Name: 3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Öğrenin, 3D dinamik kültür sistemi kullanarak mezenkimal kök hücrelerden çok katmanlı hücre levhası inşa etme yöntemini. Bu teknik besin desteğini artırarak hücre fonksiyonunu ve tedavi etkinliğini iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından (grant numarası 31771064); desteklenmiştir Bilim ve teknoloji planlama projesi, Guangdong Eyaleti (grant numaraları 2013B010404030, 2014A010105029 ve 2016A020214012); Bilim ve teknoloji planlama proje Guangzhou (grant numarası 201607010063); ve lisans yenilik ve Girişimcilik Eğitim programı (grant numarası 201610559028); Ulusal Bilim Vakfı (sayı 31800819 vermek) Çin genç bilim adamları için.

Tüm kök hücre ve hayvan deney yordamlar bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının Ulusal Kılavuzu etik kurallarına göre yürütülen ve Jinan Üniversitesi hayvan bakım ve kullanım Komitesi (Guangzhou, Çin Halk Cumhuriyeti) tarafından onaylanmış.
1. hazırlanması PLA2 Decellularization ile DPP iskele yöntemi14
Not: PLA2 decellularization yönteminin şematik için Şekil 1A ' ya bakınız.
<ol><li>100 mL 200 U/mL PLA2 çözeltisi hazırlamak. 0.5 g sodyum deoxycholate ve PLA2 2 mL 198 mL karbonat tampon çözeltisi ekleyin. Bu çözüm onun hazırlık sonra 24 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
	<li>Taze domuz kalp zarını (FPP) mezbaha elde etmek ve Laboratuvar 1 saat içinde geri dönün. Not: FPP taşıma sırasında 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Adımları 1.2-1,10 sürekli bir termostat kontrollü su banyosunda sallayarak ile yapılmalıdır.</li>
	<li>Bu adım 2 x 200 mL % 1 penisilin-streptomisin 10 ° Cfor 10 dk., bir 500 mL ölçek içeren fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile FPP tekrar iyice yıkayın.</li>
	<li>FPP iki katmanlara bölmek ve yağ dokusu forseps ve makas ile kaldırın. Not: PBS 50 mL ekleyerek ıslak FPP yağ dokusu kaldırma sırasında her 20 dk devam et.</li>
	<li>FPP 10 x 10 cm2 adet makasla şekil. FPP %200 1 penisilin-streptomisin bir 500 mL ölçek 10 ° C'de 10 dk. yinelemek için bu adım 2 x içeren mL karbonat tampon çözeltisi (CBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Saf su için FPP aktarmak ve 12 h için 10 ° C'de ıslatın.</li>
	<li>10 x 10 cm2 örnekleri 50 ml 200 U/mL PLA2 ve 6 h için 37 ° C'de % 0,5 (w/v) sodyum deoxycholate çözüm içeren CBS emmek.</li>
	<li>Örnekleri bu adım 2 x %1 penisilin-streptomisin için 10 dk. tekrar 10 ° C'de içeren CBS ile yıkayın.</li>
	<li>CBS 200 U/mL PLA2 ve 2 h 37 ° C'de % 0,5 (w/v) sodyum deoxycholate çözüm içeren 50 ml her örnek emmek.</li>
	<li>Örnekleri % 1 penisilin-streptomisin 2 h. tekrarlamak için 10 ° C'de içeren CBS ile 10 x için bu adım en azından yıka. Örnekleri üzerinde düz tabak yerleştirin ve kuru onları sabit sıcaklık fırın 55 ° C'de sabit ağırlık Not: Örnek tamamen kurumuş gerekiyor. DPP örnek her 10 min tartmak ve tekrar 3 x veya ağırlığı kadar artık değiştirir.</li>
