Name: Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Öğrenin hipokampal CA2 internöronlarının 3D rekonstrüksiyonu için biyositin kurtarma yöntemini. Bu protokol, elektrofizyolojik kayıtlar sonrası yüksek kaliteli morfolojik analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Novartis Pharma (Basel) ve tıbbi araştırma Konseyi Prof Alex Thomson, biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC-BB/G008639/1), fizyolojik Derneği, Avrupa Birliği için fon aldı Ufuk 2020 çerçeve programı araştırma ve yenilik (insan beyni proje SGA1) belirli Hibe Sözleşmesi No 720270 altında ve belirli Hibe Sözleşmesi No 785907 altında (insan beyni proje SGA2). Fon güvenliğini sağlama diğer kortikal bölgelerde Protokolü ayarlamak için ve onun sürekli destek için bu proje için Prof Alex Thomson için çok müteşekkiriz. Laboratuvar-kurtarma protokolüne optimize yardımcı oldu ve CA2 neurones yeniden üye tarafından yapılan katkıları minnettarlıkla kabul vardır: J. Deuchars, H. Pawelzik, ö. I. Hughes, A. s. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+involving+parvalbumin-positive+basket+cells+in+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).</li>
<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy%3A+The+Preservation+of+Cellular+Ultrastructure+and+Enzymatic+Activity+by+Aldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation.</a> Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
<li>Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).</li>
<li>Mercer, A., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornu+Ammonis+Regions-Antecedents+of+Cortical+Layers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).</li>
<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Elektrofizyolojik kayıtlar vitro (Şekil 1 Ac,d ve M.ö., d) ile histochemical birlikte ve immunohistokimyasal yordamları etkinleştirmek detaylı morfoloji, kalsiyum bağlayıcı protein içeriği ve Yetişkin kortikal interneurons kimliğini ortaya olarak kaydedildi. CA2 bölgesinde bu tekniği ilk kez yerel devre çalışma izin ve daha önce CA1 veya CA3 tarif edilmiştir değil interneurons alt sınıflarını ortaya: geniş dendritik ve aksonal arbor sepet hücreleri (Şekil 1B), bistratified hücreleri ve SP-SR interneurons.
Burada açıklanan protokol nöronlar ultrastructure korumak ve dendritik (dahil dikenleri) ve aksonal arbors mükemmel kurtarma edinmek için optimize edilmiştir. Kritik adımları içerir kontrast ışık mikroskobu26 geliştirmek için çift fiksasyon tekniği kullanımı ve antikor penetrasyon geliştirmek ve nöronal korumak için sabitleştirici çözüm oxazolidin ve pikrik asit çözüm eklenmesi ultrastructure27. Osmication ve reçine katıştırma z-uçak büzülme28azaltmak iken nazik donma-çözülme permeabilization ince yapısının daha iyi koruma sağlar. Buna ek olarak, (örneğin aksonlar küçük boutons ile para cezası) çok güzel yapıların görselleştirme H2O2 ve arka plan boyama azaltmak için NaBH4 bölümlerle kuluçka tarafından geliştirildi. Kontrast Ayrıca NiCl2 ' ye HRP tepki ilavesi ile artırılabilir.
Burada verilen histolojik yordam tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik açısından mükemmel sonuçlar sunar. Ancak, elektrofizyolojik kayıt süresi daha kısa kayıtları genellikle yoksul aksonal boyama ile ilişkili ile boyama biocytin/floresan kalitesini belirleyecektir. Protokoller (bütün hücreli yama sıkma vs keskin elektrotları kullanarak hücre içi kayıtları) kayıt seçimi de biocytin saklama ve koruma iyi anatomi etkileyebilir.
Güçlükler içinde iken burada açıklanan histolojik işleme ve 100 X büyütme (axon karmaşıklığına bağlı olarak 1-4weeks), yeniden oluşturmak için geçen süre sırasında güzel yapısını koruyarak takdir edilmektedir, bu yöntem verir bir dendritik ve aksonal çapları doğru bir şekilde temsil. Daha az biocytin etiketleme ortaya çıkarmak için yüksek güç gerektiren protokolleri kullanımı anlaşılabilir bir durumdur, ancak, bunlar genellikle iyi aksonal şube açık görselleştirme engel. Deterjanlar biocytin ve antikorlar, ortaya çıkarmak için Avidin-HRP girişini teşvik etmek, genellikle kalın bölümlerde gerekli, ama güzel yapısını bozabilir. Nörologlar arama sürekli için yeniden yapılanma yarı otomatik yöntemleri ama için şimdi ve akson özellikle, biocytin-HRP el ile yeniden yapılanma ile için altın standart31kalır.
Son derece ayrıntılı nöronal rekonstrüksiyonu, aksonlar boutons ve düğümlerin olup tam aksonal arbor, çizim doğru akson çapı temsili ile değiştirir boyunca miyelin ve daha genel olarak özellikle doğru çizimlerinin onun uzunluğu, daha fazla bilgi doğru teşhis edilmesi için kullanılan farklı türde bir interneurone sağlamak. Birçok interneurons belirli bir sınıf tam olarak uygun olmayabilir rağmen yukarıda açıklanan tekniği nöronal elektrofizyolojik özellikleri, belirli bir bağlantı türü ile ilişkili ve ayrıntılı kısa vadeli plastisite ilişkili veri sağlar nöronal rekonstrüksiyonu, ayrıntılı olarak incelenecektir için bağlantı şeması CA2 bölgesinde izin.
İyi, ayrıntılı yapısı kez Hesaplamalı modellerinde basitleştirilmiştir. Anlaşılabilir olsa da, bu gelecekte kritik olabilecek bilgi kaybına neden olur. Ayrıntılı 3D rekonstrüksiyonu ile paralel sinaptik veri analizini interneuronal sınıflandırma için daha fazla ölçüt eklenmesi sağlayacaktır. Veri içinde kamu depoları yatırılır ve akson çapı ve myelination Aksiyon potansiyeli yaymayı sporadik değişiklikler sonucu hesaplama açısından keşfetmek için tüccarları tarafından kullanılan.

