Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Bu yöntem, retina dokusundaki enerji metabolizması biyolojik örnekler arasında nasıl farklılık gösterir, ya da farmakolojik ajanlara maruz kaldıktan sonra gibi anahtar soruların cevaplatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hem glikoliz oranlarını ölçmek için ekselans organotipik retina doku kullanıyor olması, hem de okside fosforilasyon ve in vitro gerçek zamanlı müdahalelerin değerlendirilmesi sağlar. Ekstrasellüler akı test inamasını kalibre etmek için önce 24 kuyu sensörlü kartuşun her kuyusuna bir mililitre kalibrasyon çözümü ekleyin ve bir gecede Co2'siz kuvözde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Mitokondriyal stres protokolü için yük katkı maddeleri veya sensör kartuşu üzerindeki her enjektör noktasına glikolizi protokolü, kuyudaki hacim değişikliklerine uyum sağlar. İlk kuyu hacminin 450 mikrolitre olduğunu varsayarsak, tipik bir test ilk enjektör noktasına 45 mikrolitre, ikinciye 49,5 mikrolitre, üçüncüye 54,5 mikrolitre ve son olarak 60 mikrolitre içerir. İlk birkaç deney sırasında, bir bağlantı noktası enjeksiyonundan sonra ne kadar doku hareketi artifakı oluştuğunu ölçmek için temel ortamı A limanına yükleyin.

Yüklü sensör plakasının en az 60 dakika boyunca Co2 olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatmasını bekleyin. Taze fare retinal doku yalıtımı yeni ötanazi fare ile başlayın. Optik sinir arka küre kavramak için orta ölçekli kavisli forceps bir çift kullanın, ve yavaşça gözü desteklemek için ileri basınç uygulayın.

Temiz bir jilet ile, bıçağın tek bir kasıtlı geçiş kullanarak kornea boyunca limbus kesi limbus kesi oluşturmak. İnce açılı McPherson tarzı forceps kullanarak, kornea kesi dışında lens ve ön hyloid membranlar ifade etmek için arka küre çimdik. Nöral retinayı ifade etmek için çimdikleme manevrasını forceps ile tekrarlayın.

Daha sonra, kornea kesisinden retinayı kaldırmak için forsepsi kaşık gibi kullanın. Retinayı doğrudan üç santimetrelik bir tabakta veya altı kuyu doku kültürü küme plakasında sıcak ortama yerleştirin. Daha sonra, retinadan kalan vitreusları nazikçe incelemek için iki çift ince açılı McPherson tarzı çifenjan kullanın.

Bu en iyi retina kabının çevresinde vitreus kavrayarak yapılır, ve merkezine doğru çekerek, bir bütün olarak merkezinden vitreus vücut son bir tez ile. Daha sonra, retinanın fotoğraf reseptör yüzeyinden herhangi bir artık retina pigment epitel kaldırın. Transfer manevraları sırasında hassas retina dokusunda aşırı travmayı önlemek için yaklaşık dört milimetrelik bir açıklık oluşturmak için bir jilet ile bir P1000 pipet ucu kesin.

Daha sonra, izole retina luzun uyşu taze ortama aktarmak için kesme pipet ucunu kullanın. Son olarak, optik sinir etrafında retina yumrukları kesmek için, bir piston ile donatılmış bir milimetre biyopsi yumruk kullanın. Retina zımbalarını temiz ortamda bir kenara koyun, 37 derece santigrat blokta veya ısıtma yastığında bekletin.

İstenilen sayıda yumruk toplandıktan sonra, 450 mikrolitre orta alanda tek bir yumruğu aspire etmek için sevimli P1000 ucu kullanın ve 37 derece lik bir ısı yastığı veya ısı bloğu üzerindeki 24 iyi göz leme yakalama mikro plakasına aktarın. Mikro plakanın ortasına yumrukları hafifçe işlemek için ince, düz forceps kullanın. Yumrukları aynı yöne doğru tutun.

Örneğin, ganglion hücre tarafı yukarı. Her deney için negatif kontroller olarak hizmet vermek için taban orta 450 mikrolitre ile üç ila dört boş kuyular bir kenara koyun. Hava kabarcıkları veya aşırı hareket kaçınırken, yavaşça her kuyuya örgü ekler yakalamak ve bir metal piston veya kesilmiş Bir P1000 pipet ucu ile ekler güvenli olarak yerleştirin.

Mikro hazne tipik fare retinasını yerleştirmek için yeterli derinliğe sahip olmasına rağmen, bazen kafes uçlarında bulunan makine kusurları, ekran ekleme sırasında dokuların aşırı sıkıştırılmasına neden olur. Bu durumda, sadece bu ezilmiş doku bir not yapmak ve son analiz bu örnek hariç. Doku plakasını en az 60 dakika boyunca 37 derece karbondioksitsiz bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.