	<li>Her DPP örnek bir trephine ile 10.5 mm çaplı daire şekli. Her DPP içinde steril mühürlü çantanı hazırla.</li>
	<li>DPP örnekleri gama ışınlama (25 kGy) tarafından sterilize. DPP örnekler kullanmadan önce 4 ° C'de depolanan. Not: Tüm örnekleri 4 ° C'de altı aya kadar saklanabilir</li>
</ol>2. hücre hazırlıkları inşaat sac
<ol><li>Otoklav siyah üsleri (doku taşıyıcı bileşeni) ve beyaz gerilim halkaları (doku taşıyıcı bileşeni) 30 min 1,5 mL santrifüj tüpleri, forseps, dahil olmak üzere, pens, makas, dişli için tüm aletleri ve doku taşıyıcı bileşenleri 121 ° C'de.</li>
	<li>20 mL döl-özgür % 10 sükroz çözeltisi hazırlamak. Sukroz 2 g ağırlık ve Ultrasaf Su 18 ml sukroz geçiyoruz. Otoklav 30 dk veya 0,22 µm filtre ile filtre çözümü için 121 ° C'de % 10 sükroz çözüm.</li>
	<li>Otoklav dinamik perfüzyon sistemi aygıtlarını 121 ° C'de 30 dk, bir gaz da dahil olmak üzere Döviz ekipman, 500 mL Cam şişe, bir perfüzyon kültür kapsayıcı ve bağ tüpleri.</li>
	<li>Autoclaved aletleri ve doku taşıyıcı bileşenleri hazırlayın. Siyah taban parçası doku taşıyıcı bir kültür tabak koyun.</li>
	<li>Kurutulmuş bir DPP iskele toplar ve siyah Bankası Merkezi'nde koyardım. Bir beyaz gerginlik yüzük DPP iskele üzerinde koymak ve doku taşıyıcıya düzeltebilirim. Not: iskele doku taşıyıcıya tamamen sabit ve siyah taban ve beyaz gerginlik halka arasında boşluk yok olun. Eğer değilse, doku taşıyıcı ayrı ve iskele tekrar düzeltmek.</li>
	<li>Rehidrasyon DPP iskele üzerinde 100 µL kültür ortamının ekleyin. Not: iskele de doku taşıyıcıya düzeltilmemişse, kültür orta kültür çanak sızmak.</li>
	<li>İskele 37 ° C kuluçka koy ve 15dk için emmek sağlar.</li>
</ol>3. hücre sayfa yapımı için hücreleri hazırlanması
Not: Bu 100 mm tabak hücre kültürü için protokolüdür. Şekil 1B inşaat çok katmanlı hücre yapısının şematik için bkz.
<ol><li>BMSCs13yalıtmak. Not: Bu yöntem bir çok katmanlı MSC cep sayfası oluşturmak için tasarlanmıştır. Sıçan BMSCs bu protokol için kullanılır. BMSCs bütün kemik iliği yapisan yöntemle izole edilmiştir ve BMSCs genişletilmiş vitro hücre yeteri kadar elde etmek için vardır.<ol>
<li>Otoklav 121 ° C'de aletleri forseps, dişli forseps ve makas gibi 30 dk için. 2 mL enjeksiyon şırınga ve BMSC Kültür (değiştirilmiş Dulbecco'nın kartal orta [DMEM], % 10 fetal Sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin) orta hazırlayın.</li>
		<li>3-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley (SD) rats servikal omur çıkığı tarafından ötenazi. 100 mL % 75 alkol çözeltisi 5 min için bir ölçek içinde hayvan emmek.</li>
		<li>Hayvan kabı dışına alıp eğilimli işlemi masaya yerleştirin. Arkadaki hayvan cilt makas ve forseps ile deşmek. Kalça kemiklerine ortaya çıkarmak için cilt ve kas dokuları yalıtmak.</li>
