Name: Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Öğrenin, fare karaciğerinden ekstraselüler veziküllerin kolajenaz perfüzyon ve diferansiyel ultrasantrifüjasyon ile izolasyonunu. Bu yöntem, doku mikroçevresini yansıtan veziküller sağlayarak hastalık mekanizmalarının araştırılmasına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Kanser Enstitüsü Grant CA-217833 tarafından finanse edilmiştir.

Hayvanlarla ilgili tüm çalışmalar Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak yapılmıştır.
1. Tezgah Hazırlama
<ol><li>Bir su banyosu hazırlayın ve 37 °C'ye ayarlayın. Diğer gerekli ekipman ve kurulum Şekil1'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Ölçü 100 kollajenaz tip IV mg ve bir su banyosu (40 °C) HBSS 100 mL içeren 125 mL şişe ekleyin. Kollajenazşişedeki sıvıyı girerek çözünmüş olduğundan emin olun ve ayrıca şişenin tamamen su banyosuna batırıldığından emin olun. Daha fazla verimlilik için, kollajenaz anında çözülmek gibi görünse bile en az 30 dakika erimesine izin verin.</li>
	<li>40 °C'deki bir su banyosunda 50 mL HBSS içeren 125 mL'lik bir şişeyi sulayın. Bu ilk yıkama için kullanılacaktır.</li>
	<li>% 70 etanol ile makas ve forceps gibi tüm araçların yüzeyini aşağı sprey. Birkaç temiz pamuklu bez hazırlayın.</li>
	<li>Pompa nın üzerinden %70 etanol çalıştırarak pompanın borularını durulayın ve akan suyla iki kez durulayarak artık etanolleri çıkarın.</li>
	<li>Laboratuvar bankına emici bir tezgah pedi yerleştirin ve üstüne sert bir kutu kabı yerleştirin. Bu fare perfüzyon sırasında herhangi bir aşırı sıvı lar içermek için gerekli olacaktır. Alüminyum folyo ile bir polistiren köpük ped sarın ve konteyner içine yerleştirin.</li>
	<li>Tezgahın yakınına 10 cm'lik steril bir kültür çanağı yerleştirin. Bu perfüzyon tamamlandıktan sonra sindirilmiş karaciğer tutmak için kullanılacaktır.</li>
	<li>Önceden steril bir kültür çanağı içine kollajenaz orta (adım 1.2) 10 mL dökün.</li>
	<li>Kanatlı kan toplama seti kullanarak, pompa boru serbest ucuna 23-gauge bağlayın (kelebek kanül kapalı kanatları kesme daha iyi işleme yol açabilir). Kan toplama kanülünün ucu dolana kadar geçirin.</li>
</ol>2. Hayvan Hazırlığı
<ol><li>Isoflurankullanarak anesteziye başlamadan önce, işlem süresince yeterli miktarda besleme gazı nın mevcut olduğundan emin olun. Oksijeni (O2)indüksiyon odasına 1-2 L'de açın, ardından akış ölçer kullanarak isofluran'ı %2-4 arasında açın.</li>
	<li>Fareyi indüksiyon odasına koyun ve üst kapıyı kapatın. Fareyi bükülene kadar izleyin. NOT: Odadaki gazlar fareleri birkaç dakika boyunca anestezi altında tutar.</li>
	<li>Fareyi alüminyum folyo ile sarılmış polistiren köpük pedüzerine yerleştirin. Akışı indüksiyon odasından nosecone'a çevirin. Anestezinin yeterli olduğundan emin olun. Fare yanıt vermeye başladıysa, tamamen anestezi yapılana kadar burun konisi içinde hafifçe dizginle.</li>
	<li>İşlem sırasında solunum uyup uyarıma yanıt vererek anesteziyi sağlayın. Yeterli anestezi sağlamak için hız akış ölçerini gerektiği gibi ayarlayın. Patiler anestezi altında çimdik testine yanıt vermemelidir. Hayvanların bakımı için laboratuvar rehberinden ek bilgi alınabilir.</li>
	<li>Farenin dört uzvunu da bantlayın veya sabitleyin.</li>
