MeshAndCollect kullanarak floresan Protein Cerulean yapı çözümü
19 Mart 2019
Biz kullanılmak üzere sonraki yapı belirlenmesi, kısmi kırınım veri kümeleri floresan protein Cerulean birçok küçük kristaller toplanan oluşan bir tam kırınım veri kümesi elde etmek için MeshAndCollect Protokolü'nün kullanılmasına mevcut.
Otomatik MeshAndCollect protokolü, seri kristalografiile standart rotasyon veri toplamasını birleştirerek disk örneklerinden küçük kristalleri ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntem, önce aynı numune tutucuya monte edilen kristallerin konumunu tanımlar ve daha sonra birleştirilecek ve yapının çözümü için kullanılacak kısmi veri kümesinin toplanmasını yönlendirir. MeshAndCollect hızlı ve aynı kurulum, yapı çözümü, ligand tarama ve tüm bu küçük kristaller ile deneyler yapmanızı sağlar gibi zorlayıcı.
Yöntem, senkrotron Beamline'ın vmx'i ile ideal olarak yüksek foton esneme, küçük bir ışın çapı ve hızlı yeniden yükleme dedektörü ile donatılmıştır. İlk olarak, protein kristalografisi beamline veritabanı için genişletilmiş bilgi sistemine bağlanın ve A formundan deney numarası ve şifre ile MX.Log'u seçin. Ardından, Gönderi Ekle Yeni'yi seçin ve istenen bilgileri doldurun.
Kısmi Ekle'yi seçin ve ilgili verileri doldurun. Kapsayıcı Ekle'yi seçin, bir SC3 diski seçin ve diskteki örnek tutucuların konumları da dahil olmak üzere gerekli bilgileri doldurun. Deney barakasında, diski örnek değiştirici doer'e yükleyin ve konumunu not edin.
Daha sonra, protein kristalografisi beamline veritabanı için bilgi sistemine giriş yapın. Deney Işey'i seçin, Gönderini bulun, İleri'yi seçin ve örnek değiştiricideki ışın çizgisi ve disk konumunu belirtin. A formunda verilen deneysel numara ve parolaile beamline kontrol yazılımına giriş yapın.
Protein kristalografisi beamline veritabanı için bilgi sistemi ile ışın hattı kontrol yazılımı senkronize etmek için Sync tuşuna basın. Örnek tutucuyu goniometer üzerine monte etmek için ışın çizgisi kontrol yazılımını kullanın. Ardından örnek değiştirici alanında bir konuma sağ tıklayın ve Örnek Dağı'nı seçin.
Orta düğmeyi seçin ve ardından döngünün ucunun kenarının ortasına üç tıklama merkezi açın. Kaydet'i seçerek ortalanmış konumu kaydedin. Gelişmiş altında, veri toplama kuyruğuna iş akışı Görsel Yeniden Yönlendirme'yi ekleyin.
Ardından Sıra topla'yı tıklatarak iş akışını başlatın. Ardından, üzerine tıklayarak kaydedilen merkez konumlarından birini seçin. Merkez düğmesine tekrar tıklayın, ardından döngünün sapının başlangıcının ortasında üç tıklatma merkezi.
Kaydet'e tıklayarak ikinci konumu kaydedin. Ardından Devam'a tıklayın. İş akışı, numune tutucunun düzlemini goniometrenin dönüş ekseniyle hizaladıktan sonra, numune tutucuyu kafesin ortasında bir yere tekrar ortaladı.
Numune tutucuyu, ışın hattı kontrol yazılımını kullanarak omega eksenini döndürerek kafesin yüzünün x-ışını nın yönüne dik olması için yönlendirin. Beamline kontrol yazılımında Diyafram açılır menüsüne tıklayın ve bir değer seçin. Ardından örgü aracı penceresini açmak için örgü araç simgesine tıklayın.
Işın çizgisi kontrol yazılımının örnek görünümünde, fareyi sol tıklatarak ve örnek tutucuda kristaller içeren alanın üzerine sürükleyerek kafesi çizin. Kafesi kaydetmek için, kafes aracı penceresindeki artı düğmesini tıklatın. Beamline kontrol yazılımının çözünürlük alanına, kırınım görüntülerinin toplanması gereken çözünürlüğü girin.
Kristallerin kırınım kalitesi hakkında önceden bilgi yoksa, iki ile 2,5 arasında bir değer önerilir. Gelişmiş veri toplama sekmesinde MeshAndCollect'i seçin. Kuyruğa ekleyin ve Sırayı Topla'yı tıklatın.
Parametre penceresinde, beamline bağımlı varsayılan parametreleri kullanın. Burada açıklanan deneyde, varsayılan parametreler kafes tonu noktası başına 0,037 saniye pozlama süresi, %100 iletim ve kafes tonu başına bir derece salınımdır. Devam'ı tıklatın.
Örgü tkamı çalışır ve her ızgara noktasında toplanan kırınım görüntüleri analiz edilir ve yazılım Dozer ile kırınım gücüne göre sıralanır. Dozer analizinden sonra bir ısı haritası oluşturulur ve sonraki kısmi veri toplama sırası kırınım gücüne göre otomatik olarak atanır. Son olarak, kısmi veri koleksiyonlarını başlatmak için Devam'ı tıklatın.