		<li>Kalça kemiklerine yalıtmak ve PBS 30 mL 50 mL santrifüj tüpü içinde koydu. İki kalça kemiklerine bir tüpün içine yerleştirin. Girdap santrifüj tüpü doku iyice yıkayın. 2 x bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Her iki ucunda da kemiklerine makasla kesmek ve iliği kavite bulaşmasına neden.</li>
		<li>BMSC kültür orta 2 mL enjeksiyon şırınga ile Aspire edin. İğne iliği boşluğa yerleştirmek ve kültür orta ile kemik iliği dışarı floş. Her iki kalça kemiklerine bir 100 mm Kültür çanak içine dışarı floş.</li>
		<li>Her 100 mm Kültür yemeğin için kültür orta 2 mL kültür tabakta ekleyin. 37 ° C kuluçka ve 72 h için statik kültür kültür tabak koyun.</li>
		<li>Kültür bulaşık kuluçka makinesi üzerinden dışarı çıkar. Süpernatant ile 6 mL taze kültür orta yerine.</li>
		<li>Mikroskop altında birincil BMSCs gözlemlemek. Bunu, her 5-7 d BMSCs geçiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuluçka makinesi hücreleri al. Hücreler mikroskopla gözlemlemek ve hücre sayfa yapımı için uygun hücreleri seçin. BMSCs % 80 - % 90 izdiham ulaştığınızda, hücreleri numaralı seribaşı hücreler olarak seçilebilir.</li>
	<li>Kültür orta kültür çanak kaldırın. Yavaşça 2 mL sıcak PBS hücrelerle yıkayın. Tüm PBS kültür çanak kaldırmak ve yapmak emin Hayır sıvı kalır. Yemek için 2 mL % 0.25 tripsin (veya başka bir dissociating çözüm) ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Tripsin etkisi kültür orta 2 mL ekleyerek durdurmak ve yavaşça çanak hücrelerden yıkayın. Hücre süspansiyon yeni 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Centrifugate hücreleri 225 x g 5 min için de.</li>
	<li>Süpernatant kaldırın. 3 mL % 10 (w/v) sükroz çözeltisi içeren hücreleri resuspend. Not: % 10 (w/v) sükroz çözüm hücreleri yıkamak için aşağıdaki adımlarda bir tek tip hücre-hidrojel karışım elde etmek için kullanılır.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 10 µL Aspire edin ve hücre ile bir hemasitometre saymak. Bir sonraki adım için gerekli hacim hesaplamak. Bir hücre tablo için üç milyon BMSCs kullanılır.</li>
	<li>Üç milyon hücreleri ayıklamak ve bir yeni 15 mL santrifüj tüpüne aktarabilirsiniz. Senaryo Özeti 225 x g 5 min için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırın. 1 mL % 10 (w/v) sükroz çözeltisi içeren hücreleri resuspend. Hücre süspansiyon bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Not: 1,5 mL santrifüj tüpü kullanarak hücre hidrojel karışım hazırlamak için faydalıdır.</li>
	<li>5 dk. tamamen süpernatant kaldırmak ve hücre tortu elde etmek için 260 xg de hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
</ol>4. BMSCs ve RAD16 hazırlanması-ben peptid hidrojel karışımı
Not: Şekil 1B inşaat çok katmanlı hücre yapısının şematik için bkz.
