Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

Herkese hoş geldiniz. Benim adım Win Surachetpong. Tayland'daki Kasetstart Üniversitesi Veteriner Lik fakültesi veteriner mikrobiyoloji ve İmmünoloji fakültesinde yardımcı doçentim.

Ben ve ekibim tilapia'da ortaya çıkan viral hastalıklar konusunda uzmanız. Şu anda tilapia'da yüksek mortaliteye neden olan tilapia gölü virüsü üzerinde çalışıyoruz. Tilapia dünya çapında kültür olan ikinci en önemli balık türü olduğundan, bir milyon insan için protein kaynağı sağlamak ve gıda güvenliği için önemli bir rol oynamaktadır.

Tilapia gölü virüsünün son zamanlarda patlak vermesi sosyoekonomik etkiye neden oldu ve bu da birçok bilim adamının bu soruna bir çözüm bulmaya çalışmasına yol açtı. Şu ana kadar virüsü tespit etmek için son derece hassas, hızlı ve doğru bir yönteme ihtiyacımız var. Bu videoda, örnek toplama, örnek popülasyon ve gerçek zamanlı PCR analizinden başlayarak balık dokusundaki tilapia göl virüsünü tespit etmek için size adım adım göstereceğiz.

İlk olarak, balık ötenazi için suda bez yağı aşırı doz da yatıştırmak. Bir tepsiye ölü balık yerleştirin, % 95 etanol kullanarak ekipman sterilize, sonra bir alkol brülör ile yandı. Yavaş yavaş karaciğer toplamak için, alt karın yukarı balık açık kesin.

1.5 mililitrelik santrifüj tüpü içine karaciğer parçası toplamak. RNA ekstraksiyonunun ilk bölümü Laminar Flow Hood'da yapılmalı ve koruyucu ekipman takılmalıdır. Tüp içine RNA ekstraksiyon reaktif bir mililitre ekleyin.

Homojen içine bir doku pestle kullanarak karaciğer pulverize. Tüpiçine 200 mikrolitre kloroform ekleyin. Daha sonra, yavaşça tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın.

Oda sıcaklığında üç dakika kenara koyun. 12,000 RCF'de 15 dakika boyunca 4 derece santigrat derecede santrifüj. Dikkatle santrifüj tüpleri toplamak.

Renksiz üst sulu fazın 500 mikrolitresini yeni bir tüpe yavaşça aktarın. Tüp içine bir hacim isopropanol ekleyin. Isı eksi 20 derece santigrat iki saat veya bir gecede kadar RNA çöktürmek için.

Kuluçkadan sonra çözeltiyi aynı santrifüj durumunda santrifüj edin. Santrifüj tüpleri toplamak, sonra supernatant atın. RNA pelet ok tarafından işaret olarak görülebilir.

RNA pelet yıkamak için tüp içine% 75 etanol bir mililitre ekleyin ve birkaç kez ters. Santrifüj dört santigrat derecede, 10,000 RCF'de 15 dakika. Santrifüj tüpleri toplamak, sonra supernatant atın.

Otomatik pipet kullanarak kalan etanol dışarı çekin ve beş ila 10 dakika oda sıcaklığında kuru hava. RNA peletini yatıştırmak için önceden 55 ila 60 santigrat dereceye ısıtılmış 30 ila 60 mikrolitre RNa içermeyen su ekleyin. Mikro hacim spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçmek için bir ila iki mikrolitre RNA çözeltisi kullanın.

Sonuçlar ekranda gösterilecek. RNase serbest su kullanarak mikrolitre başına 200 nanogram konsantrasyonseyreltin. Aşağıdaki gibi listelenen kimyasallar ve koşullar kullanarak cDNA sentezini gerçekleştirin.

Önerilen koşullarla RNA'yı cDNA'ya dönüştürmek için bir termocycler kullanın. Gerçek zamanlı PCR kullanarak TiLV yükünün belirlenmesinde kullanılan kimyasallar ve koşullar aşağıda veda edilebistir. Beyaz qPCR şerit tüp her şişe içine qPCR ana karışımı altı mililitre dağıtın.

Daha sonra, cDNA örneği dört mililitre kuyuya yüklenir. Bu aşamada, numuneden numuneye kontaminasyonu önlemek için her kuyuda yeni bir boru ucu değiştirilmelidir. QPCR şeridini şeffaf bir qPCR şerit kapağıyla sıkıca kapatın.

Şeridin bir ucunda hafifçe hareket ettirerek çözeltiyi hafifçe karıştırın. Sonra damarların altındaki tüm sıvı toplamak için mikro santrifüj kullanarak aşağı spin. Videoda gösterildiği gibi iki adım koşulu kullanın, kullanacağınız 96 kuyu plakasındaki kuyuyu seçin.

Boya için flora olarak siber yeşil seçin. Örnek türü olarak bilinmeyen'i seçin ve örnek ad kutusuna bir ad ekleyin. Gerçek zamanlı BIR PCR makinesinin kapağını açın ve qPCR şeridini atanan kuyuya yerleştirin.

O zaman kapağını kapat. Makineyi seçili koşulla çalıştırın. Kapak istenilen sıcaklığa ulaştıktan sonra makine başlayıp çalışacaktır.

QPCR koşullarının sona ermesinden sonra amplifikasyon eğrisi gösterilir. Burada, oran oku, eşik düzeyinin üstel faz ile doğrusal faz arasında kesildiği ve BT değeriyle sonuçlandığı noktayı gösterir. CT değeri daha sonra standart eğriyi kullanarak virüs kalır bir dizi hesaplamak için virüs günlük kopya numarası içine ekstrapolated.

Erime zirvesi de qPCR tarafından tespit edilen virüs olup olmadığını belirlemek için görüntülenir, gerçekten, erime zirveleri genellikle arasında değişmektedir TiLV 79.5 ve 80.5 santigrat derece. Bu nedenle, bu yöntemin, tilv enfeksiyonunun yayılmasını kontrol etmek ve sınırlamak gerektirebilecek dünya çapında çiftçiler ve organizasyonlar için önemli araçlar olacağını umuyoruz.