Name: Fluorimetric teknikleri Sperm membran değerlendirilmesi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Öğrenin, floresan prob ve akış sitometri kullanarak sperm membran bütünlüğünü değerlendirmek için. Bu yöntemler, döllenme potansiyeli tahmini ve meni kalitesi analizinde araştırmacılara kesin sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar "SION" İsrail şirketi Suni tohumlama ve üreme (Hafetz-Haim, İsrail) için onların yardım ve işbirliği ve Bayan Li Na (te teknolojileri, L'Aigle, Fransa) araç kurulum ve eğitim ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm deneyler için hayvan refah 1994 İsrail yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sığır sperm Suni tohumlama ve ıslahı için ticari İsrail şirketi tarafından sağlandı. Cinsel ilißki 11 boğa bu çalışmada değerlendirildi.
1. sperm hazırlama örnek
Not: Yordamı Roth Laboratuvarı protokol1,3temel alır.
<ol><li>Yaklaşık 1-6 mL, Boğa Meni oda sıcaklığında 15 mL tüp içinde elde edilir.</li>
	<li>Her 1 ml sperm, prewarmed (37 ° C'de) NKM arabellek (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM süpürgeyi [3-N-morphilino propanesulfonic asit; pH 7.4]) 6 mL ekleyin ve süpernatant kadar 1-2 kez 8 dk 600 x g, az temizleyin için santrifüj kapasitesi. Not: Sperm konsantrasyonu veya ilk iki tüp ilk yıkama bölünmüş çok yüksek ise.</li>
	<li>Çıkarmak ve temiz süpernatant atmak ve yaklaşık 1 cm süpernatant Pelet yukarıda bırakılır.</li>
	<li>Dikkatlice yukarı yüzmek ve 37 ° C'de yüzmeyi sperm elde izin vermek için 20-30 dakika bekleyin sperm için yüzey alanını artırmak için bir 30 ° açıyla tüpler yalın Not: Bulanıklık görülebilir.</li>
	<li>Bir micropipette dikkatli bir şekilde kullanarak, yeni bir 1,5 mL tüp hareketli sperm hücreleri içeren süpernatant üst 1 mL kaldırın.</li>
	<li>Sperm 37 ° C'de kullanımda kadar devam.</li>
	<li>Neubauer hemasitometre kullanan sperm sayısı tahmini. Not: Farklı bir sayım odası bunun yerine kullanılabilir, ancak sayma farklıdır.<ol>
<li>Spermatozoon hareket önlemek için hareketli sperm hücreleri 100 µL ile Çift Kişilik distile su (DDW) (1: 100 seyreltme) 15 mL tüp 10 mL seyreltik ve karışımı yavaşça.</li>
		<li>Örnek 10 µL hemasitometre ve coverslip her iki tarafında yükleyin. Bu bir yanlış sperm sayısı neden olabileceğinden kabarcık oluşumu odası içinde önlemek emin olun.</li>
		<li>20 X amacı ile bileşik mikroskopla gözlemlemek. Not: Bir hemasitometre üzerinde tam bir kılavuz görüntüler 9 büyük kareler, her 1 mm2ve coverglass 0,1 mm odası kat duruyor. Böylece, Merkez sayım alanı üzerinde 0,1 mm3 veya 0,1 µL birimdir. Hemasitometre merkez alan 25 orta kareler içerir ve her bir orta boy kare tek satırları ile 16 küçük kareler vardır.</li>
		<li>Toplam 4 Orta köşe kareler ve merkezi kare bulunan hücreleri sayar. Daha yüksek kesinlik iki odaları (Neubauer hemasitometre her iki tarafında) saymak ve ortalama hücre toplama hesaplamak için kullanın.</li>
		<li>Sperm sayısını 5 (alan sayma başına hücre sayısı elde etmek için) ve 10.000 (seyreltilmiş örnek 1 mL başına hücre sayısı elde etmek için) tarafından elde edilen ortalama sayıyı çarparak hesaplayabilirsiniz. Sonra elde edilen sayısı seyreltme faktörü (1: 100) tarafından çarpın. Not: Örneğin, bir ortalama 5 25 orta kareler iki odaları merkezi sayım alanı içinde sayılan sperm 150 sayısıdır ([152 + 148] / 2). Böylece, ortalama spermlerinin odası (veya başına 0.1 µL) 150 x 5 = 750 sayısıdır. 750 seyreltilmiş örnek (7.500.000) 1 mL başına hücre sayısı elde edilir ve sonra 100 mL orijinal meni örneği başına 75 x 107 hücre elde etmek için (seyreltme faktörü) ile çarpın 10.000 çarpın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Teknik #1: Aynı anda birden çok floresan kullanarak Sperm membran değerlendirilmesi probları
Not: Sperm membran (plazma, acrosomal ve mitokondrial) daha önce Celeghini ve ark.10, bazı değişikliklerle tarafından açıklandığı gibi değerlendirildi. Epifluorescent mikroskobu ile 450-490 nm, uyarma ve emisyon 515-565 nm çift kişilik bir filtre kullanarak, bir dijital fotoğraf makinesi ile birlikte kullanılmıştır.
<ol><li>
Hisse senedi çözümleri hazırlayın.
	<ol>