<ol><li>20 µL % 10 (w/v) sükroz çözüm 1.5 mL santrifüj tüpü ekleyin. Yavaşça BMSCs resuspend ve bir tek tip süspansiyon elde edilir. Not: herhangi bir kabarcıklar resuspension sırasında oluşturmaz.</li>
	<li>RAD16 20 µL eklemek-Ben peptid hidrojel süspansiyon üstündeki. Hafifçe karıştırın RAD16-ben peptid ve hücre süspansiyon pipet ucu. Yavaşça hücre süspansiyon ve hidrojel birlikte karıştığında, karışımı bir kaç kez pipette.</li>
	<li>Doku gemisinden DPP iskele al ve yavaşça kültür orta bir pipet ucu ile Aspire edin. Not: DPP iskele tam olarak hücre hidrojel karışımı eklemeden önce rehydrated olun.</li>
	<li>Karışım Aspire edin ve eşit DPP iskele ekleyin. Not: Karışım hacmi hakkında olurdu 40-50 µL. Bu karışımı 10 µL teker teker ortadan itibaren iskele dışa doğru eklemek için tavsiye edilir.</li>
	<li>1 mL kültür ortamının doku taşıyıcı altýna ekleyin. 37 ° C kuluçka 5 min için hücre levha koymak.</li>
	<li>Kuluçka makinesi hücre sayfasından çıkar. Yavaşça kültür orta 4 mL kültür çanak ekleyin ve hücre sayfası bırakın. Statik kültür 2 h 37 ° C kuluçka hücre levha koymak.</li>
</ol>5. bir dinamik kültür sistemi kullanarak 3D çok katmanlı hücre sayfasının Vitro kültür
Not: Şekil 1 c 3D dinamik sistem bir şematik için bkz.
<ol><li>Peristaltik pompa, gaz Satım donanımları, 500 mL Cam şişe, perfüzyon kültür konteyner ve bağ tüpler de dahil olmak üzere dinamik perfüzyon sistemi hazırlamak. Şekil 2' de gösterildii gibi dinamik perfüzyon sistemi monte.</li>
	<li>Kültür orta 200 mL steril cam şişe ekleyin. Hücre kültür konteyner odanın içine yerleştirin. Not: üst yüzey hücre sayfasının yönüne dikkat edin.</li>
	<li>Kültür orta 3 mL doku kapsayıcı içinde ekleyin ve konteyner kapatın. Dinamik perfüzyon sistemi da kuluçka makinesine koy ve pompa başlar. Peristaltik pompa debisi kültür 8 mL/dak. 48 h için dinamik perfüzyon sistemi hücre sayfasında ayarlayın.</li>
</ol>6. çok katmanlı MSC cep sayfası alma
<ol><li>Otoklav doku taşıyıcı bileşenleri için 30 min 1,5 mL santrifüj tüpleri, forseps ve dişli forseps dahil olmak üzere, 121 ° C'de ve aletler.</li>
	<li>Giriş kanalı konteyner kültür ortamına temini durdurmak için cam şişe dışarı çıkarmak. Not: kültür konteyner boş olduğunda peristaltik pompa durdurun.</li>
	<li>Kültür konteyner hücre sayfasından çıkar ve bir kültür tabak koyun.</li>
	<li>Bir forseps doku taşıyıcı hareketsiz başka bir dişli forseps beyaz gerginlik yüzüğü siyah tabanından ayırmak için kullanırsınız. Son olarak, çok katmanlı BMSCs hücre sayfası elde etmek.</li>
	<li>Kısa koruma için her hücre sayfa 1.5 mL santrifüj tüpü forseps ile transfer edilebilir. DPP iskele santrifüj tüpü iç duvarına bitişik ve hücre levha yayıldı out santrifüj tüpü mümkün olduğu kadar.</li>
	<li>Yavaşça kültür orta 1 mL hücre sayfası sokmak için santrifüj tüpü ekleyin. Santrifüj tüpü kapağı kapatın ve hücre sayfa 4 ° C'de depolayın Not: Hücre sayfası nakledilen veya en kısa zamanda analiz gerekir. Bu 4 h hücre sayfasında kullanmak için tavsiye edilir.</li>
</ol>

<ol><li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li>
<li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li>
<li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li>
<li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li>
<li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li>
<li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+novel+PLGA+fiber%2Fcollagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li>
<li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li>
<li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li>
<li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen%2Felastin%2Fpolycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li>
<li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phospholipase+A%282%29+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li>
<li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li>
<li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li>
<li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li>
<li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li>
<li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut iletişim kuralı çok katmanlı bir MSC sayfası oluşturmak için verimli bir yöntem bildirir. Bu hücre sayfasını en iyi mekanik güç, yüksek hücre tohumlama yoğunluğu ve olumlu kök hücre bioactivity sergiler. BMSCs örnek olarak kullanarak, 3D hücre yapısı hızlı bir şekilde RAD16 ile inşa edilmiştir-Ben peptid hidrojel. Dinamik perfüzyon sistemi kültürlü sonra çok katmanlı BMSC sayfası başarıyla alındı ve kök hücre işaretlerinin yüksek bir ifade BMSCs korumak.
