Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

Bu yöntem, hücrelerde protein izoformlarının ve protein post-translational değişikliklerinin büyük ölçekli ve yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunun geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kılcal bölge elektroforez kütle spektrometresi yüksek verimli ayırma ve bozulmamış proteinlerin son derece hassas tespiti sunuyor olmasıdır. Kılcal damarı önceden tedavi etmek için, en az 12 saat boyunca 10 psi azot gazı ile kurulayın.

Sonra, bir şırınga pompası kullanarak metanol% 50 hacim-by-volume 3-propil metakrilat ile kılcal doldurun. Kılcal damarın her iki ucunu silika kauçukla kapatın. En az 24 saat oda sıcaklığında kuluçkadan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi ayırma kılcal iç duvarında doğrusal poliakrilamid kaplama ile devam edin.

Kapiller bir ucundan yaklaşık dört santimetre uzaklıkta poliamid dış kaplama kaldırmak için nazik bir alev kullanarak kapiller bir kısmını yakmak. Poliamid kaplamayı tamamen çıkarmak için silerek kılcal damarın yanmış kısmını nazikçe temizleyin. Bu delikten geçirildikten sonra kılcal damarı yeterince yerinde tutmak için kılcal dış çapile aynı boyutta 200 mikrolitrelik bir tüpün ucunda küçük bir delik aç.

Yanmış kısmı tüpiçinde olana kadar yanmış kısmına yakın olan kılcal damarın ucunu delikten geçirin. Daha sonra, 200 mikrolitrelik tüpe yaklaşık 150 mikrolitre HF ekleyin, böylece HF çözeltisi kılcal damardaki yanmış kısmın yarısına kadar dır. HF çözeltisindeki kılcal damarı oda sıcaklığında 90-100 dakika kuluçkaya yatırın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi standart protein karışımını ve E.coli örneğini hazırlayın. Kapiller bölge elektroforezini veya CZE sistemini kurmak için numuneyi, arka plan elektrolitini ve ayırma kılcal damarını CZE otomatik örnekleyicisine yükleyin. CZE otomatik örnekleyicinin manuel kontrol sayfasında örnek yükü seçin.

Arka plandaki elektrolit şişesini otomatik numunenin tampon tepsisine yükleyin ve tampon tepsideki konumunu belirtin. Daha sonra, numune şişesini örnek tepsideki konumunu belirterek, oto örnekleyicinin numune tepsisine yükleyin. Manuel kontrolü kullanarak otomatik örnekleyiciyi hizalama konumuna getirin.

Şimdi, kapiller olmayan kazınması ucunu kullanarak CZE otomatik örnekleyici içine ayırma kapiller yükleyin. Numune hacmi 50 mikrolitreden düşükse kılcal damarın enjeksiyon ucunun yüksekliğini ayarlayın. Manuel kontrolü kullanarak otomatik örnekleyiciyi beklemeye geçin.

Sisteme örnek konumunu yazın ve kılcal damarı numuneye taşıyın. Örnek şişenin altına ulaşmak için kılcal damarın enjeksiyon ucunu daha da aşağı doğru itin. Manuel kontrolü kullanmaya devam ederek, 20 psi basınç kullanarak 20 dakika arka plan elektroliti ile kılcal yıkama.

Şimdi, kütle spektrometresinin önüne elektrokinetik olarak pompalanmış bir kılıf akış arabirimi monte edin. Kılıf tampon haznesini LCMS dereceli suda %10 hacimli metanol ve %0,2 hacim hacmi formik asit içeren bir tamponla doldurun. Bir şırınga ile manuel basınç uygulayarak kılıf tampon ile arayüz Içinde T Flush.

Bir elektrosprey yayıcının bir milimetre dış çapıucunu bir kollu borudan geçirin ve yayıcıyı bir montaj yoluyla T'nin bir portuile bağlayın. Yayıcıyı kılıf tamponuyla doldurmak için T'yi bir şırınga ile tekrar elle yıkamanız yeterlidir. Arabirimle birlikte gelen kamera yardımı ile yayımlayıcının deliği ile kütle spektrometresinin girişi arasındaki mesafeyi yaklaşık iki milimetreye ayarlayın.

Elektrosprey için kılıf tampon şişesine 2 ila 2,2 kilovolt voltaj uygulayın. Daha sonra, kararlı bir elektrosprey ulaşmak için sprey voltajı ayarlayın. Bu işlem sırasında kılcal damarda kabarcık olmadığından emin olmak için kılcal damarın enjeksiyon ucunda düşük basınç uygulayın.

Püskürtme gerilimini kapatın ve ayırma kılcal damarının kazınmış ucunu t yayıcısı niçin daha fazla itilene kadar hafifçe geçirin. Kılcal damar enjeksiyon ucunda düşük basınç durduktan sonra, kılıf tampon ile emitter biraz floş. Yine, sprey test etmek için sprey voltaj 2 ila 2,2 kilovolt uygulayın.