<li>0.1 mg/mL, DAPI 5 mg fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 ml çözülerek DAPI hisse senedi çözüm hazırlamak. 50 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Önce kullanma, PBS ile hisse senedi çözüm 1:10 at (çalışma çözüm; 10 µg/mL) oranında seyreltin.</li>
		<li>1 mg/mL FITC-PSA 1 mg 1 ml PBS çözülerek FITC-PSA hisse senedi çözüm hazırlamak. 50 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Önce kullanma, PBS ile hisse senedi çözüm 1:10 at (çalışma çözüm; 100 µg/mL) oranında seyreltin.</li>
		<li>1 mg/mL JC-1 hisse senedi çözüm JC-1 1 mg dimetil sülfoksit (DMSO) 1 ml çözülerek hazırlayın. 10 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Önce kullanma, DMSO ile hisse senedi çözüm 1:10 at (çalışma çözüm; 0.1 mg/mL) oranında seyreltin.</li>
		<li>PI hisse senedi çözüm PI 10 mg (veren 2.5 mg/mL) PBS 400 µL içinde çözülerek hazırlayın. Mağaza, + 4 ° c PBS ile stok 1 1:20 at (çalışma çözüm; 0,125 mg/mL) oranında seyreltin. 4 ° C'de bir hisse senedi çözüm olarak depolar. Dikkat: PI potansiyel bir alkil ve dikkatle ele alınmalıdır. Boya güvenli bir şekilde ve geçerli yerel düzenlemeler uyarınca bertaraf gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hareketli sperm (adım 1.5) 133 µL yeni bir 1,5 mL tüp (25 x 106 sperm/mL) aktarın. Not: Örnek konsantrasyonu yüksek ise, gerekli toplama ulaşmak için NKM arabellekte seyreltik; yüzmek kadar örnek örnek konsantrasyon düşükse, 1000 x g 5 min için de yüzmeyi sonra elde edilen süpernatant santrifüj kapasitesi, 0.5 mL süpernatant kaldırmak ve tekrar sperm Sayın.</li>
	<li>17 µL DAPI (çalışma çözüm) ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
	<li>1000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Pelet için 100 µL NKM arabelleği ekleyin.</li>
	<li>50 µL FITC-PSA, JC-1'in 2 µL ve Pi (çözümleri çalışma) 3 µL ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
	<li>1000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Pelet için 40 µL NKM arabelleği ekleyin ve pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Örnek 10 µL transfer için bir cam slayt, smear ve coverslip.</li>
	<li>
Hemen bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış bir çift filtreli epifluorescence mikroskobu (kullanım 40 x amaç) tarafından görselleştirmek ve her filtre için ayrı ayrı fotoğraf çekme. Not: Görselleştirildiği filtreleri açısından önemi vardır.<ol>
<li>358 nm, uyarma ve emisyon 461, DAPI kanalın altında görsel nm.</li>
		<li>450 – 490 nm, uyarma ve emisyon 515 – 565 nm, yeşil monomer için FITC kanal altında görselleştirin.</li>
		<li>488 nm, uyarma ve emisyon 590, kırmızı toplamalar için PI kanalın altında görsel nm.</li>
		<li>JC-1 altında görselleştirmek uyarma 559 nm ve emisyon 574-627 nm; yelpazesi ile kırmızı toplamları JC-1 yeşil monomerleri ile 488 nm ve emisyon 500-535 nm aralığında uyarma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kamera yazılımı "Birleştir" seçeneğini kullanarak, JPG/JPEG formatında filtrelerden alınan üç görüntüleri birleştirme.</li>
	<li>"Boya" aracı ile birleştirilen görüntüyü açın ve sınırlı sayıda sperm hücreleri işaretlemek için fırça seçeneğini kullanın.</li>
	<li>
Sperm hücreleri her sonda yayılan floresans temel sınıflandırmak:
	<ol>
<li>Genel olarak değerlendirmek slayt başına en az 200 sperm hücreleri — tüm hücreleri mavi görünür (DAPI).</li>
		<li>Canlılığı değerlendirmek ölü hücreleri sayarak, görünme mor (PI [kırmızı] + [Mavi] DAPI) ve ölü hücreleri (ölü hücreler/toplam sayılan hücreleri x 100) yüzdesini hesaplamak.</li>
		<li>Floresan (FITC-PSA) boyama desenleri kullanarak acrosome durumunu değerlendirmek. Farklı desenler (sağlam, bozuk veya tepki acrosome hücreler/toplam sayılan x 100 hücreleri) yüzdeleri hesaplamak. Not: Hasarlı acrosomal membran tamamen lekeli, yeşil acrosome kap olarak görünür; tepki acrosomal membran kalan yeşil Ekvator veya üst boyama gösterir; sağlam acrosomal membran içeren hücreleri herhangi bir yeşil acrosomal bölgesinin boyama sergileyecek değil.</li>
		<li>ΔΨm kırmızı lekeli midpiece sergi ile yüksek ΔΨm, Sperm hücreleri ve yeşil lekeli midpiece sergi düşük ΔΨm ile sperm elde ayrım tarafından değerlendirmek. Kırmızı saymak ve midpieces ayrı olarak yeşil ve onların oranı (kırmızı/yeşil) hesaplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Teknik #2: Kullanıma hazır kitleri ve akış sitometresi ile Sperm membran değerlendirilmesi