Korteks ve hipokampus nöronal sınıflandırılması1,2,3,4, onları arasındaki bağlantıları haritalar5,6 alt türlerinden ki böyle karmaşıklık yapılardır , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ve nasıl bu devre bilişsel işlevler12,13,14,15 destekler hala yoğun çalışma ve sürekli tartışma konusu altında bulunmaktadır. Örneğin, Ayrıntılar ve devreyi karmaşıklığı anlamak ve birçok farklı çalışmalardan elde edilen veriler koordine etmek tanımlamak ve bileşenleri tanımlamak edebilmek son derece yararlı olur, ancak bir konu tartışma için nasıl kalır çok farklı nöronların sınıfları var, ya da düz olup bütün nöronlar belirli bir sınıfa ait olarak tanımlamak mümkündür. Yapı ve devreleri derecelerde karmaşıklığı ile test hesaplama araçları Gelişmiş16,17,18davranıyorsun, ama detaylı çalışmalar hücre tiplerinin ihtiyacını bu çabalar için merkezi bir noktada bulunuyor ve aralarındaki bağlantıları özellikleri. Yetişkin fareler yeni korteksimiz yerel devre hakkında bilgi büyük miktarda zaten kullanılarak toplanmış protokol burada10,19,20,21, anlatılan 22. her ne kadar "bağlantı şeması" uzak tamamlandıktan, bazı desenler açık veya kurallar ortaya çıkmıştır. Her ne kadar bazı ayrıntılar değişir, Ayrıca, bu kurallar için insan yeni korteksimiz eşit uygulanabilir olması muhtemeldir temel yapı taşları gelişimi sağlayan iki memeli türü (fare ve kedi) ve birçok neocortical yerinde, yaygındır. Burada açıklanan tekniği kortikal devresi fonksiyonel Haritası anlayışımızı presynaptic ve postsinaptik nöronların bağlantılarını daha önce ayrıntılı bir iletişim kuralı kullanılarak incelenmiştir değil bölgelerde yer tespit ederek genişletmek için kullanılan Bu yetişkin beyin dokusunda mükemmel doku koruma ve dikkat çekici boyama kurtarma sağlar. CA2 yerel devre ve nöronal bu alt alan özelliklerinde veri doldurma biocytin ile hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar (keskin microelectrodes ile eşleştirilmiş kayıtları) birleştirerek bu yöntemle toplanmıştır, ayirt, histolojik yordamlar ve komşu CA bölgeleri23,24,25ile doğrudan karşılaştırma izin nöronal rekonstrüksiyonu, çok detaylı.
Bu makalede açıklanan tekniği detaylı nöronal anatomi hücreleri ve yüksek kaliteli doğru sınıflandırılması ve her iki onların dendritik ve aksonal arbors, olabilecek veriler doğru rekonstrüksiyonlar izin vererek elde etmek için yıllar boyunca geliştirilen keskin elektrotları kullanarak eşleştirilmiş kayıtları toplanan elektrofizyolojik verilerle ilişkili. Histolojik protokolü, nöronlar ultrastructure korumak ve dendritik (dahil dikenleri) ve aksonal arbors mükemmel kurtarma elde etmek için en iyi duruma getirilmiş. Örneğin, ilk olarak bir sabitleştirici çözümde çeker ve ikincisi osmiyum tetroxide sonrası sabitleme tarafından Çift Kişilik fiksasyon tekniği prensibi ışık mikroskobu26için iyi bir kontrast sağlar. Oxazolidin ve bir çözüm pikrik asit az miktarda antikor penetrasyonu artırmak için ve önerilen bir önceki çalışma27' deki hücre ultrastructure korumak için sabitleştirici çözüm için eklenir. Cryo-koruma geleneksel bir deterjan yerine sukroz ile birlikte donma-çözülme yöntemini kullanarak beyin dilimler permeabilization de kaydedilen hücre detaylı morfolojik analiz için dokuların en iyi koruma sağlar. Buna ek olarak, özellikle çok güzel yapıların görselleştirme incubations hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum borhidrür (NaBH4) ile arka plan boyama azaltarak artırıldı. Nikel klorür (NiCl2) horseradish peroksidaz (HRP) ekleyerek bir siyah pigment reaksiyon ürünü elde etmek için tepki de karşıtlığı artırır.
Aşağıdaki iletişim kuralı mükemmel doku koruma ve son derece detaylı nöronal 3D rekonstrüksiyonlar hücre içi kayıtları vitrotakip tespit etmek için kullanılan yordamları açıklar. Dilim hazırlık açıklaması, hücre içi eşleştirilmiş kayıtları kullanarak elektrotlar keskin ve bizim Laboratuvarda kullanılan sonraki histolojik yordamlar daha önce raporlanmış28olmuştur. Her ne kadar intracellularly biocytin 450-500 mikron kalınlığında dilimler içinde dolu hücre iletişim kuralının uygulandığı, aynı iletişim kuralını bütün hücreli kayıtları aşağıdaki kullanılabilir. Ancak, daha ince dilimleri kullanımı hücreleri daha az komple rekonstrüksiyonu içinde sonuçlanır.

