal Kayıt

Bu çalışma, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) ve ex vivo örneklerde bir kontrast maddeyi birleştirerek yenidoğan fare beyinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme adımlarını açıklamaktadır. Bu görüntülerde beyin boyutunu ve şeklini ölçmek için temel morfometrik analizleri açıklıyoruz.

Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi

Beyin elektriksel alan ölçümleri ve ilgili bir biyobelirteç-serebral kan akışı açısından ekstrakraniyal stimülasyon için doz-yanıt eğrilerini değerlendirmek için bir protokol tanımladık. Bu protokol beyne invaziv elektrot yerleştirilmesini içerdiğinden, kontrollü solunum yerine spontan solunum tercih edilerek genel anestezi gerekir.

Anestezi Uygulanmış Farelerde Ekstrakraniyal Uyarıcı Elektrotların Yerleştirilmesi ve Serebral Kan Akımı ve İntrakraniyal Elektrik Alanlarının Ölçülmesi

Fare beyninin in vivo transkraniyal manyetik uyarımını sağlamak için milimetre büyüklüğünde bir bobin ile birleştirilmiş düşük maliyetli bir elektroensefalografik kayıt sistemi önerilmektedir. Özel yapım, esnek, çoklu elektrot dizisi substratına sahip geleneksel vidalı elektrotlar kullanılarak, transkraniyal manyetik stimülasyona yanıt olarak fare beyninden çok bölgeli kayıt gerçekleştirilebilir.

Fare Beynini In Vivo'da Transkraniyal Olarak Uyarmak için Milimetre Boyutlu Bir Bobin ile Birleştirilmiş Düşük Maliyetli Elektroensefalografik Kayıt Sistemi

Burada, sıçanlarda ve farelerde yüksek yoğunluklu mikro-elektrokortikografi (μEcoG) kaydı için cerrahi, implantasyon ve kayıt yöntemleri dahil olmak üzere iki protokol sunuyoruz. μECoG kayıtları, sıçan işitsel korteksinde laminer politrod kaydı veya fare somatosensoriyel korteksindeki nöral aktivitenin optogenetik manipülasyonu ile kombinasyon halinde gerçekleştirilir.

Kemirgenlerde Laminer Politrodlar ve Optogenetiğin Mikro Elektrokortikografi ile Entegre Edilmesi ile Kortikal İşlemenin Çok Ölçekli Araştırılması

Öğrenin, mikro-CT görüntüleme ile sıçan beynindeki lezyonları ve elektrot konumlarını kesme yapmadan 3D olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, sinirbilim araştırmalarında yapı-işlev ilişkilerini zararsız incelemeyi sağlar.

Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem

Daha fazla video keşfet