Not: Plazma membran bütünlüğü, mitokondrial membran potansiyeli ve acrosomal membran bütünlüğü değerlendirilmesi liyofilize fluorochromes her iyi içeren kullanıma hazır akış sitometresi kitleri ile gerçekleştirildi. Müdahalede üreticileri bazı değişikliklerle göre.
<ol><li>
Plazma membran bütünlüğü değerlendirme
	<ol>
<li>Canlılık ve konsantrasyon seti (PI ve SYbr14) paket kuyulardan istenen sayıda alabilir, onları çalışma taban ve kapağı esnek bir kapak ile transfer (ışıktan korumak).</li>
		<li>199 µL sitometresi iyi ücret için arabelleğe alınan çözümü ekleyin.</li>
		<li>Homojen meni 1 µL 57 x 106/mL (iyi başına 57,000 hücreleri) ekleyin ve pipetting tarafından homojenize.</li>
		<li>Plakayı siyah kapaklı kapağı.</li>
		<li>Işıktan korunan 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>Örnek ayar 'canlılığı ile' akış sitometresi çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitokondrial membran potansiyeli
	<ol>
<li>Mitokondrial aktivite seti (JC-1) paket kuyulardan istenen sayıda alabilir, onları çalışma taban ve kapağı esnek bir kapak ile transfer (ışıktan korumak).</li>
		<li>Mutlak etanol iyi başına 10 µL ekleyin ve pipet mevcut toz içinde iyi resuspend.</li>
		<li>Pipetting tarafından homojenize ve PBS 190 µL iyi başına ekleyin.</li>
		<li>Homojen meni 0,75 µL 57 x 106/mL (iyi başına 50.000 hücreleri) ekleyin ve pipetting tarafından lunaparkçı.</li>
		<li>Plakayı siyah kapaklı kapağı.</li>
		<li>Işıktan korunan 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Üzerinden ayar ʽmitochondrial aktivite ile akış sitometresi örneği çalıştırmak '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acrosomal membran bütünlüğü Not: (Bkz: tekniği #1) FITC-PSA boyama 3 acrosome Kategoriler (sağlam acrosome, tepki acrosome ve hasarlı acrosome) değerlendirilmesi sağlar. Akış Sitometresi ve canlılığı ve acrosome bütünlük kiti (PI ve FITC-PNA) kullanarak, Sperm hücreleri bu 3 kategoriye ayrılır.<ol>
<li>Canlılığı & acrosome bütünlük kiti paket kuyulardan istenen sayıda alabilir, onları çalışma taban ve kapağı esnek bir kapak ile transfer (ışıktan korumak).</li>
		<li>Sitometresi iyi ücret için tampon çözeltinin 200 µL ekleyin.</li>
		<li>Homojen meni 0.7 µL 57 x 106/mL (iyi başına 40.000 hücreleri) ekleyin ve pipetting tarafından lunaparkçı.</li>
		<li>Plakayı siyah kapaklı kapağı.</li>
		<li>Işıktan korunan 37 ° C'de 45 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Ayar ʽInCyte ile akış sitometresi örneği çalıştırın '.</li>
		<li>Üç işaret alanda floresan yoğunluğu göre çoğunluğuna göre sonuç çubuk grafik analiz, önemsiz, düşük Floresanda hücreleri ile bozulmamış, günahı acrosome (R1) temsil eden, düşük Floresanda ile acrosome (R2) parçası lekeli kalan hücreleri ve Son derece Floresanda hücreleri ile kesintiye acrosome (R3). Not: Araç kullanım kılavuzu "diğer modüller kullanılarak elde dosyalarını çözümleme" bölümünde üç bölgeler (R1, R2, R3) oluşturmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Teknik #3: Floresan problar ve akış sitometresi kullanarak Sperm membran değerlendirilmesi
Not: V annexin kullanım apoptosis değerlendirilmesi ve apoptotik sperm (apoptotik dizin) oranı hesaplama PI fluorochromes sağlar ile birlikte.
<ol><li>1 V bağlama arabellek 20 hisse senedi çözüm (V bağlama arabellek 20 x 9.5 mL steril distile su ile hisse senedi çözüm annexin seyreltik 500 µL) x annexin x hazırlamak.</li>
	<li>Neubauer hemasitometre 1.7 bölümünde açıklandığı gibi kullanarak sperm sayısı tahmini.</li>
	<li>106 sperm 1 mL 1 x V bağlama arabellek ve 10 min için 300 x g , santrifüj annexin yıkayın.</li>
	<li>Süpernatant tamamen Aspire edin.</li>
	<li>Pelet 100 µL V bağlama arabellek annexin x 1 resuspend.</li>
	<li>Annexin v FITC için Birleşik 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Mix iyi ve 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Sperm hücreleri 300 x g 10 min için de 106 hücreler ve santrifüj başına 1 x V annexin bağlama arabellek 1 mL ekleyerek yıkayın.</li>
	<li>Süpernatant tamamen Aspire edin.</li>
	<li>Hücre Pelet 106 toplam hücre başına 1 x V annexin bağlama arabellek 500 µL resuspend.</li>
	<li>1 µg/mL PI ile bir Akış Sitometresi Analizi hemen önce ekleyin.</li>
	<li>ʽInCyte ayarla akış sitometresi örneği çalıştırın '.</li>
</ol>