<table><tbody><tr><td>Avidin-7-amino-4-metilkumarin-3-asetik asit (Avidin-AMCA) antikoru- 20.8 mg/mL&nbsp;</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>Biyositin ve nbsp; &ge; % 98 (TLC)</td> <td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 diaminobenzidin (DAB) tablet, 5 mL</td><td>hazırlamak için Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoksi reçine A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoksi reçine B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoksi reçine C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan epoksi reçine D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, saf. pa, mutlak, &ge; % 99.8</td> <td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit çözeltisi, derece I, H 2O</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol, vb. içinde% 25; %99&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare floresein izotiyosiyanat (FITC) - 14.3 mg / mL</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Texas Red (TR) - 3.3 mg / mL</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit,% 30 çözelti</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma yağı, viskozite 1.250 cSt (lit.)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>Nikel klorür (NiCl2 . 6H2O)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit, elektron mikroskobu için, H2O&nbsp; içinde %4;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, reaktif sınıfı, kristalimsi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Su ile nemlendirilmiş pikrik asit, &ge; %98</td> <td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponu 1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>Propilen oksit (C3H6O), %99</td> <td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tetrahidroborat</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hidroklorür, &ge; %99,0</td> <td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı, & ge; % 99,9</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montaj Ortamı, kırılma indisi 1.45&nbsp;</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kiti</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Kullanılan ekipmanlar&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A Çukurlu alüminyum plakalar&nbsp;</td><td>GA-MA & İŞTİRAKLER, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR mikroskobu&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; floresan ışık kaynağı&nbsp;</td><td>Excelitas Teknolojileri&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC450 dijital mikroskop kamerası&nbsp;</td><td>Leica Mikro Sistemler& nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph teknik çizim kalemi 0.18mm&nbsp;</td><td>Londra grafik merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.18 mm rapidograf ucu</td><td>Londra grafik merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph teknik çizim kalemi 0.25mm&nbsp;</td><td>Londra grafik merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 mm rapidograf ucu</td><td>Londra grafik merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ sahne kontrolü için PC iş istasyonu, sahne, kamera ve joystic içeren Neurolucida sistemi</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida yazılım sürümü 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW graphics Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Video düzenleme yazılımı&nbsp;</td><td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeler 14 mL</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal ca2 interneurons 3d rekonstrüksiyonu

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

Kortikal ağ etkinliğini işler nasıl bilgi çok sayıda temel ve klinik bilimsel sorular için önem taşımaktadır. Burada açıklanan protokol temel yapı taşları olan bu devreyi tanımlar. Kortikal bölgelerde ayrıntılı çalışmalar sonunda devre elemanları ile diğer bilim adamları beyin nasıl edinme bir anlayış için gerekli, işler ve bilgi ve ne hastalığında ise elektrofizyolojik terslik depolar sağlayacaktır ve morfolojik veri bilgi işleme keşfetmek modeli ağları inşaat Hesaplamalı nörologlar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada özetlenen protokolünü açıklar nasıl biocytin dolu hücreleri oluşur CA2 bölgede kaydedilen kurtarıldı ve 3D yeniden. Ayrıca, kalsiyum bağlayıcı protein veya peptid kaydedilen interneurons içerik gösteri protokolünü açıklar.

