Name: Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin, fare retina dokusunda ekstraselüler akı analizi ile oksijen tüketimi ve asitifikasyon oranlarını gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik, glikoliz ve oksidatif fosforilasyonu değerlendirerek retina metabolizmasını in vitro ortamda detaylıca inceler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr Alexander Kolesnikov ve Dr Vladimir Kefalov Gnat1- / -verdiğiniz için teşekkür ederizfareler, yararlı geribildirim ve öneriler için ve makale okumak için.
Bu eser tarafından NIH EY025269 (RR), diyabet araştırma merkezi Washington Üniversitesi - NIH DK020579 desteklenmiştir (JRM ve RR), araştırma önlemek körlüğü (RR), Horncrest Vakfı (RR), JDRF () bir kariyer geliştirme Ödülü için bir kariyer geliştirme Ödülü JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) ve DK114233 (JRM).

İletişim kuralları vizyon Araştırmaları Derneği ve Oftalmoloji deyim için hayvan kullanımı izlemek ve Washington Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hayvan hazırlık
<ol><li>Hayvanlar 12 saat ile standart konut içinde 12 saat ışık-siklet için karanlık tutun. Begin deneyler standart kez sirkadiyen etkileri, genellikle sabah ışıkları yanar kısa bir süre sonra önlemek için.</li>
</ol>2. çözüm hazırlık
<ol><li>8.4 mg (GKD2O) çift distile H2O toz medya çözülerek temel ortam hazırlamak ve pH HCl ve NaOH 7.4 için ayarlamak, 1 final bir birime L. filtre sterilize bu çözüm 0,22 µm doku kültürü filtre ile.<ol>
<li>1 M glikoz ve 100 mM sodyum pyruvate son 5 mM şekeri konsantrasyonları elde etmek için medya ve 1 mM pyruvate ekleyin.</li>
		<li>37 ° C su banyosu temel medya 50 mL aliquot bir yer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tris temel ekleyerek 10 mM, Polietilen glikol tert-octylphenyl Eter %0,2 (v/v) ve tüm GKD2O. tüm bileşenlerini tamamen çözülmüş ve ayarlamak kadar Mix 1 mm EDTA lizis çözüm, doku Nefelometri akı analizi, sonunda hazırlamak 8,0 pH.</li>
	<li>Mitokondrial stres iletişim kuralı için iyi 1 µM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş oligomycin, bir ATP sentaz inhibitörü 11 µM stokunun hazırlayın. Hazırlamak bir 11 µM stok karbonil siyanür - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), uncoupling ajanı, çözünmüş iyi 1 µM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel medya. Elektron taşıma zinciri inhibitörleri, Rotenon ve antimycin A (RAA Rotenon 11 µM ve antimycin A 22 µM için için ekleyerek) bir kokteyl hazırlamak 1 µM Rotenon ve 2 µM antimycin A içinde son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş de.</li>
	<li>Glikoliz iletişim kuralı için bir 220 mM hisse senedi iyi 20 mM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş glikoz hazırlayın. Ayrıca 2-deoxyglucose (2-DG) 1,1 M stokunun, glikoz ve glycolytic antagonisti, rekabetçi bir önleyici temel medyada çözülerek hazırlayın. Bu 100 mM 2-DG iyi son bir konsantrasyon hedefleyecektir.</li>
</ol>3. aleti kalibrasyon
<ol><li>Araçları bir hücre dışı akı tahlil için ayarlamak için sensör kartuş (24 kuyu toplam) her şey için kalibrasyon çözüm 1 mL ekleyin ve CO237 ° C'de kuluçkaya-özgür kuluçka geceleme (ya da en az 8 saat).</li>