Ekstra hücresel akı analizörlerini karışım, ağırlık, ölçü ve yineleme komutlarını kullanarak programlayın. Örnek olarak, retina dokusu ile tipik bir deney aşağıdakileri içerebilir. İki dakika karıştırın, iki dakika bekleyin ve beş dakika ölçün.

Temel çizgi kaydı için beş ila sekiz kez ve test edilen her bileşiğin enjeksiyonundan sonra bu üç adımla denemeyi tekrarlayın. Hücre dışı akı analizöründeki program başlat düğmesine basın ve sensör kartuşunu kalibrasyon için eklemek için ekrandaki yönergeleri izleyin. Kalibrasyonun sonunda, kalibrasyon plakasını retinal örnekleri içeren plakayla değiştirmek için ekrandaki talimatları uygulayın ve programın programlanmış olarak çalışmasına izin verin.

Koşunun tamamlanmasında, doku plakasını çıkarmak için ekrandaki talimatları uygulayın. Çalıştırmanın sonuçlarını görüntüleyin ve veri dosyasını depolayın. Bükülmüş 20 gauge iğne ve forceps ile, arkalarında retina yumruğu bırakarak, kuyulardan tüm örgü ekler çıkarın.

Dikkatle dokudan orta aspire ve soğuk fosfat tamponlu tuzlu 0,5 mililitre ile iki kez doku yıkayın. İkinci PBS yıkamayı azarladıktan sonra, her yıkamaya 100 mikrolitre lysis tamponu ekleyin ve dokuhomojenize etmek için pipet yukarı ve aşağı. Son olarak, 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ile lysed örnekleri bire bir seyrelterek ve seyreltilmiş numunenin 100 mikrolitresini 96 kuyu plakasına aktararak toplam çift iplikçikli DNA içeriğine göre giriş düzeylerini ölçün.

Sonra, her kuyuya 100 mikrolitre algılama tamponu ekleyin ve 2-5 dakika karıştırın. Son olarak, 480 nanometrede uyarma sonrası floresans ve standart bir eğri ile karşılaştırılarak 520 nanometre de emisyon quantitate. Kuyuiçindeki DNA içeriğine kadar ham hücre dışı akı takibini normalleştirin.

Baz çizgisinde, beş milimler glikoz varlığında ve 10 mili muller pirüuvat varlığında, ekstrasellüler asitleşme oranı ile ölçülen asit eflüs oranlarında anlamlı bir fark yoktur. Wile tipi hayvanların retina dokuları arasında, ya da ışık uyaranlara yanıt olarak siklik nükleotit gated iyon kanalları kapatmak için makine eksikliği fareler nakavt. Benzer desenler 20 milli muller glikoz ve glikolitik inhibitör 2DG eklenmesinden sonra görülür.

Bu veriler, farklı deneysel müdahaleler arasında daha iyi karşılaştırma yapılmasına olanak tanıyan bir biçim olan taban çizgisindeki kesirli değişiklikleri temsil edecek şekilde matematiksel olarak dönüştürülebilir. Taban çizgisinde mutlak oksijen tüketimi oranı da kontrol ve mutant retina lonu arasında eşdeğerdir. 20 milli muller glikoz eklenmesi mitokondriyal solunum u artırır, ancak mutlak nicelik açısından gruplar arasında gözlenen bir değişiklik veya taban çizgisi nden değişim açısından.

Maksimal mitokondriyal solunum hızlarını göstermek için bir milli muller FCCP eklenmesi, kontrol ve mutant retina dokusunda yüksek glikoz ile görülen seviyenin üzerinde OCR artış sağlamaz. Ancak, raa kokteyl eklenmesinden sonra her iki fareden gelen sinyaller büyük ölçüde düşer. Sonuç olarak, fare retinasının organotipik ekstrandik ekstrelerinde okside fosforilasyon ve glikoliz oranlarını ölçmek için bir teknik gösterdik.

Retina dokusunun etkin bir şekilde izolasyonu ile teknik güvenilir ve gurur verici ölçümler sağlar. Birleştirme aracıları gibi pozlamaların gerçek zamanlı etkileri değerlendirilebilir. Bu prosedüre ek olarak, retinametabolizması çalışmaları ile ilgili paralel bilgi elde etmek için diseksiyon aşamasında izole fazla doku üzerinde kantitatif RTPCR ve batı blotting gibi diğer yöntemler de yapılabilir.