Hipokampal CA2 nöronlarda elektrofizyolojik kayıtlar (rakamlar 1Ac, reklam ve 1Bc, Bd) takip biocytin ile doluydu. Dilimleri gecede kayıtları takip tespit edildi ve nörokimyasal ve morfolojik nöronlar karakterizasyonu burada açıklanan protokol sonrası açığa çıkarılmıştır.
Kalsiyum bağlayıcı protein veya dolgulu interneurons protein içeriği ilk birincil antikorlar ve daha sonra ile fluorescently etiketli ikincil antikorlar dilimleri kuluçka tarafından tespit edilmiştir. İnterneurons kayıtları sırasında ateş özellikleri kullanılan birincil antikorlar seçiminde belirleyecektir. Avidin-AMCA biocytin dolu interneuron görselleştirmek için kullanıldı ve anti-fare floresein isothiocyanate (FITC) ve keçi Anti-tavşan Texas kırmızı (TR) interneuronal (Şekil 1Bb) nörokimyasal karakterize etmek için kullanılmıştır.
Floresans görselleştirme, biocytin (Şekil 1Ab) ortaya çıkarmak için bir HRP protokolün kullanılmış olduğunu. CA2 interneurons ince detaylı anatomisi sonra bir nöron imar yazılım (Şekil 2 ve Şekil 3a) kullanarak 3D çizilmiştir. 3D yeniden kaydedilen ve CA2 içinde dolu bir sepet hücrenin bir video Videoiçinde görüntülenir. Dendritik ve aksonal arbors 450-500 mikron dilim derinliği içinde sınırlı Eğer nöronal rekonstrüksiyonlar tamamlandı olarak kabul edildi. Zavallı aksonal arbor boyama axon ilk segment ve çok proksimal dalları ile sınırlı üst veya alt dilimin veya bir boyama tarafından açık sonla kesilen dalları varlığı ile değerlendirildi. Şekil 4 iyi bir ve bir zavallı HRP boyama aşağıdaki biocytin görselleştirme örnekleri temsil eder.
3D rekonstrüksiyonu (Şekil 3) analizini xarakteristikaları şube karmaşıklığı, soma yüzey alanı ve yüzey alanı ve hacmi dendritik ve aksonal arbors göstermek için yürütülen olabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> Resim 1 : İki türden sepeti hücre nöronal rekonstrüksiyonlar kaydedildi ve hipokampal CA2 bölgede doldurdu ve elektrofizyolojik veri hücre içi kayıtları takip elde edilen korelasyon vitro. Bu rakam önceki çalışmalar23,24değiştirildi. Bu tabaka Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: çizim tüp (1000 X) kullanarak sınırlı dendritik ve aksonal arbor CA2 sepet hücresiyle yeniden inşası. Dendrites siyah, ve akson kırmızı. AB: Burada açıklanan avidin-HRP protokol sonrası biocytin dolu sepet hücre görüntüsü. AC: Temsilcisi hyperpolarizing ve kısıtlı dendritik ve aksonal arbor bir CA2 sepet hücrenin geçerli enjeksiyon depolarize gerilim yanıt-e doğru iz. Reklam: Arbor sepet hücre bağlantıları daraltmak için CA2 piramit örneği keskin elektrotları kullanarak kaydedilen. Bileşik eksitatör Post sinaptik potansiyel (EPSP) ortalamalar kısa tren depresyon belirgin yanıt trenler için üç sivri için gösteri sırasında. (B) Ba: 2D çizim tüp (1000 X) kullanarak geniş dendritik ve aksonal arbors CA2 sepet hücresiyle inşası. Radyal CA2 bölge ve yatay olarak içinde SO ve SP CA2 ve CA3 bölgelerin tüm katmanından genişletilmiş dendritik ağacı bu sepet hücreye (siyah). Bir yatay dendrite de CA1 bölgeye ulaştı. CA3 ve CA1 bölgeler için genişletilmiş axon (kırmızılı). Bb: Biocytin dolu (AMCA boyama) sepeti hücresiydi PV-immunopositive (FITC boyama) ve CB-immunonegative (Texas-kırmızı boyama). BC: Temsilcisi hyperpolarizing ve geniş dendritik ve aksonal arbor bir CA2 sepet hücrenin geçerli enjeksiyon depolarize gerilim yanıt-e doğru iz. BD: Bileşik EPSP ortalamalar kısa tren kolaylaştırma belirgin yanıt trenler için üç sivri için gösteri sırasında. İnterneurons CA2 içinde kaydedilen diğer türleri örnekleri önceki çalışmalar25,30' u bulunabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> Resim 2 : 3D Cep vücut yeniden yapılanma. (A)3D izleme hücre vücudun. Farklı z pozisyonlarında hücre vücuda odaklı iken takip farklı kontür görünümünü. (B) 3D görüş-in farklı kontür. (C) 3D görünümü farklı bir açıdan, hücre vücudun. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> Şekil 3 : 3D nöronal rekonstrüksiyonlar morfometri analizleri. (A)CA2 dar arbor sepet cep 3D inşası. Dendritik her dal bir renk (yeşil, mavi, kırmızı ve pembe) tarafından temsil edilir ve ışık mavidir axon. (B) Dendrogram dendritik şube sayısını ve küreler konsantrik ile soma ve soma üzerinden 100 mikron aralıklarla içinde bulunan her kesimin uzunluğu temsil eden sepet hücre. Dendrogram renklerini dendrites CA2 piramidal hücrelerde (bir önceki çalışma23uyarlanmıştır) gerçekleştirilen xarakteristikaları analiz A. (C) örnekte karşılık gelmesi. Dendritik şube sayısını CA2 piramit hücre soma mesafeden karşı çizildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> Şekil 4 : İyi (A) ve kötü (B) HRP boyama örnekleri. (A)Biocytin kurtarma ortaya CA2 içinde çok iyi dolu bir interneuron. Hücre vücut (CB) koyu lekeli ve açık ana hatları vardır. Dendrites boncuklu ve bazı spines (kırmızı yıldızlar tarafından temsil edilen) görüntülenir. Aksonal çardak (A) yoğun ve küçük boutons hediyeler. (B) örnek bir zavallı dendritik ve aksonal CA2 2 piramit hücrelerinin boyama. CB boyama ile Seviyelendirmeyi Temizle'yi hiçbir zayıf. Zavallı boyama sık sık çok az biocytin dolu dalları huzurunda kaynaklanan kısa elektrofizyolojik kayıtlar ile ilişkilidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
Video 1: Stratum pyramidale, dendrites tüm katmanları ve akson CA2 stratum pyramidale ve bitişik katman oriens, soma ile sınırlı dendritik ağaç dikme (CA2 dar arbor sepet hücresi olarak da bilinir) CA2 sepet hücresiyle 3D nöronal inşası ve radiatum. Çok birkaç dal proksimal CA3 tabaka oriens ve CA3 stratum pyramidale ulaştı. Bu hücre elektrofizyolojik kayıtlar aşağıdaki biocytin ile doluydu ve bölümler avidin-HRP burada açıklanan protokol sonrası işlendi. Dendrites sağlam olmasına rağmen Dilimleme nedeniyle, yalnızca akson dilimi derinliği içinde kurtarıldı. Dendrites, koyu pembe ve beyaz axon. Katman ve bölge sınırları videonun başında eklenmiştir. 3D imar Svenja Falk tarafından Georgia Economides-3D video tarafından. Video adım 2.17 belirtildiği gibi bir nöron imar yazılımı ile kaydedilen ve bir video düzenleme yazılımı ile düzenlenebilir. Video linki:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kullanılan çözümler</td>
			<td>Kompozisyon/talimatları</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fiksasyon çözüm</td>
			<td>%4 paraformaldehyde, %0.2 pikrik asit çözüm, % 0,025 oxazolidin çözüm 0.1 M fosfat tampon (PB) doymuş.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 M fosfat tampon pH 7,6</td>
			<td>900 mL distile su 100 mL 1 M fosfat tampon stok ekleyin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Serum fizyolojik (PBS) pH 7.4/7,5 fosfat tamponlu</td>
			<td>10 mL 0.1 M fosfat tampon, 0.2 g KCl ve NaCl 8,76 g 990 ml distile su ekleyin</td>
		</tr>
<tr>
<td>TRIS tampon pH 7.5</td>
			<td>5,72 g Tris hidroklorür ve Tris Bankası 1.66 g 50 mL distile su içinde çözülür. Sonra 1 L distile su ile yapın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Arabelleğe alınan oxazolidin ve paraformaldehyde sabitleştirici çözüm</td>
			<td>%4 paraformaldehyde, %0.2 pikrik asit çözüm, % 0,025 oxazolidin çözüm 0.1 M fosfat tampon doymuş.</td>
		</tr>
<tr>
<td>ABC çözüm</td>
			<td>En az 30 dk ABC kitinden kullanmadan önce yapılması için çözüm. 1 damla çözüm A ve B çözeltinin 1 damla PBS için 2.5 mL ekleyin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durcupan epoksi reçine:</td>
			<td>20 tencere yapmak: Bileşen A, bileşen B 20 g, bileşenin C 0.6 g ve bileşenin D - 0.4 g 20 g</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Denge dökülen bir çemberi filtre kağıdı ile plaka kapsayan tarafından korumak. Dikkatle reaktifleri yukarıda belirtilen oranlarda tripour kabı içine tartın. Şiddetle iki ahşap sopa için en az 5 dk kullanarak karıştırarak tarafından iyice karıştırın. Karışımı bir üniforma yoğunluğu koyu kahverengi renk olacaktır. Kabı ~ 50 ° C en fazla mümkün olduğunca çok sayıda hava kabarcıkları kaldırmak için 10 dk fırında yerleştirin. Not: Reçine Eğer 10 dk. Decant uzun fırın kabı reçine plastik kap veya 5 mL şırınga dışarıda bırakın onları tarih ve kullanıma hazır-20 ° C buzlukta saklamak tedavi etmeye başlayacak.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Tablo çözümleri.

