Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem
November 8th, 2018
Bu makalede küçük hayvan beyin mikro-CT görüntüleme, hangi lezyonlar sayılabilir ve tüm beyin bağlamında yüksek hassasiyetle yer alan elektrotlar hazırlamak için basit bir yöntem.
Bu yöntem, lezyonları doğrulamak ve elektrot konumlarını bulmak için daha basit, daha az hataya yatkın ve daha nicel bir yöntem sağlayarak nöroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kesite gerek kalmadan tüm beyindeki lezyonların ve elektrot bölgelerinin doğrulanmasına olanak sağlamasıdır. Son ürün beynin dijital bir 3D hacmi ve birden fazla beyin paralel olarak işlenebilir.
Bu yöntem sıçanda gösterilecek olsa da, fareler ve zebra ispinozları gibi diğer organizmalara da uygulanabilir. Bazı adımlar en iyi sonuçları sağlamak için özel bakım gerektirdiğinden, genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecektir. Başlamak için, 50 mililitrelik konik tüp profüzyon çözeltisi bir çıkarılan beyin yerleştirin.
Dört santigrat derecede hafif sallayarak iki ila üç gün boyunca örnek saklayın. Osmiyum suda seyreltilmiş değil, bir tampon olduğundan emin olun. Su hafif bir deterjan olarak hareket edecek, osmiyum doku içine derin nüfuz sağlayan olmasıdır.
Çift distile suda %2 osmiyum tetroksit 50 mililitre hazırlayın. Sonra yeni bir 50 mililitre konik tüp beyin yerleştirin ve osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin. Tüpü kapatın ve sızıntıları önlemek için parafin filmi ile kapatın.
İki hafta boyunca hafifçe sallayarak dört derece santigrat de mühürlü tüp saklayın. Tüpün yatay olarak yerleştirildiğinden emin olun. Beyin çok kalın ve difüzyon ile seyahat etmek için uzun bir yol.
Tüpü yatay olarak yerleştirmek osmiyumun dokuya daha derinden girmesini sağlayacaktır. Numune iki hafta boyunca incubates sonra, numuneden tüm bağlanmamış osmiyum tetroksit kaldırmak için beş kez çift distile su ile yıkayın. Daha sonra, dört santigrat derece 30 dakika boyunca çift distile su ile örnek yıkayın.
Numuneyi susuz leştirmek için çift distile suyu dört seyreltme etanol ile değiştirin. Rekarn infiltrasyon işlemine başlamak için, numuneyi üç aseton ve üç aseton rezorn seyreltme yoluyla hareket ettirin, ardından infiltrasyon işlemine devam etmek için numuneyi oda sıcaklığında %100 rezorna batırın. Bundan sonra, tek kullanımlık bir kalıp için örnek aktarın.
Numuneyi oda sıcaklığında dört saat boyunca taze %100 reşin ile aşılayın. Numuneyi vakumlu fırında 15 dakika 45 derecede gazdan arındırın. Sonra 60 santigrat derece 48 saat boyunca bir fırında örnek tedavi.
Son olarak, numune kürleme tamamlandığında, tek kullanımlık kalıbı soyup Micro-CT makinesiyle tarayabilirsiniz. Geleneksel kesitlerde, beynin oryantasyonu önceden belirlenmelidir. Bu Mikro-CT yöntemi kullanılarak, örnek beynin dijital hacmi üç boyutlu olarak manipüle edilebilir ve neredeyse herhangi bir yönde dilimlenebilir.
Hazırlanan sıçan beyninin taramalı elektron mikroskobu, dokunun Mikro-BT görüntüleme amacıyla önemli ölçüde zarar görmediğini doğrulamaktadır. Bir zebra ispinoz beyin de hazırlandı ve diğer küçük hayvan beyinleri üzerinde bu yöntemin yarar test etmek için bu protokole göre tarandı. Bu teknik beyinde yüzey lezyonları bulmak için kullanılabilir, yanı sıra beyin içinde derin lezyonlar.