	<li>Katkı maddeleri, mitokondrial Stres Protokolü veya glikoliz protokolü için her enjektör bağlantı noktası, A ile D, iyi cilt değişiklikleri için ayarlama sensör kartuþundaki yüklemek. Not: Örneğin, tipik bir tahlil bir katkı ilk enjektör bağlantı noktasına 45 µL, ikinci, üçüncü ve 60 µL son, içine içine 54,5 µL 450 µL bir ilk iyi hacmi varsayarak içine 49,5 µL içerir.</li>
	<li>İlk birkaç deneyler sırasında temel medya bağlantı bir bağlantı noktası enjeksiyon sonra ne kadar doku hareketi/yapay doku oluşur ölçmek için noktası A içine yükleyin.</li>
	<li>Bir sigara-CO2 kuluçka için en az 60 dk. 37 ° C'de kuluçkaya için yüklü sensörü plaka izin.</li>
</ol>4. yalıtım taze fare Retina dokusunun
Not: Bu adım Dr Barry Winkler15tekniği adapte olduğunu.
<ol><li>Derin anestezi'ni kullanarak yönetme sonra bir standart ketamin/xylazine kokteyl, servikal çıkığı tarafından fareler ötenazi.</li>
	<li>Kıvrımlı pensler orta ölçekli bir çift optik sinir, posterior dünya kavramak ve yavaşça proptose göz (Şekil 1A) ileri baskı uygulamak için kullanın.<ol>
<li>Temiz bir tıraş bıçağı ile bir limbus limbus kesi kornea arasında bir tek, kasıtlı geçmek-in bıçak kullanarak oluşturun.</li>
		<li>İyi kullanarak, açılı McPherson tarzı forseps, posterior dünyanın objektif ve korneal kesi dışında anterior hyaloid membran ifade etmek için çimdik. Bu doku atmak.</li>
		<li>Kıstırma manevra forseps ile sinirsel retina ifade etmek için yineleyin.</li>
		<li>Bir kaşık gibi forseps retina kaldırmak için yerine doku kavramak için kullanarak, korneal kesi uzak retina aktarmak ve 3 cm çanak veya 6-iyi doku kültürü küme plaka sıcak ortamda doğrudan yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İyi, açılı McPherson tarzı forseps iki çift yavaşça retina üzerinden kalan vitre incelemek için kullanın. Bu en iyi Retina Kupası çevre vitre açgözlü ve bir bütün olarak Merkezi'nden vitreus vücudun son bir disinsertion ile merkezine doğru çekerek yapılır. Forseps kullanarak, herhangi bir kalıntı retina pigment epiteli retina photoreceptor yüzeyinden kaldırın.<ol>
<li>P1000 damlalıklı bahşiş aşırı travma için hassas Retina doku transferi manevralar sırasında önlemek için ~ 4 mm açılış oluşturmak için bir tıraş bıçağı ile kesti.</li>
		<li>İzole Retina doku kesme P1000 damlalıklı bahşiş kullanarak yeni medya aktarın.</li>
		<li>Retina çevresinde optik sinir 1 mm biyopsi ile 1 mm yumruklardan punch delik (Şekil 1B) saplanmış olur diye doku çıkarmak için bir dalgıç ile donatılmış kesim. Retina yumruklar bir kenara temiz medya 37 ° C blokta tutulabilir ya da yastık Isıtma ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. tahlil Protokolü
<ol><li>Tek tek yumruk 450 µL medya ile birlikte doku alıyorum bir kesim P1000 ucu, kullanarak bir 24-şey adacık yakalama Mikroplaka aktarın.</li>
	<li>Tamam, yavaşça yumruk Mikroplaka ortasına içine işlemek için düz forseps kullanın. Aynı yönde (Örneğin, ganglion hücre tarafı yukarı doğru) yönelik yumruk tutun.<ol>