MeshAndCollect MXCuBE uygulanan olarak kristallerin görsel tanımlama zor olduğu aynı örnek tutucu üzerinde bulunan Cerulean küçük kristaller kısmi kırınım veri kümelerinin toplanması için kullanılmıştır. Örnek tutucuyu taramak için, örgü döngünün ortasına bir ızgara çizildi ve Dozer skor ısı haritasına göre 85 kısmi kırınım veri seti otomatik olarak toplandı. Bunlar tek tek entegre edildi ve 1,7 angstrom çözünürlüğünde %99,8 bütünlüklü bir veri seti üretmek üzere birleştirildi.
Beklendiği gibi, Cerulean kristal yapısı oluşturulan veri seti kullanılarak moleküler değiştirme ile çözülebilir. Arıtma dan sonra %22.8 R ve %25.4 r ücretsiz çalışma elde edildi. Daha önce belirlenen yapının süper konumu 0.1 angstroms c-alfa pozisyonları üzerinde küresel bir RMSD gösterir.
Kristal büyüme aşamasının optimizasyonu yapılan projelerde, MeshAndCollect küçük kristallerden elde edilen bu amorf kısmi veri kümelerinin birleşimine dayalı tam bir veri seti elde etme olanağı sağlar. Bu teknik, yapısal biyologların mikro kristallerin sadece onda birinin üretilemediği parça örneklerinden bir yapıyı çözmelerinin önünü açtı.
Genel Bakış
MeshAndCollect protokolü, küçük kristallerden tam diffraksiyon veri setlerinin toplanmasını sağlar, özellikle floresan protein Cerulean için. Bu yöntem, seri kristalografiyi standart rotasyon veri toplamayla entegre ederek hızlı deneyleri kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Strüktürel Biyoloji
- Kristalografya
- Protein Analizi
Arka Plan
- MeshAndCollect, birden fazla küçük kristalden gelen verileri birleştirir.
- Sinkrotron ışın çizgileriyle kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
- Protokol, yapı belirleme verimliliğini artırır.
- Küçük kristallerin görsel olarak tanımlanmasındaki zorlukları ele alır.
Çalışmanın Amacı
- Tam diffraksiyon veri setlerini elde etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Küçük kristallerden yapı belirlemesini kolaylaştırmak.
- Deneylerin hızını ve verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Küçük kristallerden kısmi veri setlerinin otomatik olarak toplanması.
- Dozer yazılımı kullanılarak analiz için verilerin entegrasyonu.
- Numune konumlandırmasını optimize etmek için bir ızgara aracının kullanılması.
- Veri toplama için varsayılan parametrelerin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- 85 kısmi diffraksiyon veri seti %99,8 bütünlükle toplanmıştır.
- Elde edilen çözünürlük 1,7 angstrom'du.
- Cerulean'ın kristal yapısı başarıyla çözüldü.
- İnceleme, %22,8 R work ve %25,4 R free sonuçlarını verdi.
Sonuçlar
- MeshAndCollect, küçük kristallerden etkili veri toplamayı sağlar.
- Bu teknik, karmaşık yapıları çözmede yapısal biyologları destekler.
- Sınırlı kristal büyümesi olan projeler için bir çözüm sunar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Structural determination of fluorescent proteins like Cerulean supports target validation and assay development in biopharma R&D by enabling mechanistic de-risking of protein function and interaction studies. The MeshAndCollect protocol addresses a key bottleneck in early discovery: obtaining high-quality structural data from poorly diffracting or micro-crystalline samples that hinder traditional X-ray crystallography workflows. This capability enhances predictive confidence in lead identification and supports portfolio triage by providing reliable structural insights for structure-based drug design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural data from weakly diffracting crystals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein-ligand interactions and functional sites critical for target validation.
- Predictive Value: Improves confidence in structural models used for virtual screening and lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated structural templates for assay standardization and reproducibility in fluorescence-based screening platforms.
- Operational Value: Facilitates preparation of consistent biological systems for downstream compound evaluation and ligand screening campaigns.
- Scalability: Enables reuse of micro-crystal data collection workflows across multiple targets in structural genomics initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with disease-relevant systems by providing structural insights into fluorescent protein behavior in cellular environments.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming structural integrity under experimental conditions.
- Preclinical Readiness: Enables risk-adjusted advancement decisions through reliable structural data for biomarker and probe development.
Pipeline & Workflow Integration
The MeshAndCollect protocol fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly for projects challenged by difficult crystallization or limited sample availability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering high-resolution structural data from micro-crystals.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized, reproducible structural inputs for ligand binding and conformational studies.
- Analytics: Generates quantitative diffraction data sets with high completeness (99.8%) and defined resolution (1.7 Å) for reliable comparative analysis.
- Translational Research: Connects structural findings to preclinical continuity by enabling biomarker alignment and probe development.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, automated capability for structural data acquisition across multiple targets and campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target structure, reduction of mechanistic ambiguity, and improved model accuracy.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and rapid data collection from non-ideal crystals.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in crystallography campaigns, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable structural data for advancement or termination decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallography and synchrotron beamline operations.
- Dependent on access to VMX-equipped beamlines with high photon flux, small beam size, and fast detectors.
- Necessitates standardized sample preparation and puck-based loading protocols for consistent mesh-based positioning.
- Involves cross-team alignment between structural biology, assay development, and computational modeling groups.
- Limited by crystal quality and diffraction strength, though effective even with weakly diffracting micro-crystals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Offline Preparation of the Synchrotron Experiment
1:31
Loading of the Sample onto a Beamline
3:49
Prepare and Execute the MeshAndCollect Workflow
5:02
Results: Structure Determination of the Fluorescent Protein Cerulean using MeshAndCollect
6:10
Conclusion