Burada özetlenen protokolünü ayirt analizi, biocytin kurtarma ve hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar in vitro nöron izin takip hipokampal CA2 interneurons yüksek kaliteli rekonstrüksiyonlar açıklar karakterizasyonu ve belirlenmesi için sonuçta iyi nöronal anatomisi.

Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Bu yöntem nöronal alt tipleri sınıflandırmaya yardımcı olabilir ve kortikal devrelerin fonksiyonel haritası anlayışımızı genişletmek. Bu protokol, nöronların ultrayapısını korumak ve hem dendritik hem de aksonal çardakların mükemmel bir şekilde geri kazanımını elde etmek için optimize edilmiştir ve yüksek kaliteli rekonstrüksiyonlara olanak sağlar. Elektrofizyolojik kaydın sonunda, kaydedilen hücreyi içeren dilimi küçük bir ACSF kabına aktarın.Duman kaputunda çalışırken, dilimi ince kalitede filtre kağıdının küçük bir parçasının üzerine yuvarlayın ve dilimin üzerine başka bir nemlendirilmiş filtre kağıdı yerleştirin. Dokuyu 5 ila 10 mililitre fiksatif çözelti içeren küçük bir plastik tencereye yerleştirin ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, durulamak için 0.1 molar fosfat tampon iki mililitre ile bir kap için fiksatif çözelti ile konteyner doku aktarın ve bir neşter bıçak ile herhangi bir fazla doku kesip.Bir Petri kabına dilim yerleştirerek fazla doku çıkarın ve bir neşter bıçak ile aşırı doku kesip. Kesilmiş dokuyu temiz bir Petri kabına aktarın ve kıvrımveya kırışıklık olmadan düz olmasını sağlar. Kuru boya fırçası kullanarak fazla arabelleği çıkarın.Sıcak jelatin çözeltisi ile doku kapağı ve hızlı bir şekilde çözelti soğutmak için dondurulmuş bir blok üzerine Petri çanak yerleştirin. Daha sonra jelatina ayar yemeğini 30-60 dakika boyunca 4 dereceye taşıyın. Bir duman kaputunda, jelatin gömülü doku içeren küçük, 1 X 1 santimetrelik bir blok kesmek için bir neşter bıçak kullanın.Küçük bir spatula kullanarak bloğu kaldırın ve taze fiksatif çözeltiye dikkatlice aktarın. Dört santigrat derecede en az 30 dakika düzeltmek için izin verin. Bu ikinci fiksasyondan sonra jelatin bloğunu beş mililitre PB'de üç kez yıkayın.Yıkadıktan sonra, bir kağıt mendil parçası kullanarak blok kuru. Sonra süper tutkal kullanarak bir vibratome kamyon üzerine, üst doku ile yönelik blok sopa için siyanoakrilat tutkal küçük bir miktar kullanın. Bir vibratom kullanarak 50 mikron kalınlığında dilim bölüm ve yüzde 10 sakaroz içeren bir cam şişe dikkatlice her bölümü yerleştirin.Kesitsonra, dikkatlice şişeden bir bölüm almak ve bir Petri çanak kapağı içine düz yerleştirin. Sonra bölümün çevresindejelatin kaldırmak için taze bir neşter bıçak kullanın. PB taze yüzde 10 sakaroz 2 mililitre içeren bir şişe içine bölümleri yerleştirin ve kriyokoruma işlemine başlamak için 10 dakika boyunca çalkalayın.Kriyokorumayı takiben, bölümleri boya fırçası kullanarak küçük bir alüminyum folyo dikdörtgeninüzerine düz bir şekilde yerleştirin. Bölümlerden herhangi bir fazla sıvı çıkarın ve dikkatle bir paket içine folyo katlayın. Alüminyum folyoyu 30 saniye boyunca yüzeye dokunmadan sıvı nitrojen yüzeyine yakın tutun.Ve sonra bölümlerin yaklaşık 30 saniye boyunca tamamen erimesine izin verin. Dondurma yı tekrarlayın, iki kez daha çözülün. Bir fırça ile folyo tüm bölümleri çıkarın ve sürekli ajitasyon altında aşırı sakaroz yıkamak için PB iki mililitre içeren bir cam şişe içine yerleştirin.Floresan görüntüleme için immünboyama sonra, PBS içeren bir cam Petri kabıiçine slayt yerleştirin ve dikkatlice kapak kayma kaldırın. Daha sonra pasteur pipetinden pbs'nin yumuşak darbelerini kullanarak slayttaki bölümleri yıkayın. Bölümleri PBS içeren temiz bir cam şişeye yerleştirin.HrP reaksiyon ürünyükseltmek için en az iki saat, Avidin biotin kompleksi veya ABC bölümleri kuluçka ile Avidin HRP reaksiyonu gerçekleştirin. Daha sonra, 10 dakika pbs ile 3 kez bölümleri yıkayın ve sonra 10 dakika boyunca iki kez tris tampon ile. Son tris tampon yıkama çıkardıktan sonra, hızlı diaminobenzidin çözeltisi veya DAB çözeltisi için yüzde sekiz nikel klorür