<li>Yakalama plaka bir ısıtma yastığı veya adımları kalan örnekleri için yinelenir gibi 37 ° C blok kümesine Isıtma üzerinde bekletin. Not: Her deneme için 3-4 boş wells 450 µL negatif denetimler olarak hizmet etmek temel medya ile bir kenara koyun. 20-21 wells kalan her biyolojik REPLICATE nüsha olarak sınayın. Bu nedenle, her 24-şey plaka kaydı için 6-7 farklı hayvan veya tedavi koşulları sağlayacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hava kabarcıkları, yavaşça pozisyon kaçınarak adacık kafes ekler her şey forseps kullanarak yakalamak ve ekler bir metal dalgıç veya bir kesim P1000 damlalıklı ucu (Şekil 1 C) ile güvenli. Not: Aşırı doku hareket Merkezi bünyesinde Retina yumruk konumunu örnek microchamber korumak için bu adımı sırasında kaçının. Hava kabarcıkları ciddi OCR okuma deforme. Microchamber tipik fare retina (Şekil 1 c) karşılamak için yeterli derinlik olmasına rağmen zaman zaman kafes ekler işleme hatalarını dokularda aşırı ekran ekleme sırasında sıkıştırılmış haline neden olabilir. Bu durumda, sadece ezilmiş doku not alın ve bu örnek son çözümleme dışı bırakmak.</li>
	<li>Kuluçkaya doku plaka 37 ° C CO2-en az 60 dakika için özgür kuluçka makinesi.</li>
	<li>Kullanarak Mix, bekle, ölçü birimi hücre dışı akı analyzer programı ve komutları yineleyin. Örnek olarak, Retina doku ile tipik bir deneme aşağıdakiler dahil: 2 dakika karıştırın, 2 dakika bekleyin ve 5 dakika ölçmek. Bu üç ile deneme adımlar arasında tekrar 5 - 8 kat (devir) bir temel kayıt için ve sonra çalışma sırasında test edilen her bileşik enjeksiyon.</li>
	<li>Hücre dışı akı analyzer programı Başlat düğmesine basın ve sensör kartuş kalibrasyon için eklemek için ekrandaki yönergeleri izleyin.</li>
	<li>Kalibrasyon sonunda calibrant plaka Retina örnekleri içeren plaka ile değiştirmek için ekrandaki yönergeleri izleyin.</li>
	<li>Çalıştırmak, program programlı olarak izin. Çalışma bitiminde, doku plaka çıkarmak için ekrandaki yönergeleri izleyin. Çalışma sonuçlarını görüntülemek ve veri dosyası depolamak.</li>
	<li>Bir bükülmüş 20 gauge iğne ve forseps ile retina yumruk geride bırakarak kuyulardan tüm kafes ekler kaldırın.</li>
	<li>Dikkatle doku medyadan Aspire edin ve doku 0.5 mL soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez yıkayın. PBS yıkandıktan sonra Aspire edin.</li>
	<li>100 µL lizis arabelleği her şey ve damlalıklı yukarı ve aşağı doku homojenize ekleyin.</li>
	<li>Toplam çift iplikçikli DNA (dsDNA) veya toplam protein içeriği temel giriş düzeylerini quantitate. Not: Aşağıda bir piyasada bulunan dsDNA tahlil dayanmaktadır.</li>
	<li>100 µL Tris-EDTA (TE) arabelleği ekleyerek lysed örnekleri 1:1 oranında seyreltin ve seyreltilmiş örnek 100 µL 96 iyi bir tabağa aktarın.<ol>
<li>100 µL algılama arabelleği her kuyunun içine ekleyin. 2-5 dakika karıştırdıktan sonra floresan sonra 480 nm, uyarma ve emisyon 520, quantitate nm, standart bir eğri karşılaştırma.</li>
		<li>DNA içeriği kuyu içinde ham hücre dışı akı izlemeyi normalleştirmek. Not: Burada sunulan sonuçlarında örnekleri 50 ng dsDNA - 1 mm Retina yumruk tipik bir miktar için normalleştirilmiş. Bu nedenle, mutlak değerler burada sunulan "başına Retina yumruk" veri sunma çalışmaları karşılaştırıldığında. Temel koşmak bir glikoz konsantrasyonu 5 mm gibi tracings bir iç standart normalleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).</li>
<li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li>
<li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).</li>
<li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+lactate%2C+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113(2017).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