Geçici çok katmanlı hücre yapısı...

Kök hücre tedavisi birçok hastalık için etkili bir tedavi olarak bildirilmiştir; Ancak, düşük hücre saklama ve hedef bölge içinde yoksul hayatta kalma kritik konularda geleneksel kök hücre enjeksiyon takip kalır. Bu sorunu çözmek için doku mühendisliği bilim adamları hücre sayfası tekniği geliştirdi. Monolayered hücre sabıkası olduğu gibi hücre dışı matriks ile öncelikle sıcaklık-yanıt kültür çanak1kullanılarak hazırlanan ve kök hücre saklama ve hayatta kalma hazır içinde önemli gelişmeler takip çalışmalarına bildirdi alan2,3. Yöntemler arasında çok katmanlı hücre sayfası oluşturmak hücre hayatta kalma ve hücre sayfası tedavi etkisi3,4geliştirmek için etkili bir strateji olarak bildirilmiştir. O zamandan beri bilim adamları hücre miktarı, kök hücre özellik ve mekanik özelliği hücre yaprak artırmak için farklı hücre sayfası inşaat yöntemler geliştirilmesi üzerinde çalıştı. Şimdiye kadar hücre sayfasının belirli türleri inşa ve miyokard infarktüsü5, kıkırdak hasarı6, tedavisinde okudu ve7cilt yara.
Bioactivity kök hücre nakli önce yaralı doku rejenerasyonu ortaya çıkan bir etkisi gösterdi ve farklı hücre sayfası inşaat stratejileri kök hücreler üzerinde farklı etkileri vardır. Bir yandan konfluent hücre sayfaları yalnızca yüksek yoğunluklu kök hücrelerinin oluşuyordu ve doğal hücre dışı matrisler yığın monolayered hücre sayfaları8 veya manyetik doku mühendisliği teknikleri9kullanarak elde edilebilir. Öte yandan, geliştirilen araştırmacılar yeterli mekanik mukavemeti sağlamak ve düşük bir kök hücre yoğunluk beslenme sağlamak için tohum verilen hücre büyüme10,11,12, destek için farklı iskele kaynağı. Ancak, bu yaklaşımlardan rağmen düşük verimli beslenme kaynağı çok katmanlı hücre sayfa yapısı içinde önemli bir endişe vitro inşaat sırasında kalır. Bu nedenle, bir verimli ve uygun hücre sayfası yapı sistemi şiddetle ihtiyaç var.
Bu iletişim kuralı bir multilayeredmesenchymal kök hücre (MSC) hücre sayfası hazırlamak için adımları açıklar. Bu yapı sistemi, hücre sayfası mekanik mukavemeti DPP tarafından sağlanır. Bu iskele üzerinde bağlı olarak, 3D hücre yapısı hızlı bir şekilde RAD16 ile inşa edilebilir-ben peptid hidrojel ve dinamik perfüzyon sistemi 3D hücre sayfa yapısı stabilize ve yeterli beslenme sağlamak için çok katmanlı hücre levha, kültür için kullanılır hücreleri için kaynağı. Bu sistemi kullanarak, bir çok katmanlı BMSC sayfa başarılı bir şekilde hazırlanan ve sıçan miyokard infarktüsü modeli13üzerinde en uygun tedavi edici etkisi sergilenmektedir.