çözeltisi bir damla ekleyin.Daha sonra çözeltiyi karıştırıp karıştırın ve bu çözeltinin bir mililitresini bölümlerin üzerine hızla ekleyin. Bu çözeltideki bölümleri 15 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra DAB çözeltisine yüzde 1 hidrojen peroksit 10 mikrolitre ekleyin.Hücreler etiketlenene kadar reaksiyonun karanlıkta sürekli ajitasyon altında yaklaşık bir ila iki dakika devam etmesine izin verin. Bir duman başlık içinde, bir Petri kabına filtre kağıt küçük bir daire yerleştirin ve PB ile nemle. Bir boya fırçası kullanarak cam şişeden bölümleri birer birer kaldırın ve dikkatlice kağıt üzerinde düz yerleştirin. Bölümleri başka bir nemlendirilmiş filtre kağıdı çemberi ile kapatın ve kağıt mendil kağıdını yüzeye hafifçe dokunarak fazla tamponu çıkarın.Üst kağıda PB'deki %1 osmiyum tetroksitin sekiz veya dokuz damlasını uygulayın. Çanak kapak ve en az 30 dakika boyunca duman kaputunda tutmak, ama en fazla 1 saat. Durulama, montaj ve bölümleri kapladıktan sonra, yüzde 50, yüzde 70, yüzde 95 ve yüzde 100 alkol çözeltileri bir dizi ile dehydrate.Dehidratasyon adımını takiben, bölümleri yaklaşık beş dakika boyunca bir çalkalayıcıüzerinde yüzde 100 etanol içeren cam bir şişeye aktarın. Propilen oksit ile alkol çözeltisi değiştirin ve beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, şişede propilen oksit yaklaşık iki mililitre tutun ve 1:1 oranında reçin ekleyin.Resenin eridiğinden emin olun ve bölümleri 30 dakika boyunca sürekli ajitasyon altında tutun. 30 dakika sonra, epoksi reçine içeren alüminyum bir planchette her bölümü yerleştirmek için ahşap bir sopa kullanın, ve gece kuluçka. Ertesi gün, yaklaşık 10 dakika sıcak bir plaka üzerine planchette yerleştirin.Sonra ahşap bir sopa ile her bölümü almak ve temiz bir slayt üzerinde yer. Tüm bölümler slayta aktarıldıktan sonra, dilimlerin yönünü kontrol etmek için slaytı bir kesme mikroskobu altında görüntüleyin ve bölümlerin üzerine bir kapak kayması yerleştirin. 56 santigrat derecede 48 saat fırında kür.Hücre gövdesini içeren ev bölümüne odaklanmak için düşük büyütme hedefi kullanın. Sonra 100x hedefi kullanın, hücre gövdesine odaklanın ve başvuru noktasını işaretlemek için merkeze tıklayın. 100x hedefini kullanarak soma'yı 3B olarak izlemek için izleme sekmesinden kontur seçin ve hücre gövdesi konturunu seçin.Odak hücre vücudunun en üstüne taşımak için joystick kullanın. Şu anda odaklanmış olan parçanın çevresini tıklatarak noktaları yerleştirin. Bu ilk anahattı bitirmek için sağ tıklatın ve yakın kontur seçin.Hücre gövdesinin altına ulaşılınceye kadar bu işlemi farklı z pozisyonlarında tekrarlayın. Dendritik arbor izlemek için, nöron menüsünde, dendrit veya apikal dendrit seçin. İlk olarak, imlecin çapını denditin çapına uyacak şekilde ayarlamak için fare kaydırma tekerleğini kullanarak her dendrite için kısa bir başlangıç segmenti iz.Her dendrite boyunca iz. Ağaçtaki bir düğüme ulaşıldığında, açılan menüden bifurcating düğümü veya trifurcating düğümü sağ tıklatın ve seçin. Tamamlanan bölümle eşleşen bir bölümdeki dendritler arasındaki eşleşen noktaları belirlemek için, hareket sekmesine tıklayın ve maç noktalarını seçin.Eşleşmesi gereken puan sayısını seçin ve ardından Tamam'a basın. Tamamlanan bir dalışun sonuna tıklayın ve ardından dala tıklayın. Bunu her maç noktası için tekrarlayın. Her bölümün tüm dendritleri izlendikten sonra, burada gösterilen aynı işlemi kullanarak akson izini bir çizim tüpü kullanarak sınırlı dendritik ve aksonal arbor ile bir CA2 sepet hücre nin rekonstrüksiyonudur.Dendritler siyah, akson kırmızı. Bu burada açıklanan Avidin HRP protokolü aşağıdaki biocytin dolu sepet hücre örnek bir görüntüdür. Burada gösterilen CA2 sepet hücresinin bir 3D nöronal rekonstrüksiyon bir video.Dendritler koyu pembe, akson ise beyaz. Son olarak, bu resim CA2 sepet hücresinin bir dendrogramını gösterir. Bu protokolle yeterli olmak zaman alacaktır.Ancak, bu optimize yaklaşım karmaşık kortikal ve hipokampal yapıların yüksek çözünürlüklü görüntüleri in-vitro oluşturabilirsiniz.