OCR ve D.H.T. kolayca açıklanan teknikleri kullanarak bir bioanalyzer kullanarak explanted Retina dokularında ölçülür. Bu, diğer grupların birkaç kritik adımda bu yöntem başlamaktadır. Retina dokularının orijinali Winkler15tarafından açıklanan dünya, enucleating olmadan büyük bir korneal kesi izole edilmiştir. Bu yöntemi Retina tecrit (genellikle 5 dakika içinde) doku yakalama plaka içine hızlı bir transfer yaşam göz olanak sağlar. Doku hücresel solunum ne zaman buz üzerinde yerleştirilir daha iyi...

Retina Merkezi sinir sistemi1en enerji talep dokularda arasındadır. Çoğu dokular gibi bu mitokondri sitozol ya da yolu ile Oksidatif fosforilasyon adenozin trifosfat (ATP) üzerinden glikoliz oluşturur. Glikoliz glikoz bir molekül ATP üretmek için enerjik avantaj Oksidatif fosforilasyon açıktır: 36 molekül ATP üretilen eski vs 2 ikinci gelen üretilen ATP molekülleri. Buna göre Retina nöronlar mitokondrial solunum enerji arzı için öncelikle bağlıdır ve bu mitokondri2onların yüksek yoğunluklu tarafından yansıtılır. Oksijen bol olsa bile henüz, retina da ağır glycolytic makine üzerinde dayanır. Aerobik glikoliz bu sürecin aslında kim bir kez retina sadece sonrası mitotik doku metabolizması4bu tür yetenekli olduğunu kaydetti Otto Warburg3tarafından kanser hücrelerinin içinde tanımlanmıştır. Bu ilk gözlemler beri birçok sonrası mitotik doku glikoliz Oksidatif fosforilasyon ek olarak değişen derecelerde ATP taleplerini karşılamak için girişme tarif edilmistir.
Phototransduction, görsel pigment biyosentezi photoreceptor dış segmentleri ve sinirsel aktivite geri dönüşüm, tüm enerji photoreceptors, baskın nöronal alt sınıfta retina zorlu süreçlerde vardır. Ama karşı onların elektrik iyonları ve konsantrasyon degradeler aktif taşıma gerek en enerjik alıcı bir süreç nöronların1gereğidir. Photoreceptors Kanal kapatma ve sonraki hyperpolarization hafif bir uyarıcı tetikler Oysa onlar (Yani, karanlık), stimülasyon yokluğunda depolarized anlamda kendine özgü nöronlar vardır. Bu nedenle, karanlıkta, retina ATP olarak yaygın olarak adlandırılan depolarizasyon veya "karanlık akımı" korumak için büyük miktarlarda tüketmek. Adaptif değiştiremeyeceğinden, bu büyük miktarda ATP temin büyük bir meydan okuma optik eksen aracılığıyla görsel netlik sağlamak organizmalar için ihtiyaç vardır. Photoreceptors ışık yolunu uzak tedarik yoğun kılcal ağ tutar olarak modern yaratıkları görmüş ters Retina baskın çözüm mimarisidir. Ama bu hayret doğal Biyomühendislik retina metabolik rezerv açısından bir uçurumun yerleştirir. Hatta küçük hakaret retina için potansiyel enerji arz talep hassas dengesini bozabilir ve görsel fonksiyon bozukluğu veya frank körlüğü hızlı bir şekilde doğmak.
Sinirsel retinanın vasküler kaynağı, onun sıkı kısıtlama ile birleştiğinde, benzersiz enerjik talepleri göz önüne alındığında hastalığı sırasında ATP tüketimi retina ve değişiklikleri doğru ölçüm anlamakta ve tedavi derin etkileri olabilir retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi koşulları kör. Geleneksel olarak, bu ölçümler laboratuar tamamen metabolik aktivite2,5,6ölçümleri için adanmış bir avuç çıkan en çalışmaları ile pahalı, özel tasarlanmış ekipman gerektiren, 7,8. Teknikleri belirli metabolitleri, radyo etiketli öncüleri, oksijen tüketimi kayıt Clark elektrotlar ve9profil oluşturma metabolomic kullanarak kullanarak izleme çalışmaları için bireysel testleri içerir.
Gelişmeler ile yüksek-den geçerek teknoloji ve ticari cihazlar, kullanılabilirliğinin artması, giderek erişilebilir ve uygun teknikleri kayıt Retina metabolizma. Burada açıklanan yöntemi hem Oksidatif fosforilasyon ölçer ve glikoliz retina kullanarak doku ve piyasada bulunan hücre dışı akı analyzer9,10,11,12explanted. Bu Çözümleyicisi ayrı olarak oksijen tüketim oranını (OCR) ve Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz, sırasıyla13dolaylı göstergeleri olarak hizmet veren hücre dışı asitleştirme oranı (D.H.T.), kaydeder. Bu ölçümler faiz doku üzerinde oluşturulan bir microchamber içinde örtülü bir sonda tarafından yapılır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri bu uyum pankreas adacıkları of Langerhans için tasarlanan bir yakalama plaka fare retina küçük, dairesel bölümlerde metabolik etkinliklerini kaydetmek için kullanır. Birden fazla farmakolojik poz doku için sistem 4 enjeksiyon portu her örnek için de içerdiği için bir tek kayıt ders sırasında teslim edilebilir. D.H.T. ve OCR kayıtları için en iyi duruma getirilmiş ayrı protokol ile bu sistemi kullanarak, vahşi tipi Retina yanıt (Gnat1- / -), transducin eksik Retina karşılaştırılabilir bir nedeni konjenital sabit gece körlüğü insanlar14.