Ana enstrüman ekranındaki dosya açılır menüsü altında yeni bir yöntem seçin. Burada, başlangıç numunesi şişesi, bitirme numune şişesi, numune olarak tepsi, beş psi olarak basınç, sıfır olarak kilovolt ve numune enjeksiyonu için 95 saniye olarak giriş seçeneğini belirleyin. Daha sonra giriş şişesi, arabellek olarak tepsi, sıfır psi olarak basınç, 30 olarak kilovolt ve standart protein karışımı örneğinin ayrılması için 4, 200 saniye olarak süresi ayarlayın.

E.coli proteome numunesinin ayrılması için giriş şişesi, arabellek olarak tepsi, sıfır psi olarak basınç, 20 olarak kilovolt ve 6,600 saniye olarak süresi ayarlayın. Son olarak, giriş şişesi olarak giriş, tampon olarak tepsi, 10 psi olarak basınç, 30 olarak kilovolt ve kapiller kızarma için 600 saniye olarak süresi seçin. Şimdi, dört iyon tuzak maskesi spektrometresi kullanarak bozulmamış protein analizi için MS ve MS/MS parametrelerini hazırla.

Ayar dosyası ayarlarını ayarlamak için bozulmamış protein modunu açın ve 0,2'lik bir bindirme basıncı kullanın. Iyon transfer kapiller sıcaklığını 320 santigrat dereceye, S-lens RF seviyesini ise 55 dereceye ayarlayın. CZE MS/MS denemesini gerçekleştirmek için, önce çalıştırma sırasını seçerek kütle spektrometre bilgisayarında veri toplama yöntemini başlatın.

Daha sonra, kapiller elektroforez otomatik örnekleyici bilgisayarda kapiller elektroforez dizisini başlatın. TopPIC paketinde ve TopPIC grafik kullanıcı arabiriminde TopPIC ile veritabanı araması yapın. Veritabanı dosyasına tıklayın ve arama için uygun bir veritabanı seçin.

Spektrum dosyasına tıklayın ve oluşturulan ms2'yi seçin. giriş olarak oluşturulan msalign dosya. MS1 özellik dosyasını seçin ve oluşturulan özellik dosyasını seçin.

Set sistein karbamidomethyl C57 sabit bir değişiklik iodoacetamide tedavisi nedeniyle. Yem veritabanı özelliğini seçin ve kesme ayarlarının altında, spektrum düzeyinin yanındaki açılır menüde yanlış bulma oranını seçin. Yanlış bulma oranını spektrum düzeyinde 0,01 olarak ayarlayın.

Oluşturma işlevini seçilmeden bırakın ve hata toleransını milyonda 15 parçaya ayarlayın. Yanlış bulma oranını proteoform düzeyinde 0,05 olarak ayarlayın. Gelişmiş parametreler altında, açılır menüdeki maksimum kütle kayması sayısı için iki sini seçin.

Bilinmeyen modifikasyonların maksimum kütle değişimini 500 dalton'a ayarlayın. Diğer tüm parametreleri varsayılan değerlerine bırakın ve grafik kullanıcı arabiriminin sağ alt kısmındaki başlat düğmesini tıklatın. Standart protein karışımı için temsili elektropherogram gösterilir.

Standart protein karışımı genellikle ayırma verimliliği ve sistemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için en az yinelenen çalıştırılır. Ayırma verimi bazı proteinlerin teorik plaka sayısı ile değerlendirilebilir. Tekrarlanabilirlik protein yoğunluğu ve göç süresinin göreceli standart sapmaları ile değerlendirilebilir.

CZE MS/MS platformu, çeşitli kompleks proteomlarda proteoformların büyük ölçekli karakterizasyonu için kullanılabilir ve yüksek güven le tek bir çalıştırmada bir E.coli proteomdan 500'den fazla proteoform ve 190 protein tanımlanır. Burada, elektropherogram görünümünde yakınlaştırılmış bir sistemin ayırma penceresi değerlendirmek için kullanılabilir. Çok düşük E-değeri ve spektral FDR proteoform ID.The matched parça iyonlarının yüksek sayıda daha fazla ID'nin yüksek güven gösterir.Bu yordamı çalışırken, yavaş ve yavaşça içine kazınmış ayırma kılcal iplik hatırlamak önemlidir.

Kararlı izotop etiketleme veya etiketsiz yöntemler çeşitli koşullar arasında hücrelerde proteoform bolluk değişiklikleri belirlemek için CZE MS yordamı dahil edilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra yukarıdan aşağıya proteomik alanında araştırmacıların hücrelerdeki çeşitli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde proteoformların rollerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Hidroflorik asitle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve uygun kişisel koruyucu ekipman ve acil durum prosedürlerinin uygulanması gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.