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, bir sıçan hipokampal bölümünde biyositin dolu bir internöronun görselleştirilmesi sürecini göstermekte ve spesifik antikorlar ve floresan mikroskobu kullanılarak nörokimyasal kimliğini vurgulamaktadır.

Sıçan hipokampal bölümünde internöronların immün boyanması

Bu video, biyositin dolu internöronlar içeren sabit sıçan beyin dilimlerinin boyanması prosedürünü göstermektedir. Protokol, avidin-biotin kompleksi (ABC) ile inkübasyon, HRP ve kromojenik substrat ile boyama, osmiyum tetroksit ile yapıların korunması ve görüntüleme için dokunun reçineye gömülmesini içerir.

Görselleştirme için sıçan hipokampal dilimlerinde biyositin dolu internöronların etiketlenmesi

Nöronal ağların yapısını anlamak için, bireysel nöronların fonksiyonel ve morfolojik karakterizasyon bir zorunluluktur. Burada, juxtasomal biocytin dışı yapılandırmada elektrofizyolojik kayıtları etiketleme izin verir, ama hücre içi dendritik ve aksonal mimari post hoc yeniden için nöron etiket yeteneğini muhafaza göstermektedir.

Juxtasomal Biocytin Etiketleme Bireysel Kortikal nöronlar yapı-fonksiyon ilişkisi Çalışması için

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Primer hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürleri, nörotrofik faktörleri sağlamak ve uzun ömürlülüğü sürdürmek için genellikle glia besleyici tabakaya ihtiyaç duyar. Burada, spesifik nöronal-otonom mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştıran yüksek yoğunluklu bir nöronal besleyici tabakanın varlığında cam lameller üzerinde ultra düşük yoğunluklu nöronları kültürlemek için basitleştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz.

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Bu protokol, biocytin doldurma ve sonraki immünohistokimyasal Postprocess kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları sırasında yamalı nöronların morfolojik geri kazanılması için bir yöntem sunulur. Biz, lekeli ve kaplandı kalınlığında biocytin dolu bölümler, daha sonra ikinci bir birincil antikor gün ya da ay ile tekrar boyanmış edilebileceğini göstermektedir.

Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Burada, lateral genikulat çekirdeğini içeren akut beyin dilimleri ve retinogeniculate ve kortikogeniculate sinenler fonksiyonunun elektrofizyolojik incelenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, aynı akut beyin dilimleri içinde yüksek salınımı ve düşük salınımı olasılığı ile sinaps incelemek için etkili bir yol sağlar.

Retinogeniculate ve Kortikogeniculate SYNAPSE fonksiyonunun elektrofizyolojik Incelemeleri

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

Öğrenin hipokampal CA2 internöronlarının 3D rekonstrüksiyonu için biyositin kurtarma yöntemini. Bu protokol, elektrofizyolojik kayıtlar sonrası yüksek kaliteli morfolojik analiz sağlar.

Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu

Daha fazla video keşfet