<table><tbody><tr><td>Denizatı XF24 Hücre Dışı Akı Analiz Cihazı</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF24 Adacık Yakalama FluxPak (içerir: Adacık Yakalama Mikroplakası, Sensör Kartuşu ve Kalibant Çözeltisi)</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Adacık yakalama mikroplakası, sensör kartuşu ve kalibrant solüsyonu içerir</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media (Toz ortam)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 L-Glutaminli ve glikoz veya sodyum bikarbonatsız ortam</td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-Glikoz filtreli, ortam hazırlama için</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM sodyum piruvat</td></tr><tr><td>Antimisin-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>Mitokondriyal stres protokolü bileşeni</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>Mitokondriyal stres protokolü bileşeni</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>Mitokondriyal stres protokolü bileşeni</td></tr><tr><td>2-deoksiglukoz</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>Glikoliz protokolü bileşeni</td></tr><tr><td>1 mm deri biyopsisi pistonlu</td><td>zımbalar Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>Eksplantasyon retina dokusu aleti</td></tr><tr><td>Dumont Mini-Forseps Düz</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11200-10</td><td>Retina dokusu çıkarma aleti</td></tr><tr><td>Dumont Medical #5/45 Forseps- Açılı 45 derece</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11253-25</td><td>Retina dokusu çıkarma aleti</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forseps - Kavisli</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>11271-30</td><td>Eksplantasyon retina dokusu aleti</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Test Kiti</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>Normalizasyon testi</td></tr> <tr><td>yükleniyorTrizma bazı (Tris tabanı)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>Lizis tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Triton X-100 (polietilen glikol tert-oktilfenil eter)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>Lizis tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>Lizis tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>C57BL/6J fareler&nbsp;</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>&nbsp; Suş 000664</td><td>Hayvanlar</td></tr><tr><td>Gnat1-/- ve arka plan uyumlu Gnat1+/+&nbsp;</td><td>Vladimir Kefalov, Doktora; Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi</td><td>Hayvanlar</td><td></td></tr></tbody></table>

explanted retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Yüksek keskinliği vizyon ağır enerji tüketen bir süreç ve retinanın tam şeffaflık görsel eksen koruyarak böyle taleplerini karşılamak için birkaç benzersiz uyarlamaları geliştirmiştir. Bu hassas denge için tedirginlikler diabetik retinopati gibi kör edici hastalıklar neden. Bu nedenle, enerji metabolizması değişiklikleri retina anlayış hastalığı sırasında vison kaybı çeşitli nedenleri için rasyonel tedavilerin geliştirilmesi şarttır. Piyasada bulunan hücre dışı akı Analizörleri son gelişiyle Retina enerji metabolizması çalışmanın daha erişilebilir yaptı. Bu iletişim kuralı katkıları Retina enerji arzına - Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz - iki prensip kolları aracılığıyla yapılan oksijen tüketimi (OCR) miktarının ölçmek için böyle bir çözümleyici kullanımını açıklar ve ekstrasellüler Bu yollar için proxy olarak asitleştirme oranları (D.H.T.). Bu tekniği tek denemede birden çok farmakolojik ajanlara yanıt değerlendirilmesi kolaylaştırılması explanted Retina dokusunda kolayca gerçekleştirilir. Retina çubuk photoreceptor sinyal eksik hayvanlardan metabolik imzalar bu yöntemi kullanarak vahşi-tür denetimlere karşılaştırılır. Bu teknikte önemli bir sınırlama ışık uyarlanmış ve dark-adapted enerji kullanımı, önemli bir fizyolojik göz retina doku arasında ayırımcılık için yetenek eksikliğidir.