<table><tbody><tr><td>Fosfolipaz A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6534</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponu</td><td>Gibco BRL</td><td>89033</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin / amfoterisin ve nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>15640055</td><td></td></tr><tr><td>Tampon bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Masa yoğunlaştırıcı</td><td>Changzhou Aohua Instrument Co.</td><td></td><td></td>KT20183</tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Corning Cellgro</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Güney Amerika fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>10270-106 / P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr>% <tr><td>0.25 Tripsin / 2.21 mM EDTA</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik kabini</td><td>Esco, Singapur</td><td>AC2-2S1</td><td></td></tr><tr><td>Sabit sıcaklık inkübatörü ve nbsp;</td><td>Esco, Singapur</td><td>CLS-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü ve nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>EP tüp</td><td>Axygen</td><td>31617934</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj makinesi</td><td>TOMOS</td><td>1-16R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pura Matrisi&nbsp;</td><td>BD</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Dinamik perfüzyon kültür sistemi</td><td>Minucells ve Minutissue</td><td>D-93077</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Ismatec</td><td>IPC N8</td><td></td></tr><tr><td>Pompa hortumu</td><td>Ismatec</td><td>Nr.1306</td><td></td></tr><tr><td>MINUSHEET 1300&nbsp;</td><td>Regensburg</td><td></td><td>doku taşıyıcı bileşenleri&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET</td><td>Regensburg</td><td></td><td>dinamik perfüzyon sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0006</td><td>Regensburg</td><td></td><td>gaz değişim ekipmanları&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0002</td><td>Regensburg</td><td></td><td>500 mL cam şişe&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 1301</td><td></td><td></td><td>perfüzyon kültür kabı&nbsp;</td></tr></tbody></table>

3d dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Kök hücre tedavisi bir umut verici yaralanan organ ve doku Yenileyici gelecekteki gösterir ve hücre sayfası teknik düşük hücre saklama ve hedef bölge içinde yoksul hayatta kalma artırmak için geliştirilmiştir. Ancak, vitro İnşaat sürecinde acilen kök hücre bioactivity bakımı ve hücre sayfası içinde hücre miktarı artan bir çözüm gerekir. Burada, bu protokole uygun kök hücre bioactivity ve en uygun kullanım ile bir çok katmanlı hücre sayfası oluşturmak için bir yöntem sunuyor. Decellularized domuz kalp zarını (DPP)2 (PLA2) decellularization yöntemi olarak hücre sayfası iskele fosfolifaz tarafından hazırlanan ve sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücre (BMSCs) izole ve numaralı seribaşı hücreler olarak genişletilmiş. Geçici çok katmanlı hücre sayfa yapısı RAD16 kullanarak inşa edilmiştir-Ben peptid hidrojel. Son olarak, hücre sayfası üç boyutlu (3D) yapısı stabilize etmek dinamik perfüzyon sistemi ile kültürlü ve 48 saat kültür vitrotakip hücre sayfası alınamadı. Bu iletişim kuralı bir çok katmanlı kök hücre sayfası oluşturmak için verimli ve uygun bir yöntem sağlar ve hücre sayfası bir olumlu kök hücre terapisi ürün olarak gelecekte geliştirilebilir.

Çok katmanlı kök hücre sayfası inşaat şematik resim 1' de gösterilen. Hücre sayfası iskele PLA2 decellularization yöntemi tarafından hazırlanması için ilk adımdır. İskele üzerinde bağlı olarak, geçici 3D hücre yapısı kök hücre RAD16-1 peptid hidrojel ile karışımı ile inşa edilmiştir. Uygun kök hücre bioactivity ve en iyi mekanik gücü ile bir çok katmanlı hücre sayfası elde etmek için hücre sayfası dinamik perfüzyon sisteminde kültürlü. Dinamik besl...

Bu makale uygun kök hücre özelliği ile çok katmanlı kök hücre tabloları oluşturmak için verimli ve uygun bir yöntem sağlar.