<ol><li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li>
<li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li>
<li>Beltrán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li>
<li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li>
<li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li>
<li>Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Hung%22%5BJournal%5D)">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
<li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li>
<li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma%2C+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li>
<li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+in+reproduction%3A+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li>
<li>Eddy, E. M., O’Brien, A. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=6j-mOAcNnPUC&pgis=1">The spermatozoon</a>. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).</li>
<li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li>
<li>Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li>
<li>Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oxidative+phosphorylation%2C+the+mitochondrial+membrane+potential%2C+and+their+role+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li>
<li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li>
<li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li>
<li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen%2C+including+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması vardır bildirin.

Sperm fertilizasyon potansiyel çoklu kalitesini yansıtan faktöre bağlıdır. Sperm hücreleri yüksek konsantrasyon ve çok kademeli hareketli sperm hücreleri yüksek oranda yüksek kaliteli sperm kabul olabilir. Yine de, böyle bir değerlendirme dikkate almaz diğer hücresel ve fonksiyonel parametreler. 'Tezgah üstü' microcapillary akış sitometresi kullanımı floresan problar, daha önce başkaları tarafından17 gösterilen ve burada (tekniği #3) gösterildiği gibi kullanarak çeşitli sperm yapıları değerlendiri...

Bütünlük ve sperm membran işlevselliğini sperm canlılığı ve fertilizasyon potansiyeli gösteren faktörlerden birkaçıdır. Plazma zarı böylece hücresel ozmotik denge1bakımı, hücre içi ve hücre dışı bölmeleri arasında bir bariyer görevi görür. Plazma membran bütünlüğü zarar indükler herhangi bir stres homeostazı bozabilir, canlılık ve döllenme kapasite azaltmak ve hücre ölümü artırmak. Örneğin, dondurma sperm canlılığı nedeniyle sıcaklık değişiklikleri ve ozmotik stres2bir sonucu olarak onun plazma zarı zarar azaltır. Biz daha önce gıda kaynaklı kirleticiler pestisit atrazine, onun büyük metaboliti diaminochlorotriazine veya mikotoksin Aflatoksin B1, gibi düşük konsantrasyonlarda boğa sperm açığa sperm canlılığı1,3 azaltır rapor . Bu PI, hasarlı bir plazma zarı içeren hücrelerin DNA bağlar ile birlikte çift iplikçikli DNA DAPI ile etiketleme tarafından tespit edilmiştir.
Füzyon acrosomal enzimler4,5sürümde kaynaklanan örten plazma zarı ve dış acrosome membran acrosome reaksiyon (AR) içerir. Zona pelusida penetrasyon ve daha fazla sperm yumurta6ile birleştirilmesi için önemli olaylar bunlar. Bu nedenle, acrosomal membran bütünlüğü değerlendirilmesi erkek üreme7,8,9ve sperm kalitesini değerlendirmek için yararlı bir parametre kabul ettiğiniz anlamına gelir. Çeşitli floresan teknikler acrosome bütünlüğü, FITC-PNA uygulamasına ait veya FITC-PSA8,10doğrulaması için uygundur. FITC-PSA boyama1,3, kalıpları kullanarak bizim önceki çalışmalarda biz sağlam acrosome doğru tanımları (ı) için sağlanan (II) zarar acrosome membran ve (iii) acrosome tepki gösterdi. Geçerli rapordaki sperm adanmış akış sitometresi kullanarak acrosome durumunu değerlendirmek ve bu floresans mikroskobu kullanarak sonuçları karşılaştırın.
Mitokondri çok fonksiyonlu organelleri, diğer şeyler, ATP sentezi, reaktif oksijen türleri üretim, kalsiyum sinyal ve Apoptozis arasında yer vardır. Fizyolojik işlev bozuklukları, kısırlık, erkek ve kadın da dahil olmak üzere değiştirilmiş mitokondriyal işlev11ile ilişkilidir. Sperm mitokondri midpiece içinde düzenlenir ve sperm hareketliliği12' çok önemli bir rol oynamaktadır. İyi yüksek mitokondri zar potansiyel (ΔΨm) yüksek fertilizasyon kapasitesi13ve normal hareket ile ilişkili olduğunu kabul edilir. Buna ek olarak, düşük ΔΨm reaktif oksijen türleri yükseltilmiş bir düzeyiyle ilişkilidir ve döllenme oranı14düşük. Yine de, çeşitli çevresel bileşenleri, örneğin Endokrin bozucular, hücresel stres teşvik ve ΔΨm, hyperpolarization1,3, artan üretim serbest radikallerin ve sonunda geçici bir artış yol, Apoptozis15. Floresan sonda 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1) sağlar örneğin, sperm ΔΨm1,3gıda kaynaklı toksinler etkilerini inceleyerek.
Standart spermiograms fizyolojik ve morfolojik parametreleri temel alınarak, sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değildir. Daha doğru yöntemleri sperm kalitesini sağlamak için gereklidir. Burada, sperm membran değerlendirme üzerinde dayalı sperm kalitesini belirlemek için kullanabileceğiniz iki uygun yöntem sağlamak: aynı anda dört kişilik belirli floresan problar ve bizim çalışmalar1,3 ' te açıklanan floresans mikroskobu ile boyama ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi, son zamanlarda kullanılan bizim laboratuvar ve başkaları tarafından zaten kullanılmakta16,17,18.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [3-N-morfilino propansülfonik asit]</td> <td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Neubauer Almanya</td><td></td><td>hemositometre</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>floresan probu</td></tr><tr><td>PI (propidyum iyodür</td>)<td>Sigma</td><td>P4170</td><td>floresan probu</td></tr><tr><td>FITC-PSA (floresein izotiyosiyanat konjuge Pisum sativum aglütini)</td><td>Sigma</td><td>L0770</td><td>floresan probu</td></tr><tr><td>JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetra-kloro-1,1', 3,3'-tetraetilbenzimidazolil karbosiyanin iyodür)</td> <td>ENZOBiochem, New York, NY, ABD</td><td>ENZ52304</td><td>floresan probu</td></tr><tr><td>Annexin V, FITC MACS ile konjuge edilmiş</td><td>, Miltenyi Biotec</td><td>130-093-060</td><td>floresan probu</td></tr><tr><td>Annexin V bağlama tamponu 20x stok çözeltisi</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-092-820</td><td>tampon</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td><td>Nikon, Tokyo, Japonya</td><td></td><td>ters floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Nis Elements</td><td>Nikon, Tokyo, Japonya</td><td></td><td>yazılım</td></tr><tr><td>Nikon DXM1200F</td><td>Nikon, Tokyo, Japonya</td><td></td><td>dijital fotoğraf makinesi</td></tr><tr><td>Guava EasyCyte Plus</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Fransa</td><td></td><td>mikrokılcal sperm akış sitometresi</td></tr><tr><td>CytoSoft</td><td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, ABD; IMV Technologies</td><td></td><td>yazılımı</td>tarafından dağıtılmaktadır</tr><tr><td>Sitometri için tamponlu çözüm</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Fransa</td><td>023862</td><td>tamponu</td></tr><tr><td>Canlılık ve konsantrasyon kiti</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Fransa</td><td>Canlılık</td><td>değerlendirmesi için 024708 kiti</td></tr><tr><td>Mitokondriyal aktivite kiti</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Fransa</td><td>Mitokondriyal</td><td>aktivite için 024864 kiti değerlendirme</td></tr><tr><td>Canlılık ve akrozom bütünlük kiti</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Fransa</td><td>akrozom bütünlüğü değerlendirmesi için</td><td>025293</td> kiti</tr><tr><td>JMP-13</td><td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, ABD</td><td></td><td>yazılımı</td></tr><tr><td>Sığır spermi</td> <td>"SION", İsrailli suni tohumlama ve dreeding şirketi, Hafetz-Haim, İsrail</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorimetric teknikleri sperm membran değerlendirilmesi için