( Şekil 1' de özetlenen) açıklanan teknikleri kullanarak, 8 haftalık vahşi türü (WT) fareler gelen Retina explants yaş ve arka plan eşleşen transducin null fareler için (Gnat1- / -) karşılaştırıldı. Gnat1- / - hayvan kapatmak için makine eksikliği nedeniyle nükleotit döngüsel ışık bizi canlı tutan iyon kanalları geçişli, onların çubuk photoreceptors bile ışık14' te depolarized kalır. Son...

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Bu yöntem, retina dokusundaki enerji metabolizması biyolojik örnekler arasında nasıl farklılık gösterir, ya da farmakolojik ajanlara maruz kaldıktan sonra gibi anahtar soruların cevaplatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hem glikoliz oranlarını ölçmek için ekselans organotipik retina doku kullanıyor olması, hem de okside fosforilasyon ve in vitro gerçek zamanlı müdahalelerin değerlendirilmesi sağlar. Ekstrasellüler akı test inamasını kalibre etmek için önce 24 kuyu sensörlü kartuşun her kuyusuna bir mililitre kalibrasyon çözümü ekleyin ve bir gecede Co2'siz kuvözde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Mitokondriyal stres protokolü için yük katkı maddeleri veya sensör kartuşu üzerindeki her enjektör noktasına glikolizi protokolü, kuyudaki hacim değişikliklerine uyum sağlar. İlk kuyu hacminin 450 mikrolitre olduğunu varsayarsak, tipik bir test ilk enjektör noktasına 45 mikrolitre, ikinciye 49,5 mikrolitre, üçüncüye 54,5 mikrolitre ve son olarak 60 mikrolitre içerir. İlk birkaç deney sırasında, bir bağlantı noktası enjeksiyonundan sonra ne kadar doku hareketi artifakı oluştuğunu ölçmek için temel ortamı A limanına yükleyin.Yüklü sensör plakasının en az 60 dakika boyunca Co2 olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatmasını bekleyin. Taze fare retinal doku yalıtımı yeni ötanazi fare ile başlayın. Optik sinir arka küre kavramak için orta ölçekli kavisli forceps bir çift kullanın, ve yavaşça gözü desteklemek için ileri basınç uygulayın.Temiz bir jilet ile, bıçağın tek bir kasıtlı geçiş kullanarak kornea boyunca limbus kesi limbus kesi oluşturmak. İnce açılı McPherson tarzı forceps kullanarak, kornea kesi dışında lens ve ön hyloid membranlar ifade etmek için arka küre çimdik. Nöral retinayı ifade etmek için çimdikleme manevrasını forceps ile tekrarlayın.Daha sonra, kornea kesisinden retinayı kaldırmak için forsepsi kaşık gibi kullanın. Retinayı doğrudan üç santimetrelik bir tabakta veya altı kuyu doku kültürü küme plakasında sıcak ortama yerleştirin. Daha sonra, retinadan kalan vitreusları nazikçe incelemek için iki çift ince açılı McPherson tarzı çifenjan kullanın.Bu en iyi retina kabının çevresinde vitreus kavrayarak yapılır, ve merkezine doğru çekerek, bir bütün olarak merkezinden vitreus vücut son bir tez ile. Daha sonra, retinanın fotoğraf reseptör yüzeyinden herhangi bir artık retina pigment epitel kaldırın. Transfer manevraları sırasında hassas retina dokusunda aşırı travmayı önlemek için yaklaşık dört milimetrelik bir açıklık oluşturmak için bir jilet ile bir P1000 pipet ucu kesin.Daha sonra, izole retina luzun uyşu taze ortama aktarmak için kesme pipet ucunu kullanın. Son olarak, optik sinir etrafında retina yumrukları kesmek için, bir piston ile donatılmış bir milimetre biyopsi yumruk kullanın. Retina zımbalarını temiz ortamda bir kenara koyun, 37 derece santigrat blokta veya ısıtma yastığında bekletin.İstenilen sayıda yumruk toplandıktan sonra, 450 mikrolitre orta alanda tek bir yumruğu aspire etmek için sevimli P1000 ucu kullanın ve 37 derece lik bir ısı yastığı veya ısı bloğu üzerindeki 24 iyi göz leme yakalama mikro plakasına aktarın. Mikro plakanın ortasına yumrukları hafifçe işlemek için ince, düz forceps kullanın. Yumrukları aynı yöne doğru tutun.