Bu teknik aynı zamanda yerinde tek tetrodların konumuna, elektrolitik lezyonlara, elektrot izlerine, yerinde tetrode dizilerine ve silikon probların yerinde ki konumuna da uygulanabilir. Bu işlemi denerken, beynin yeterince uzun süre kuluçkaya yatmasını ve yeterince ajitasyon la kuluçkaya yatmasını unutmamak önemlidir. Bu işlemin ardından, farklı beyin bölgelerinin farklı davranışlarda oynadığı rol hakkında ek soruları cevaplamak için optogenetik ve iki foton görüntüleme gibi diğer yöntemler de uygulanmaktadır.
Bu teknik, nöroloji alanında araştırmacılar daha iyi sıçanlar, fareler, ötücü kuşlar ve diğer küçük hayvanlarda beyin ve davranış arasındaki yapı-fonksiyon ilişkilerini keşfetmek için izin verebilir. Osmiyum ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven takmak ve vakum kaputunda çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, mikro-CT görüntüleme için küçük hayvan beyinlerini, özellikle sıçan beyinlerini hazırlamak için bir yöntem açıklamaktadır. Teknik, kesme ihtiyacı olmadan lezyonları kantitatif olarak ölçmeyi ve elektrotları kesin bir şekilde konumlandırmayı amaçlamaktadır ve beynin kapsamlı bir 3D dijital hacmini üretmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Görüntüleme Teknikleri
- Lezyon Analizi
Arka Plan
- Mikro-CT görüntüleme, beyin yapılarının yıkıcı olmayan analizini sağlar.
- Geleneksel kesme yöntemleri hata yatkın olabilir ve oryantasyon esnekliğini sınırlandırabilir.
- Bu yöntem, lezyonlar ve elektrot yerleşimini analiz etme kabiliyetini artırır.
- Fareleler ve zebra ispinozları gibi farklı küçük hayvanlar için uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Mikro-CT görüntüleme için basitleştirilmiş ve daha az hata yatkın bir hazırlık yöntemi geliştirmek.
- Lezyonların ve elektrotların doğru lokalizasyonunu sağlamak.
- Gelişmiş analiz için beyin örneklerinin 3D manipülasyonunu kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kullanılan ana platform, hazırlanmış beyin örneklerinin mikro-CT görüntülemesinden oluşmaktadır.
- Ana biyolojik model sıçan beynidir, ancak yöntem diğer küçük hayvanlara uyarlanabilir.
- Yöntem, belirli inkübasyon sürelerini ve doku hazırlaması için osmiyum tetroksit kullanımını içerir.
- Kritik adımlar arasında yatay tüp yerleşimi ve osmiyum penetrasyonunu sağlamak için birden fazla yıkama adımı bulunmaktadır.
- Son hazırlık, reçineyi kürlemeyi ve bir Mikro-CT makinesi ile tarama yapmayı içerir.
Ana Sonuçlar
- Bu yöntem, hem yüzeysel hem de derin beyin lezyonlarının görselleştirilmesini sağlar.
- Doku bütünlüğünü korurken elektrot izlerini ve lezyonları doğru bir şekilde tanımlamayı sağlar.
- Taranan örnekler, doku hasarının minimal olduğunu göstererek tekniğin uygulanabilirliğini doğrular.
- Prosedür, optik genetik ve iki-fotonlu görüntüleme gibi daha ileri deneyleri destekleyebilir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, mikro-CT kullanarak ayrıntılı analiz için hayvan beyinlerinin hazırlanmasında etkili bir yöntem göstermiştir.
- Teknik, araştırmacıların örneklere zarar vermeden nöron davranışını ve yapısal ilişkileri keşfetmelerini sağlar.
- Genel olarak, beyin mekaniğini anlamadaki sinirbilim araştırmalarının yeteneklerini artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
