Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için
7 Ocak 2019
Burada, genetik olarak eşleşmiş hayalice ayrı photoactivatable ve floresan proteinler içerir bir iletişim kuralı mevcut. Bu floresan protein chimeras miktar photoactivated Yani, floresan, olmak olduğunu PA-FP fraksiyonunun photoactivation verimliliği izin verir. Protokol photoactivation farklı modları farklı photoactivation verimliliği verim ortaya koymaktadır.
Burada genetik olarak birleştirilmiş farklı foto-aktivatör ve floresan proteinleriçeren bir protokol sıyoruz. Bu iç cetveller floresan olarak aktive fotoğraf PAFP fraksiyonu nicelik izin verir. Şimdiye kadar, hiçbir yöntem yaşam hücrelerinde toplu olarak ölçmek için kullanılabilir olmuştur kaç PAFP ifade edilen fotoğraf floresan aktive edilir. Foto-aktivasyon verimliliği sunulan nicelik pa-GFP ve PA Kiraz canlı hücrelerde örneklenir ama prensipte geniş uygulanabilir ve herhangi bir deneysel koşul altında herhangi bir foto-aktivatör floresan protein için kullanılabilir. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler ile çalışıldığında, ifade edilen proteinlerin mutlak miktarı hücreden hücreye değişir ve bilinmemektedir. Hücreler arasındaki ifadeyi standartlaştırmak için, genetik olarak birleşen farklı floresan proteinlerin iç cetvellerini sıyoruz. Bir foto-aktive edilebilir floresan proteinin genetik bilgilerini floresan protein iç cetvellerinde her zaman farklı bir spektruma bağlayarak, hala bilinmeyen bir toplam miktarla ama bilinen bire bir göreceli olarak ifade edilecek bir oluşturulur. Eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi plazmidleri oluşturmaya başlamak için. Ayrıca, fenol kırmızı ücretsiz versiyonu kullanarak kendi perspektif orta standart hücre hattında kültür. Denemeye başlamaya hazır olduğunuzda, arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı olmadan tripsin kullanarak hücreleri hasat edin. Hasattan sonra, 2 ml'lik bir pipeti, T 12.5 hücre kültürü şişesinde yetişen bir hücre kültüründen hücre süspansiyonu ile doldurun. Sekiz odacam slayt her odasına bir damla ekleyin. 24 saat boyunca standart hücre kültürü koşulları altında slayt kuluçka. Sonraki transfect distribütörler protokolü aşağıdaki ticari reaktifler kullanarak hücreleri. GFP Kiraz, PA-GFP Kiraz ve GFPPA Kiraz kimeraları ile hücreleri transfect. Daha sonra protein ekspresyonu, katlama ve olgunlaşma sağlamak için hücreleri kuvöze geri verin. Transfeksiyon sonrası toplam 20 saat sonra, hücreleri önceden ısıtılmış, nemlendirilmiş ve ısıtılmış çevre odası ile donatılmış konfokal floresan mikroskobun aşamasına aktarın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, genetik olarak eşlenmiş, spektral olarak farklı fotoaktive edilebilir ve floresan proteinlerin kullanıldığı bir protokol sunmaktadır. Bu kimerler, floresan hale gelen PA-FP fraksiyonunun fotoaktivasyon verimliliğinin miktarının belirlenmesine olanak tanıyarak, farklı fotoaktivasyon modlarının farklı verimlilikler sağladığını ortaya koymaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Floresan Protein Teknolojisi
- Fotoaktivasyon Teknikleri
Arka Plan
- Floresan proteinler, biyolojik araştırmalarda temel araçlardır.
- Fotoaktivasyonla etkinleşen floresan proteinler, floresansın uzamsal ve zamansal kontrolüne olanak tanır.
- Fotoaktivasyon verimliliğinin anlaşılması, doğru deneysel sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
- Farklı aktivasyon yöntemleri, bu proteinlerin performansını etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Fotoaktivasyon verimliliğini değerlendirmek için bir protokol geliştirmek.
- Çeşitli fotoaktivasyon modlarının etkilerini karşılaştırmak.
- Araştırmalarda floresan protein kimeralarının kullanımını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Fotoaktive edilebilir ve floresan proteinlerin genetik eşleşmesi.
- Fotoaktive edilmiş fraksiyonun miktar tayini.
- Farklı fotoaktivasyon tekniklerinin karşılaştırılması.
- Fotoaktivasyon verimliliklerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Farklı fotoaktivasyon modları, değişken verimliliklerle sonuçlanmıştır.