Örneğin, ganglion hücre tarafı yukarı. Her deney için negatif kontroller olarak hizmet vermek için taban orta 450 mikrolitre ile üç ila dört boş kuyular bir kenara koyun. Hava kabarcıkları veya aşırı hareket kaçınırken, yavaşça her kuyuya örgü ekler yakalamak ve bir metal piston veya kesilmiş Bir P1000 pipet ucu ile ekler güvenli olarak yerleştirin.Mikro hazne tipik fare retinasını yerleştirmek için yeterli derinliğe sahip olmasına rağmen, bazen kafes uçlarında bulunan makine kusurları, ekran ekleme sırasında dokuların aşırı sıkıştırılmasına neden olur. Bu durumda, sadece bu ezilmiş doku bir not yapmak ve son analiz bu örnek hariç. Doku plakasını en az 60 dakika boyunca 37 derece karbondioksitsiz bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.Ekstra hücresel akı analizörlerini karışım, ağırlık, ölçü ve yineleme komutlarını kullanarak programlayın. Örnek olarak, retina dokusu ile tipik bir deney aşağıdakileri içerebilir. İki dakika karıştırın, iki dakika bekleyin ve beş dakika ölçün.Temel çizgi kaydı için beş ila sekiz kez ve test edilen her bileşiğin enjeksiyonundan sonra bu üç adımla denemeyi tekrarlayın. Hücre dışı akı analizöründeki program başlat düğmesine basın ve sensör kartuşunu kalibrasyon için eklemek için ekrandaki yönergeleri izleyin. Kalibrasyonun sonunda, kalibrasyon plakasını retinal örnekleri içeren plakayla değiştirmek için ekrandaki talimatları uygulayın ve programın programlanmış olarak çalışmasına izin verin.Koşunun tamamlanmasında, doku plakasını çıkarmak için ekrandaki talimatları uygulayın. Çalıştırmanın sonuçlarını görüntüleyin ve veri dosyasını depolayın. Bükülmüş 20 gauge iğne ve forceps ile, arkalarında retina yumruğu bırakarak, kuyulardan tüm örgü ekler çıkarın.Dikkatle dokudan orta aspire ve soğuk fosfat tamponlu tuzlu 0,5 mililitre ile iki kez doku yıkayın. İkinci PBS yıkamayı azarladıktan sonra, her yıkamaya 100 mikrolitre lysis tamponu ekleyin ve dokuhomojenize etmek için pipet yukarı ve aşağı. Son olarak, 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ile lysed örnekleri bire bir seyrelterek ve seyreltilmiş numunenin 100 mikrolitresini 96 kuyu plakasına aktararak toplam çift iplikçikli DNA içeriğine göre giriş düzeylerini ölçün.Sonra, her kuyuya 100 mikrolitre algılama tamponu ekleyin ve 2-5 dakika karıştırın. Son olarak, 480 nanometrede uyarma sonrası floresans ve standart bir eğri ile karşılaştırılarak 520 nanometre de emisyon quantitate. Kuyuiçindeki DNA içeriğine kadar ham hücre dışı akı takibini normalleştirin.Baz çizgisinde, beş milimler glikoz varlığında ve 10 mili muller pirüuvat varlığında, ekstrasellüler asitleşme oranı ile ölçülen asit eflüs oranlarında anlamlı bir fark yoktur. Wile tipi hayvanların retina dokuları arasında, ya da ışık uyaranlara yanıt olarak siklik nükleotit gated iyon kanalları kapatmak için makine eksikliği fareler nakavt. Benzer desenler 20 milli muller glikoz ve glikolitik inhibitör 2DG eklenmesinden sonra görülür.Bu veriler, farklı deneysel müdahaleler arasında daha iyi karşılaştırma yapılmasına olanak tanıyan bir biçim olan taban çizgisindeki kesirli değişiklikleri temsil edecek şekilde matematiksel olarak dönüştürülebilir. Taban çizgisinde mutlak oksijen tüketimi oranı da kontrol ve mutant retina lonu arasında eşdeğerdir. 20 milli muller glikoz eklenmesi mitokondriyal solunum u artırır, ancak mutlak nicelik açısından gruplar arasında gözlenen bir değişiklik veya taban çizgisi nden değişim açısından.Maksimal mitokondriyal solunum hızlarını göstermek için bir milli muller FCCP eklenmesi, kontrol ve mutant retina dokusunda yüksek glikoz ile görülen seviyenin üzerinde OCR artış sağlamaz. Ancak, raa kokteyl eklenmesinden sonra her iki fareden gelen sinyaller büyük ölçüde düşer. Sonuç olarak, fare retinasının organotipik ekstrandik ekstrelerinde okside fosforilasyon ve glikoliz oranlarını ölçmek için bir teknik gösterdik.Retina dokusunun etkin bir şekilde izolasyonu ile teknik güvenilir ve gurur verici ölçümler sağlar. Birleştirme aracıları gibi pozlamaların gerçek zamanlı etkileri değerlendirilebilir. Bu prosedüre ek olarak, retinametabolizması çalışmaları ile ilgili paralel bilgi elde etmek için diseksiyon aşamasında izole fazla doku üzerinde kantitatif RTPCR ve batı blotting gibi diğer yöntemler de yapılabilir.

