Yüksek çözünürlüklü desenli biyofilm ifade kullanarak pDawn-Ag43

Yüzeye ışık tutmak için biyofilm litografisi adı verilen bir yöntem geliştirdik ve bakteriler ışığın olduğu yerde birikti. Bu yöntem, biyofilm araştırmalarında anahtar soruyu yanıtlamamızı sağlayacaktır, örneğin, mekansal yapıların toplum işlevlerini nasıl etkilediği gibi. Bu yöntemin birçok avantajı vardır.

Örneğin, 25 mikrometre çok yüksek çözünürlükte çalışır, yüzey ön desenleme gerektirmez ve aynı zamanda kapalı akışkan cihazlar içinde çalışır. Bu yöntem doğal biyofilmlerin yapı-fonksiyon ilişkisine ışık sağlasa da, biyofilm mühendisliği, biyomalzemeler ve çok hücreli sentetik biyoloji gibi diğer disiplinlere de uygulanabilir. Biyofilm desenleme den önce optik kültür kurulum ve bakteri örneği hazırlamak için önemli ön adımlar olduğu gibi bu yöntemin görsel gösteri önemlidir.

İlk olarak, pDawn-Ag43 plazmidi e.coli suşuna dönüştürün ve plakayı spektinomisin ile desteklenen lb agar plakasına yerleştirin. Bir kültür tüpünde spektinomisin ile LB suyu içine tek bir koloni aşılamak ve 250 rpm ve 37 santigrat derece bir sallayarak kuluçka üstel faza büyümek. Aşılama dan sonra, pDawn-Ag43 bir mililitre karıştırarak dönüştürülmüş suş% 25 gliserol stok hazırlamak 50%steril gliserol bir kriyo-tüp kültür bir mililitre ile.

Stoku eksi 80 derecelik bir dondurucuda saklayın. Daha sonra, biyofilm kültür odasının bağlı olacağı tavana doğrudan yukarı doğru işaret eden diyafram açıklığı ile bakteriyel bir kuvözün altına taşınabilir bir projektör yerleştirerek optik kurulum hazırlamaya başlayın. Ekran kablosu aracılığıyla bir dizüstü bilgisayarı kuvözdeki projektöre bağlayın.

Kuvöz tavanına boş bir kukla kültür çanak eklemek için bant kullanın. Odaklama bileşeğini, odaklama düzleminin kuvöztavana bağlı biyofilm kültür çanağının alt yüzeyine denk gelmesi için odaklama bileyiyi çevirerek odaklamayı ayarlayın. Projektör, kültür çanağının altına keskin, bulanık olmayan bir görüntüyü aydınlatmalıdır.

Projeksiyon optimize edildikten sonra kukla kültür çanağını çıkarın. Dizüstü bilgisayar yazılımını kullanarak, tam mavi bir slayt sunarak tüm görüş alanını maksimum mavi aydınlatmayla aydınlatmak için projektörü yönlendirin. Fotodedektör kafasını kuvöz tavana yerleştirerek ve 460 nanometre ışık dalga boyuna kalibre edilmiş ilgili güç ölçerdeki yoğunluğu okuyarak projektörün aydınlatma yoğunluğunu optik güç ölçer kullanarak ölçün.

Ardından, projektör diyafram ına yerleştirilen ayarlanabilir nötr yoğunluk filtresini kullanarak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Mavi ışık öngörülen bölgenin merkezindeki aydınlatma yoğunluğu santimetre karesi 50 mikrowatt'ı okuyana kadar güç ölçer tarafından ölçülen aydınlatma yoğunluğunu ayarlamak için filtreyi döndürün. İnkübatör tavanına yerleştirilmiş kalibre edilmiş fotodedektör kullanılarak aydınlatma yoğunluğunun uygun bir seviyeye ayarlandığından emin olmak önemlidir.