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standart spermiograms sperm kalitesini açıklayan çoğunlukla ejakülat hacmi ve konsantrasyonu, hareketliliği ve ilerici hareketliliği ve sperm morfolojisi ve canlılık gibi fizyolojik ve görsel parametreleri temel alır. Ancak, bu değerlendirmeler sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değil. Sperm canlılığı ve döllenme potansiyel bakım membran bütünlüğü ve hücre içi işlevine bağlıdır göz önüne alındığında, bu parametrelerin değerlendirilmesi daha iyi bir tahmin sperm fertilizasyon yeterlilik etkinleştirmek. Burada, floresan mikroskopi veya akış sitometresi analizleri ile birlikte belirli floresan problar kullanarak sperm kalitesini değerlendirmek için üç uygun yöntemleri açıklanmaktadır. Analizleri değerlendirildi plazma membran bütünlüğü (DAPI) 4', 6-diamidino-2-phenylindole kullanarak ve propidium iyodür (PI), acrosomal membran bütünlüğü floresein isothiocyanate Birleşik kullanarak Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) ve Mitokondrial membran bütünlüğü kullanarak 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1). Bu yöntemler kombinasyonları da sunulmaktadır. Örneğin, V annexin kullanım apoptosis değerlendirilmesi ve apoptotik sperm (apoptotik dizin) oranı hesaplama PI fluorochromes sağlar ile birlikte. Spermatozoon membranlar inceleyerek üzerinde temel alır, bu metodolojileri sperm kalitesinin değerlendirilmesi için çok yararlı olduğuna inanıyoruz.