measurement-energy-metabolism-explanted-retinal-tissue-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, hücre dışı akı testi ile primer lösemik hücrelerin hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ve oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek için biyokimyasal bir yaklaşım sağlar. Bu hücrelerin metabolik profilinin değerlendirilmesi, taleplerinin karakterize edilmesine yardımcı olarak kişiselleştirilmiş tedaviye yol açar.

Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, hücre dışı akı analizörü kullanarak aktive edilmiş insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasını analiz etme yöntemini göstermektedir. Elektron taşıma zinciri komplekslerinin farklı inhibitörleri, oksijen tüketim oranı veya OCR ile ölçülen ATP sentezini etkiler ve hücresel metabolizma ve biyoenerjetik hakkında bilgi sağlar.

Hücre dışı akı analizörü kullanılarak insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve daha sonra böbrek biyolojik fonksiyonları ex vivomitokondriyal bioenergetics de dahil olmak üzere, değerlendirmek için alt kültürlü fare birincil renal tübüler hücreler karakterize için düşük maliyetli bir yaklaşım sağlar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Burada, ticari bir biyoanalizör kullanarak ex vivo retinal doku örneklerinde mitokondriyal stres tahlilini ve glikolitik oran tahlilini yapmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

Ex Vivo Retinal Doku Örneklerinde Mitokondriyal Solunum ve Glikoliz Tayini

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Bu protokol, birincil fare mikrogliasında metabolik yeniden programlamayı niceliklendirmek için glikoliz stres testi yapmanın maliyet etkin bir yolunu tanımlar. İzolasyon ve inflamatuar uyarımdan sonra, taze hazırlanmış, pH-ayarlanmış reaktiflerle hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçülür, ardından protein normalizasyonu uygulanarak glikolitik değişimlerin doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması

Bu makalede, ex vivo yetişkin zebrafish ventriküllerinin oksijen tüketim oranı ve hücre dışı asitlenme oranını niceltmek için ayrıntılı bir protokol tanımlıyoruz; böylece oksidatif ve glikolitik metabolik kapasitelerini karakterize ediyoruz.

Tüm yenilenen zebrafish ventriküllerinin metabolik aktivitesinin ex vivo olarak değerlendirilmesi ve ekstraselüler akı testi kullanılarak

Öğrenin, fare retina dokusunda ekstraselüler akı analizi ile oksijen tüketimi ve asitifikasyon oranlarını gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik, glikoliz ve oksidatif fosforilasyonu değerlendirerek retina metabolizmasını in vitro ortamda detaylıca inceler.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Daha fazla video keşfet