3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Kök hücre tedavisi yaygın birçok hastalık için umut verici bir tedavi olarak bildirilmiştir. Ve hücre sayfası teknikleri, hücrenin tutulma ve hedefler içinde hayatta kalma geliştirmek için geliştirilmiştir, çok. Hücre levhaları yapımı sırasında, yetersiz beslenme kaynağı kök hücre nin işlevinin kaybı için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir, ve yetersiz bir kök hücre özelliği nihayet in vivo terapötik etkileri etkileyecektir.Mevcut çok katmanlı kök hücre sac ürün hazırlamak için amacımız, ekibimiz hücreselleştirilmiş polen, perikard ve hücre levha iskele geliştirdi. İskeleye göre çok katmanlı hücre marşı hızlı bir şekilde nonapeptid Hidrojen ile inşa edilecek ve kök hücrenin beslenme kaynağını in vitro sağlamak için dinamik perfüzyon sistemi kullanılır. Kurutulmuş dbp iskele almak ve siyah tabanın merkezine koyun.DBP iskelesi üzerine beyaz bir gerilim halkası koyun ve doku taşıyıcısı yapıştırın. DBP iskelesinin doku taşıyıcısında tamamen sabit olduğundan emin olun. DBP iskeleüzerinde 100 mikrolitre kültür ortamları ekleyin.İskeleyi 37 santigrat derecelik kuvöze koyun ve 15 dakika bekletin. Hücreleri kuvözden çıkarın, kültür ortamlarını kültür kabından çıkarın, hücreleri iki mililitre sıcak PBS ile nazikçe yıkayın. Kültür çanaktan tüm PBS çıkarın ve hiçbir sıvı kalır emin olun.Çanak için% 1.25 tripsin çözeltisi için iki mililitre ekleyin ve üç dakika boyunca hücreleri kuluçka. İki mililitre kültür ortamı ekleyerek tripsin etkisini durdurun. Hücreleri yavaşça yıkayın.Hücre süspansiyonlarını yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüple aktarın. Hücreleri 220 kat yer çekiminde beş dakika santrifüj edin ve hücre tortularını elde edin. Süpernatant'ı çıkarın ve hücre tortularını yok edin.Üç mililitre %10 sakaroz çözeltisi ile hücreleri tekrar askıya alın. Aspirate 10 mikrolitre hücre süspansiyon, ve içerik hücre numarası bir hemositometre okur, üç milyon hücre ayıklamak ve yeni 1.5 mililitrelik santrifüj tüp transfer. Hücreleri 220 kez kare kökte beş dakika santrifüj edin, süpernatantları tamamen çıkarın ve hücrelerin tortularını elde edin.20 mikrolitre %10 sakaroz çözeltisi hazırlayın. Hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve tek tip bir süspansiyon elde edin. Süspansiyon üstüne 20 mikrolitre peptid hidro jel ekleyin yavaşça peptid hidro jel karıştırın, ve T ile hücreleri süspansiyon, DBP iskele çıkarmak, doku taşıyıcı bırakarak, ve sonra yavaşça bir T.Aspirate karışımı karışımı ile kalkülüs median aspire ve eşit DBP iskele eklemek.Doku taşıyıcının altına bir mililitre kalsiyum ekleyin. Yavaşça kültür çanak dört mililitre kültürel ortam ekleyin ve daha sonra hücre sayfası ortaya. Hücreleri iki saat boyunca kuvöze koyun.Dinamik perfüzyon sistemi bir perfüzyon kültür konteyner gaz alışverişi recrement ve bir cam şişe içerir. Montajlar, şekil gösterildiği gibi dinamik perfüzyon sistemleridir. Cam şişe iki hidro mililitre kültür medyans ekleyin.Hücre sayfasını kültür kabının odasına yerleştirin, konteynerin içine üç mililitre kültür medyanları ekleyin, dinamik perfüzyon sistemlerini kuvözlere yerleştirin ve pompalamaya başlayın. Bipozitif recumbent kültür konteyner açın. Kültür kabından hücre kağıdını çıkar ve kültür kabına koy.Doku taşıyıcı hareketsiz ve siyah tabanından beyaz gerilim halka ayırmak için başka bir iki forceps kullanmak için bir forceps kullanın. Son olarak, çok katmanlı hücre sayfasını edinin. DBP iskelesi saydamdır.SEM resells kolejler yakalanan ve bileşenleri tamamen ayrılmış olduğunu gösterir. Hücre tabakaları kısa koruma için forseps ile elde edilebilir ve tutulabilir. Bu hücre tabakası 1.5 mililitrelik silindirik tüpe aktarılabilir.