Şekil 1 gösterir aynı anda fluorimetric sperm membran (plazma, acrosomal ve mitokondrial) değerlendirilmesi PI, DAPI, FITC-PSA ve JC-1 kullanarak. Aynı anda dört floresan problar ile boyama kullanarak sperm membran değerlendirmesini sağlar, örneğin, her kategoride sperm oranı değerlendirilmesi — canlı ölü vs ; yüksek ve düşük ΔΨm; sağlam vs. acrosome zarar — aynı anda her spermatozoon için.
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

Burada, metodolojileri spermatozoan membran bütünlüğü, sperm fertilizasyon yetki ile ilişkili bir hücresel özellik değerlendirmek için mevcut. Biz sperm membran fluorimetric değerlendirilmesi için üç teknikler tarif: eşzamanlı belirli floresan problar, floresans mikroskobu ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi ile boyama. Örnek yöntemleri birleştirerek da sunulmaktadır.

Fluorimetric teknikleri Sperm membran değerlendirilmesi için

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Bu işlemlerin amacı, floresan mikroskopi veya akış sitometri analizi ile birlikte spesifik floresan problar kullanarak sperm zarlarının bütünlüğünü değerlendirmektir. Bu teknikler, üreme alanındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir, örneğin döllenme potansiyelinin tahmini ve sperm numunesinin kalitesi gibi. Bu tekniklerin en büyük avantajı, sperm döllenme potansiyeli ile ilişkilendirdiği bilinen birden fazla sperm zarının hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlamaktır.Bu tekniklerin etkileri, sperm plazması ve akrozom membran bütünlüğünün ve mitokondriyal membran potansiyelinin daha doğru değerlendirilmesini sağladığı için boşalma kalitesinin tanısına doğru uzanır. Bu prosedüre başlamak için, oda sıcaklığında 15 mililitrelik bir tüp içinde yaklaşık 1-6 mililitre boğa meni elde edin. Her bir mililitre meniye 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış altı mililitre NKM tampon ekleyin.8 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. Santrifüj, süpernatant temizolana kadar bir veya iki kez tekrarlayın. Bundan sonra, hemen pelet üzerinde supernatant yaklaşık bir santimetre bırakarak, supernatant en atın.Tüpleri kuvözde 30 derecelik bir açıyla dikkatlice yaslayın ve spermatozoanın yüzmesini sağlamak için 20 ila 30 dakika bekleyin. Bir mikropipet kullanarak, dikkatle şimdi hareketli spermatozoa içeren supernatant kalan bir mililitre kaldırmak ve taze bir 1.5 mililitretüp aktarın. Kullanıma hazır olana kadar spermi 37 derecede tutun.İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm stok çözümlerini hazırlayın. Daha sonra, 133 mikrolitre hareketli spermatozoa mililitre başına 25 milyon sperm konsantrasyonu ile yeni bir 1.5 mililitretüp aktarın. DAPI çalışma çözeltisi 17 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.Santrifüj 1,000 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve pelet nkm tampon 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, 50 mikrolitre FITC-PSA, iki mikrolitre JC-1 ve üç mikrolitre PI ekleyin. 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yat.Santrifüj 1,000 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve NKM tampon 40 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra numunenin 10 mikrolitresini cam bir slayta aktarın.Örneği smear ve bir coverslip ekleyin. Bundan sonra, her filtre için ayrı bir görüntü yakalamak için bir dijital kamera kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi 40X objektif ve üçlü filtre ile epifloresan mikroskobu ile örneği görselleştirmeye hemen başlayın. Filtrelerden alınan üç görüntüyü birleştirmek ve yeni dosyayı JPEG biçiminde kaydetmek için kamera yazılımındaki birleştirme seçeneğini kullanın.Birleştirilmiş görüntüyü boya aletiyle açın ve sayılan spermatozoayı işaretlemek için fırça seçeneğini kullanın. Daha sonra, spermatozoa'yı her probdan yayılan floresan göre sınıflandırın ve slayt başına en az 200 spermatozoa değerlendirin. Tüm hücreler DAPI'den mavi görünmelidir.Canlılığı değerlendirmek