Bu, nötr yoğunluk filtresini döndürerek aydınlatma yoğunluğunun doğru şekilde alamasına olanak sağlar. Şimdi dizüstü bilgisayarda sunum projektör yazılımı kullanarak keyfi desenler çizin ve projektör kullanarak, kuvöz tavanında bu desenleri görüntülemek. Önce aydınlatma, bir LB-plus-spec agar plaka üzerine gliserol stok bir pDawn-Ag43 zorlanma çizgi.

Kolonilerin bir gecede 37 santigrat derecede büyümesine izin verin. LB-plus-spec suyu bir agar plaka pDawn-Ag43 bakteri bir koloni aşılamak ve 250 rpm ve 37 santigrat derece bir sallayarak kuluçka sabit faza bir gecede kültür büyümek. Ertesi gün, 1,000 LB suyu spectinomycin ile bir oranında kültür subdilute.

Subdiluted kültür geç üstel, erken sabit faza kadar 250 rpm ve 37 derece santigrat altı saat sallayarak kuvöz büyümeye izin verin. Bir gecede kültürü geri seyreltmek ve aydınlatmadan önce geç üstel aşamaya gelmek önemlidir. Bu bakterilerin güvenilir sağlıklı ve indüksiyon üzerine aktif olmasını sağlar.

Kuluçkadan sonra, daha önce hazırlanmış M63 media ile mililitre başına 50 mikrogram-mililitre spektinomisin ile desteklenen 100'e kadar bir oranda geç üstel faz kültürünü seyreltin. Sonra, bir biyofilm kültür çanak içine seyreltme tanıtmak. Numuneler artık aydınlatmaya hazır olduğundan, kültür çanamasını kuvöztavana bantlayarak, yemeğin altındaki yüzeyin projektör tarafından aşağıdan aydınlatma için şeffaf olmasını sağlar.

Biyofilm örneklerinin bir gecede büyümesinden sonra, kültür çanağını kuvözden çıkarın. Çanak, aydınlatıldığı alt yüzeyine biyofilm bakterisi ve yukarıdaki sıvı ortamda dağılmış planktonik bakterilere sahip olacaktır. Kültür çanağı sıvı medya kaldırarak planktonik hücreleri atın.

Daha sonra, pbs yavaşça pipetleme tarafından kalan planktonik hücreleri kaldırmak için PBS ile iki kez yıkın, ardından aspirasyon. Hücreler floresan olarak etiketlenmişse, örnekleri floresan mikroskobu kullanarak doğrudan görüntüleyin. Burada görüldüğü gibi, pDawn-Ag43 bakterilerprojektör aydınlatma ile polistiren kuyu plakaları desenli biyofilmler üretmek için kullanılmıştır.

Biyofilmler, floresan bakteri kullanıyorsa kristal mor boyama veya alternatif olarak floresan mikroskopi ile görselleştirilebilir. Floresan biyofilm örnekleri de 3D biyofilm görüntüleri elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenebilir. Biyofilm örneğine desenli aydınlatma sağlamak için bir film fotomaskesi kullanılarak yüksek çözünürlüklü desenleme mümkündür.

Cam ve PDMS yüzeylerinde desenleme örneklerinin yanı sıra kapalı PDMS kültür odaları burada gösterilmektedir ve pDawn-Ag43 desenlemenin uygulanabileceği farklı ortam türlerini göstermektedir. Bu yordamı çalışırken, ilk ilgi sizin suş içine pDawn-Ag43 dönüştürmek için önemlidir, sonra düzgün odak ve projektör kalibre, ve nihayet aydınlatma için bakteri hazırlamak için gerekli kültür ve geri seyreltme adımları izleyin. Bu yöntemden sonra, biyofilmin farklı kültür koşullarında uzun vadede izlenmesi gibi başka teknikler de kullanılabilir.

Bu şekilde, bir biyofilm yapısının işlevini nasıl etkilediğini anlayabiliriz. Bu teknik, örneğin sentetik biyoloji ve malzeme araştırmaları için, biyofilmleri çeşitli uygulamalara yönelik olarak tasarlamak için yaygın olarak uygulanacaktır.