	<li>% 70 etanol ile püskürtme ve gazlı bez ve alkol pedi ile silerek karın üzerinde cilt temizleyin. Bu adım, fare kürkünden kirlenmeyi önlemek için çok önemlidir.</li>
	<li>Steril makas seti kullanarak ön den pelvis kemiğine kadar deri ile geniş bir açık kesim olun. İç organları kesmemeye dikkat edin. Portal ven (PV) ve inferior vena kava (IVC) nazikçe ortaya çıkarmak için hafifçe bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak hayvanın sol tarafına bağırsak yerinden.</li>
</ol>3. Kanülasyon ve Perfüzyon (0.5 saat)
<ol><li>Kavisli forceps kullanarak, portal ven altında bir iplik yerleştirin ve kanülasyon sonra sıkıca cinching hazırlamak için gevşek bir düğüm kravat.</li>
	<li>Kanülleri (kan toplama setinden 23G) ligatür altında portal vene 5-10 mm takın. Kanülilk portal dalı geçmiş eklemeyin, aksi takdirde sağ ön lob yetersiz perfüzyon olabilir. Kanül bir stoper düğümü kullanılarak iş parçacığı ile sabitlenebilir veya sabitlenebilir.</li>
	<li>Düşük akış hızında (1-2 mL/dk) HBSS'ye aşılamak için pompayı çalıştırın. Kanülasyonun başarılı olduğu doğrulandıktan sonra karaciğer beyazletmeye başlayacaktır.</li>
	<li>Basıncı azaltmak ve karaciğer içinde aşırı sıvı drenaj izin IVC kesin. Bu, kanülün taşınmaması için diğer el işleçler kullanılarak en iyi şekilde gerçekleştirilir.</li>
	<li>Akış hızını yavaşça 8 mL/dk'ya yükseltin ve sonraki 5 dk boyunca karaciğer de HBSS'nin 50 mL'lik hacminin tamamını kullanarak perfüzyonu tamamlayın.</li>
	<li>HBSS tükenmeye başlamadan hemen önce orta içeren kollajenazı (adım 1.2) kabın içine değiştirin. Hava kabarcıklarının bulunmadığından ve ortamı değiştirirken karaciğere akmayan dan emin olun.</li>
	<li>Forceps ile kenetlenerek 5 s aralıklarla IVC'ye geçici basınç uygulayın. Bu karaciğer şişmesine neden olur ve doku sindirim ve dissociation (7-8 dk) ile yardımcı olur. Sindirim ilerledikçe, karaciğer şişecek ve beyaz olacak. Karaciğer, orijinal boyutunun yaklaşık iki katı kadar tek tip olarak şişebilir.</li>
	<li>Pompayı kapatın ve sindirim tamamlandıktan sonra kanülçıkarın. Karaciğer sindirim tamamlanması fare nin boyutu na ve karaciğer durumuna bağlıdır. Bir pamuk uçlu aplikatör yavaşça karaciğer probe için kullanılırsa karaciğerde bir ezik görülebilir.</li>
	<li>Karaciğerden safra kesesi çıkarın, onu yırtmak için dikkatli olmak. Yıkanmış bir makas ve forseps kullanarak, yüzey yıkama için fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril 10 cm kültür çanak içine fareden karaciğer ayıklayın. Karaciğeri kollajenaz orta içeren steril 10 cm kültür kabına dikkatlice aktarın (adım 1.8'den). Bu fare kan ve safra kontaminasyonu önlemek için kritik bir adımdır.</li>
	<li>Kapmak ve yavaşça karaciğer hücreleri sallayarak iki temiz forceps ile karaciğer parçalamak. Bu durumda, ortam bulanıklaşır. Tüm hepatositler sarsılabilir, bağ dokusu ve vasküler doku geride bırakarak.</li>
	<li>Karaciğerin sindirilmemiş parçaları sarsılın kadar 3 mL şırınga kullanarak birçok kez hücre çözeltisi triturate. Sindirilmemiş bağ dokusunu filtrelemek için 70 m naylon hücreli süzgeçlerle birlikte 50 mL konik bir tüpe dökün. Kalan hücreleri toplamak ve 50 mL konik tüp doldurmak için HBSS ile çanak yıkayın.</li>
	<li>Santrifüj 50 mL konik boruyu 4 °C'de 10 dk boyunca 50 x g'da sallanan bir kova rotorunda hafifçe yerleştirin.</li>