için mor görünen ölü hücreleri sayın. Daha sonra akrozom durumunu değerlendirmek için floresan boyama desenleri kullanın. Son olarak, yeşil lekeli bir orta parçası sergileyen düşük mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoadan kırmızı lekeli bir orta parça sergileyen yüksek mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoayı ayırt ederek mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirin.Kırmızı ve yeşil midleri ayrı ayrı sayın ve oranlarını hesaplayın. Plazma membran bütünlüğü değerlendirmesine başlamak için, canlılık ve konsantrasyon kitinden istenilen sayıda kuyu alın. Kuyuları çalışma tabanına aktarın ve ışıktan korumak için onları esnek bir kapakla kapatın.Her kuyuya sitometri için 199 mikrolitre arabellekli çözelti ekleyin. Daha sonra her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda bir mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenize edin. Kapağı kapağı ile kapak ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.Bundan sonra, canlılık ayarını kullanarak numuneyi akış sitometresi üzerinden çalıştırın. Mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmeye başlamak için mitokondriyal aktivite kitinden istenilen sayıda kuyu alın. Onları çalışma üssüne aktarın.Her kuyuya 10 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve kuyunun içindeki tozu yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Kuyu başına 190 mikrolitre PBS ekleyin ve pipetleme ile homojenize. Her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda 0,75 mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenleştirin.Kapağı kapağı ile kapak ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bundan sonra, mitokondriyal aktivite ayarını kullanarak numuneyi akış sitometresinde çalıştırın. Akzonomal membran bütünlüğünü değerlendirmeye başlamak için, canlılık ve akrozom bütünlük kitinden istenilen sayıda kuyu çıkarın.Kuyuları çalışma tabanına aktarın ve ışıktan korumak için onları esnek bir kapakla kapatın. Her kuyuya sitometri için 200 mikrolitre arabellekli çözelti ekleyin. Daha sonra her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda 0,7 mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenize edin.Kapağı kapağı ile kapak ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bundan sonra, içgörü ayarını kullanarak örneği akış sitometresi üzerinden çalıştırın. Bu çalışmada meni kalitesi farklı teknikler kullanılarak değerlendirilmekte olup, bunlardan biri florometrik problar kullanılarak sperm membranları değerlendirilmiştir.Sperm numunesi kalitesindeki farklılıkları membran bütünlüğü açısından değerlendirmek mümkündür. Örneğin, yedi numaralı boğanın boşalması ölü hücrelerin nispeten düşük bir yüzdesine, psödo-tepkili akrozom ile sperm düşük bir oranda ve boğa bir numaralı boşalma ile karşılaştırıldığında daha yüksek mitokondriyal membran potansiyeli vardı. Örnekler daha sonra canlılık ve mitokondriyal aktivite açısından değerlendirilir.Bu temsili örnekler için histogramlar ungated spermatozoa ve enkaz ve kapılı spermatozoa temsil eder. Bu histogramlar aynı zamanda canlı ve ölü hücreleri ve polarize ve polarize mitokondriyal membran spermatozoa dağılımını temsil eder. Daha sonra akrozom bütünlüğü kullanıma hazır bir kit ile değerlendirilir ve akış sitometrisi ile okunur, alanı, bozulmamış lekesiz akrozom, akrozomun artık lekeli kısmı olan düşük floresan hücreleri ve bozulmuş akrozomlu hücreleri ile ihmal edilebilir düşük floresan hücreleri temsil eden üç marker alana bölünür.Bu prosedürleri çalışırken, doğru ilk sperm örneği hazırlamak için emin olmak önemlidir. Bu teknikler sperm kalitesi değerlendirmesi hakkında bilgi sağlayabilir ve büyükbaş, kümes hayvanları ve insan gibi çeşitli organizmalara uygulanabilir. Bu iki teknik arasında yapılan karşılaştırmada, dörtlü boyama ve akış sitometrisi canlılık, mitokondriyal membran potansiyeli ve akrozom bütünlüğü açısından anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir.

