Emici Microbiopsy örnekleme ve RNA çıkarma minimal invaziv, eşzamanlı kan ve cilt analizi için

Bu yöntem cilt hastalıkları için biyo belirteçlerin kurulmasını kolaylaştırabilir ve aynı zamanda klinik araştırma katılımcıları için riski azaltabilir. Bu tekniğin en önemli avantajları yoğun eğitim gerektirmemesi ve herhangi bir yara izi bırakmamasıdır. Mikrobiyopsiden beş dakika önce, boş bir iki mililitrelik santrifüj tüpünü kuru buza beş dakika yerleştirin.

Tek kullanımlık eldiven ler giyerek, uygulama alanını alkol mendiliyle dezenfekte etmeden önce ellerinizi ve aletleri %70 etanolile püskürtün. Mikroiğneye dokunmadan sterilize gama radyasyon paketinden mikro biyopsiyi çıkarın ve bir tıklama duyulana ve piston yerine kilitlenene kadar pistonu çekin. Yüklenmiş cihazı numune alınacak cilde yaklaşık dik bir açıyla nişan alarak, örnekleme alanının sabit bir konumda olduğuna dikkat edin ve cihazı en az bir kilogram kuvvet içinde cilde uygulayın.

Ardından tetiği basın ve cihazı en az on saniye yerinde tutun. Eğer cihaz 10 saniyeden önce serbest bırakılırsa, kan emiliminde ve sonraki analizlerde daha fazla varyasyon olasılığı vardır. Numune emildiğinde, yavaşça piston ve emici mikroiğneyi kasadan çekin ve mikroiğnenin iki deliğini çekmek için steril forceps kullanın.

Kuru buz üzerinde tüpe 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve bozulmamış mikroiğneyi tüpe kuru buz iğnesi tarafına yerleştirin. Kaldırma işlemi sırasında mikroiğneucunun bir şeye dokunmasına izin vermemeye dikkat edin. Girdap üç ila beş saniye mikroiğne ucu bazı örneklenmiş malzeme toplamak ve 42 derece santigrat 30 dakika boyunca bir ısı bloğu veya su banyosu tüp tüp inkübün.

Kuluçka sonunda, mikroiğne seviyesinin arka ucunu mikrofuge tüpünün üst kenarı ile yerleştirmek ve mikroiğnenin üst kısmı kapak ile tüp arasında yerinde tutulacak şekilde tüpün kapağını kapatmak için steril entesler kullanın. Tüpü, cihazın emici tabakasından numune alınan malzemeyi toplamak için santrifüj edin ve ucu tampon çözeltisine geri batırmadan mikroiğneyi dikkatlice çıkarmak için forsepsleri kullanın. Numuneyi tekrar santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Sonraki oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için bir arıtma sütun filtre membran üzerine klima tampon 250 mikrolitre ekleyin ve santrifüj ile tampon seyreltin. Çıkarılan RNA örneğine %70 etanol 50 mikrolitre ekleyin ve karışımı ön koşullu arıtma sütununa aktarın. Hemen tüp iki kez akış kaldırmak için santrifüj, yıkama tampon bir yüz mikrolitre bir yıkama ardından.

DNA sindirimi için, 40 mikrolitre taze hazırlanmış DNA kuluçka karışımını doğrudan arınma sütunmembranına ekleyin ve ardından oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçka için 40 mikrolitre yıkama tamponu ilave edin. Santrifüjsonunda, kolon100 mikrolitre yıkama tampon iki ile yıkayın ve herhangi bir artık yıkama tampon için arıtma sütunu kontrol edin. Arıtma kolonunun RNA ekstraksiyon kitinde sağlanan 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve pipetin ucunu doğrudan arıtma sütununun zarına yerleştirerek kolona 11 mikrolitre RNA sPRE suyu ekleyin.

Oda sıcaklığında iki dakikalık kuluçkadan sonra, sütunu bir kez sütun boyunca RNA sPRE su dağıtmak için santrifüj ve bir kez rna ejek etmek için. CDNA sentezi hemen yapılmazsa toplam RNA örneğini eksi 80 derecede saklayın. Emici mikrobiyopsi mikroiğne cilt ve kan eşzamanlı örnekleme için arasında bir emici tabaka ile çelik plaka iki tabaka oluşur.

Emici mikrobiyopsi kullanımı sadece küçük eritem indükler, 48 saat sonra fark edilmez. Delindikten sonra, mikroiğnenin ucuna yakın birkaç küçük deri parçası yakalanır ve kan filtre kağıdına emilir. Emici mikroiğne delindikten hemen sonra çıkarıldığında, numune hacmi ve sonraki çıkarılan mRNA miktarı, delinmeden sonra on saniye bekletildikten sonra elde edilenden önemli ölçüde daha düşüktür.

Cilt belirteç ekspresyonunun benzer düzeyleri, kantitatif PCR analizi ile emici mikrobiyopsi ve selefi deri mikrobiyopsisi kullanımından sonra saptanır. Ama beyaz kan hücresi biyomarker ekspresyonu önemli ölçüde daha yüksek bir düzeyde emici mikrobiyopsi örnekleme sonra tespit edilir, emici mikrobiyopsi mikroiğne cilt mikrobiyopsisi ile aynı kapasiteyi korurken kan toplama için daha iyi performans göstermektedir. Bu nedenle, tekniği uygularken, cihazı önerdiğimiz şeye göre uygulamanın güvenilir sonuçlar elde etmek için çok önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Yani bu prosedürü takiben, diğer yöntemler, gerçek zamanlı PCR gibi, nispeten gen ekspresyonu profilleme için takip edilebilir. Cihazı hala geliştirmemize rağmen, bu tekniğin örnekleme, dermatolojik kozmetik veya pediatrik uygulama için klinik araştırmaların önünü açtığından eminiz, çünkü çok basit ve minimal invaziv.