	<li>Supernatant'ı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
</ol>4. EV Izolasyonu (5 saat)
<ol><li>4 °C'de 10 dk için 300 x g'de süpernatantı santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücre enkazını ve agregalarını temizlemek için 2000 x g'de 4 °C'de 20 dk'da süpernatantı santrifüj edin.</li>
	<li>Supernatant'ı yuvarlak bir alt tüpe aktarın ve supernatant'ı 4°C'de 70 dk için 10.000 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Supernatant toplayın ve 4 °C'de 70 dakika için 100.000 x g bir polikarbonat ultracentrifuge tüp ve santrifüj içine yerleştirin.</li>
	<li>Daha sonra PBS yeniden askıya alınarak yıkanır bir ultracentrifuge tüp pelet toplamak. 4 °C'de 70 dk için 100.000 x g'de süpernatantı daha fazla santrifüj edin.</li>
	<li>Hücresel nanoveziküllerden oluşan son pelet deneyler için doğrudan kullanılabilir veya 1000 μL PBS ile yeniden askıya alınabilir ve -80 °C'de depolanabilir.</li>
</ol>5. İzolasyonların Kalite ve Veriminin Değerlendirilmesi
<ol><li>Nanopartikül izleme analizi veya cihaz üreticisinin protokollerini izleyerek dayanıklı darbe algılamasını kullanarak boyut dağılımını ve konsantrasyonu değerlendirin.</li>
	<li>Belirli deneysel ihtiyaçlara dayalı olarak sakaroz gradyan veya yastık, immünaffinite teknikleri veya boyut dışlama kromatografisi gibi çeşitli yaklaşımlarla spesifik vezikül popülasyonlarının daha fazla izolasyonve saflaştırılmasını gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer%3A+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li>
<li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li>
<li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li>
<li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis%3B+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation%3A+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 (Unit 3.22) (2006).</li>
<li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, portal ven üzerinden iki adımlık perfüzyon işlemi ve ardından diferansiyel ultrasantrifüj kullanılarak hepatik doku EV izolasyonu için optimal ve tekrarlanabilir bir yöntem tanımlanmaktadır. Prosedürün önemli adımları kanül yerleştirme dahil, kollajenaz konsantrasyonu ve sindirim süresi, orta akış hızı, sindirim sonrası doku işleme, ve klasik diferansiyel ultrasantrifüj.
Hücre ayrıştırma kollajenaz tip IV kullanılarak sindirim sonra bağ dokusu bileşenlerinden ayrılması ile elde edilir. Perfüzyon için kullanılan kollajenaz konsantrasyonu 0.1 ila 5 mg/mL arasında olabilir. Doku sindirimi için kollajenaz etkinliğini önemli toplu-to-batch varyasyon olabilir. Kollajenaz konsantrasyonları 0.5 ila 5 mg/mL arasında test edildi, ancak kullanılan konsantrasyon elde edilen EVs verimi üzerinde önemli bir etkisi yoktu. Kollajenaz daha yüksek bir konsantrasyon kullanarak karaciğer daha hızlı şişme ve beyazlatma neden olacaktır. Amaç aşırı kontaminasyon veya hasar olmadan tatmin edici hücre bölünmesi elde etmektir. Bu izolasyonlarda kullanılan kollajenazOptimal konsantrasyonu 8 mL/dk akış hızında 7-8 dk perfüzyon1-2 mg/mL'dir. Çok uzun bir perfüzyon prosedürü karaciğer içinde ince bağ dokusu yok riskini artıracak yanı sıra portal ven veya ven ile hava bindirme iğne delodgment gibi teknik riskleri artıracaktır.