fluorimetric-techniques-for-the-assessment-of-sperm-membranes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video-makale, semen örneği nasıl işleneceğini, iyi kalite floresan elde etmek için adım adım...

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Yumurta ve yumurta etrafında ekstrasellüler kaplamaları sık sık böylece döllenme teşvik yumurta sperm ile iletişim kurmak için onlara rehberlik etmek, peptidler, proteinler ve küçük moleküllerin bırakın. Kurbağa sperm sperm birikimi testleri ve sperm izleme testleri - sperm chemoattraction algılamak için kullanılan iki sınıf testleri tanımlamak ve karşılaştırmak.

İki Kurbağa Sperm Chemoattraction saptamak için Tahliller Türleri

Bu videoda, deterjan çözünmesini takiben Escherichia coli'de yeşil floresan proteini (GFP) ile kaynaşmış membran proteini stabilitesini taramak için bir floresan algılama boyut dışlama kromatografisi tekniği gösteriyoruz. Boyut dışlama profilinde çok az veya hiç serbest GFP ile simetrik bir tepe sergileyen proteinler, daha sonra yapı-fonksiyon analizi için seçilebilen, minimum bozunma ve agregasyon ile saflaştırılmış proteinleri gösterir.

Floresan Algılama Boyut Dışlama Kromatografisi: Deterjan Çözündürmesi Üzerine Floresan Membran Proteinlerinin Bütünlüğünü Belirleme Tekniği

Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Burada, iki orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm olarak açıklanmıştır. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için büyük miktarda hızlı ve kolay bir ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon.

Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Mevcut protokol, insan sperminde apoptozis, mitokondriyal membran potansiyeli ve DNA hasarının tek bir sitometre ile ölçülmesine olanak sağlayan pratik bir çözüm sunmaktadır.

İnsan Sperm Fonksiyonel Kusurlarını Tespit Etmek için Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Germ hattı toksisitesini değerlendirmek için kullanılan nematod Caenorhabditis elegans'ta yüksek verimli bir kimyasal testin ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Bu tahlilde, kimyasal maruziyeti takiben germ hattı fonksiyonunun bozulması, anöploid embriyolara özgü bir floresan raportör kullanılarak izlenir.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Öğrenin, floresan prob ve akış sitometri kullanarak sperm membran bütünlüğünü değerlendirmek için. Bu yöntemler, döllenme potansiyeli tahmini ve meni kalitesi analizinde araştırmacılara kesin sonuçlar sunar.

Fluorimetric teknikleri Sperm membran değerlendirilmesi için

Daha fazla video keşfet