Örneğin bir model olarak BMFC's kök hücre marker CD 9O ve CD 29 için son derece pozitif hücre gösterimleri ile başlayan. Hücre yapımından sonra BMFC hücre sayfası bırakarak CD 90 ve CD 29 yüksek genişleme düzeyleri kalır. Çok katmanlı hücre yapısının oluşturulması protokolün kritik adımıdır.Ph değeri SA'dan nötre değiştiğinde tava süresi dört hidro jel gerektirir, bu nedenle, yüzey iyonlarını çıkarmak için hücreyi sakaroz çözeltisi ile yıkamak önemlidir. Ayrıca, hücre süspansiyon ve panthihydrogel hacim oranı geçici çok katmanlı yapısı oluşturmak için iyi bir arkadaş değildir. 3D kök hücre yapısının oluşumundan sonra, dinamik perfüzyon sisteminin çok katmanlı yapının stabilizasyonu ve kök hücre viabilities korumak için önemli olduğunu göreceksiniz.Kültür medyan dinamik infiltrasyon çok katmanlı yapı içinde hücre bağlamında çoğalmak ve ekstrapolate kök hücrelerin kolaylaştırmak da dinamik kültür termometreler farklı kök hücre türlerine göre ayarlanmalıdır.

construction-multilayered-mesenchymal-stem-cell-sheet-with-3d-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Bu video, üç boyutlu bir yapı iskelesi içinde insan nöral kök hücrelerinin gelişimini ve farklılaşmasını göstermektedir. İskele üzerindeki bir laminin kaplama, hücre bağlanmasını teşvik ederken, büyüme faktörü içermeyen bir nöral ortam, süreçlerini gözenekli bir mimari içinde birden çok yöne uzatan ve üç boyutlu bir kültür oluşturan nöral progenitör hücrelere hücre farklılaşmasını...

İnsan Nöronal Kök Hücrelerinin Gözenekli İskele Kullanılarak 3D Kültüre Ayırt Edilmesi

Karmaşık dokunun son derece organize yapılarının oluşturulması için, birden fazla materyal ve hücre tipini entegre bir kompozitte bir araya getirmek gerekir.  Bu kombinatoryal tasarım, güçlü bir fibröz matris tabanı içeren iki farklı biyolojik olarak türetilmiş materyal ve yeni damar oluşumunu arttırmak için endotel hücreleri ile organa özgü katmanlı hücre tabakalarını içerir.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Heterojen hücre popülasyonlarına sahip yük taşıyan dokuların mühendisliği ve analizi hala bir zorluktur. Burada, tek bir yapı içinde çeşitli hücre popülasyonlarının birlikte kültürü için bir platform olarak iki katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi

Burada, nanofibröz membran bazlı iki katmanlı sistemde fibroblastlarla kültürlenen epitel hücrelerinin membrana nasıl stabil bir şekilde yapışabileceğini ve zar üzerinde büyüyebileceğini gösteriyoruz.

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Öğrenin, 3D dinamik kültür sistemi kullanarak mezenkimal kök hücrelerden çok katmanlı hücre levhası inşa etme yöntemini. Bu teknik besin desteğini artırarak hücre fonksiyonunu ve tedavi etkinliğini iyileştirir.

3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Daha fazla video keşfet