- Protokol, fotoaktivasyon verimliliğini başarıyla nicelleştirmiştir.
- Floresan protein kimeraları, araştırma uygulamaları için önemli bir potansiyel sergilemiştir.
- Elde edilen bilgiler, fotoaktive edilebilir proteinlerin kullanıldığı gelecek çalışmalara yön verebilir.
Sonuçlar
- Çalışma, araştırmacılar için değerli bir protokol sunmaktadır.
- Fotoaktivasyon verimliliğinin anlaşılması, deneysel tasarım için kritiktir.
- Gelecekteki araştırmalar, floresan protein kullanımını optimize etmek için bu bulguların üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Floresan proteinlerin fotoaktivasyon verimliliğinin nicelleştirilmesi, canlı hücre görüntülemedeki kritik bir boşluğu doldurarak dinamik protein davranışlarının daha güvenilir şekilde yorumlanmasını sağlar. Bu yetenek, fotoaktive edilebilir prob performansına yönelik ölçülebilir bir parametre sunarak hedef doğrulamayı ve assay geliştirmeyi destekler. Prob aktivasyonundaki öngörücü güvenin artması, fenotipik tarama ve translasyonel biyobelirteç çalışmaları gibi sonraki uygulamalardaki mekanistik belirsizlikleri azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Başarıyla aktive edilen fotoaktive edilebilir proteinlerin oranını nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Hücreden hücreye değişen ekspresyon değişkenliğini normalize etmek için rasyometrik bir iç kontrol sağlar.
- Öngörücü Değer: Farklı protein varyantları veya koşullar arasında fotoaktivasyon verimliliklerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyarak öncü adayların belirlenmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Analiz optimizasyonu için fotoaktivasyon verimliliğine dair standartlaştırılmış, kantitatif okumalar üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Deneysel tekrarlar arasında tutarlı bağıl ekspresyon sağlamak için genetik olarak eşleşmiş dahili cetveller kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Yüksek içerikli tarama iş akışlarına entegrasyonu mümkün kılarak, dökme ve canlı hücre formatlarıyla uyumluluk sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Fotoaktivasyon verimliliğini hastalıkla ilgili sistemlerdeki fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek mekanistik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır.
- Öngörü Güvenilirliği: Kantitatif fotoaktivasyon performasına dayalı, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına olanak tanır.
- Biyobelirteç Uyumu: Preklinik modellerde boylamsal takip için fotoaktive edilebilir raporlayıcıların geliştirilmesini destekler.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, özellikle protein aktivitesinin spasyotemporal kontrolünün gerektiği durumlarda, erken hedef doğrulamadan assay geliştirmeye ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Canlı hücrelerdeki fotoaktive edilebilir probların aktive olan fraksiyonunu nicelleştirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Mutlak ekspresyon seviyelerinden bağımsız rasyometrik ölçüm yoluyla analiz standardizasyonuna olanak tanır.
- Analitik: Aktivasyon modlarının karşılaştırılmasına imkan veren kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (fotoaktivasyon fraksiyonu) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerindeki fotoaktive edilebilir raporların standardize edilmiş değerlendirmesini sağlayarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Spektral olarak farklı herhangi bir fotoaktive edilebilir floresan protein çiftini değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fotoaktiflenebilir prob performansındaki öngörü güvenini artırır ve aktivasyon tabanlı analizlerdeki yanlış negatifleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar ve deneysel düzenekler genelinde tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Kantitatif aktivasyon verimliliği verileri sağlayarak, prob seçimindeki devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış performans metriklerine dayalı olarak, fotoaktiflenebilir araçların riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Genetik olarak eşleşmiş floresan protein kimeraları üretmek için moleküler klonlama uzmanlığı gerektirir.
- Fotoaktivasyon yeteneğine sahip konfokal veya geniş alan floresan mikroskopisine erişime bağımlıdır.
- Görüntüleme parametrelerinin ve fotoaktivasyon protokollerinin kullanıcılar arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Kimera fonksiyonelliğinin ve spektral ayrımın hedef hücre hattında doğrulanmasını gerektirir.
- Floroforların genetik eşleşmesinin protein fonksiyonunu veya lokalizasyonunu bozmadığı sistemlerle sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
1:20
Cell Culture and Transfection
2:31
Imaging and Photoactivation
5:45
Imaging Analysis and Algorithm for Ratiometric Intensity-based Quantification of Photoactivation Efficiency
9:09
Results: Maximizing Photoactivation Efficiency
9:50
Conclusion