Bu protokolün en zorlu yönü portal ven kanülasyonudur. Bu, özellikle 18-25 g boyutuaralığındafarelerde gerçekleştirmek zor olabilir. Kollajenaz perfüzyon teknikleri başlangıçta sıçanlarda kullanılmak üzere geliştirilmiş ve daha sonra çok sayıda değişiklik ve ayarlamalar sonra farelerde kullanılmak üzere kabul edilmiştir. 23G kan toplama seti kullanılarak kanülasyon küçük luminal çapı kan damarlarında bir kateter yerleştirilmesi daha kolaydır. Bir stoper düğümü ile iplik kullanarak kanül sabitleme yerinden önlemek için tavsiye edilir ve düğüm de kanül damar dan geliyor durumda portal ven konumu bir belirteç olarak hizmet vermektedir.
Downstream analizi için, hücrelerden en az kontaminasyon olması son derece önemlidir. Sindirim sonrası doku kullanımında birkaç önemli husus vardır. İlk olarak, karaciğer kan kontaminasyonunu önlemek için çıkarıldığında forceps ve makas değiştirilir. İkinci olarak, safra kesesi dikkatle karaciğerden yırtılma ve safra istenmeyen kontaminasyon önlemek için kaldırılması önemlidir. Üçüncü olarak, bir kez karaciğer fare den kaldırıldı, karaciğer çok yavaşça herhangi bir kan kaldırmak için PBS kullanılarak yıkanır. Hücrelerle kontaminasyonun en aza indirilmesi, elde edilen EVs veriminde azalmadan daha yüksek bir öncelik verilmelidir.
Ultracentrifugation eVs8,9,10,11izolasyon ve arıtma için en yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Bu yaklaşım hepatositler veya kolanjiyositler ve Kupffer hücreleri, sinüzoidal endotel hücreleri ve yıldız hücreleri gibi parenkimal olmayan hücreler gibi çoğu parenkimal hücreleri ortadan kaldıracak, Buna ek olarak, hücre enkaz, hücre toplama, ve ölü hücreler de olacak diferansiyel santrifüj ile kaldırılır. Veziküler olmayan protein agregalarını veya lipoproteinleri çıkarmak için boyut dışlama kromatografisi ile belirli popülasyonların daha fazla saflaştırılması ve izolasyonu yapılabilir.
Bu protokolün bir sınırlama bazı veziküller perfusat kaldırılabilir olasılığı göz önüne alındığında, tüm doku vezikülleri yakalamak olmayabilir. Küresel bir değerlendirme gerekiyorsa, perfusate içinde perfusate veziküllerin izolasyon ve toplama düşünülmelidir. Bir başka sınırlama hücre hasarı potansiyelidir. Aşırı hücre ölümünün potansiyel etkisini izlemek için, hücre canlılığı izlenebilir ve doku EV izolasyonları için kalite parametreleri içinde dahil edilebilir. Sonuç olarak, bu prosedür portal ven üzerinden iki adımperfüzyon tekniği kullanılarak optimize edilmiş bir iş akışını açıklar ve ardından fare karaciğerlerinden yüksek verimle karaciğer dokusu EVs elde etmek için diferansiyel ultracentrifugation. Bu doku EV'leri, biyomoleküler bileşimin karakterizasyonu ve fizyolojik veya patofizyolojik rollerini veya potansiyel uygulamalarını hastalık belirteçleri olarak tanımlamayı amaçlayan diğer çalışmalar gibi alt akım analizleri için uygundur.

Ekstrasellüler veziküller (EVs) vücutta hücrelerin birçok farklı türde serbest membran bağlı veziküller vardır. EVs RNA, DNA ve protein içeren moleküllerin bir kargo içerir. Bu kargonun bir hücreden diğerine evs tarafından aktarılması, dokular içindeki hücrelerin birbirleriyle iletişim kurduğu bir mekanizma olarak öne sürülecektir1. Normal sağlık ve hastalıklarda EVs kargo veya rolleri ile ilgili bilgilerin çoğunluğu kültür hücrelerinden elde edilen veya dolaşım veya diğer vücut sıvıları toplanan EVs çalışmaları elde edilmiştir2. Vivo onlarınfizyolojik rollerini anlamak için, sağlam bir yöntem EVs tüm popülasyonları yakalar ve hücresel hasar veyakontaminasyon3 önler doku EVs izolasyon için gereklidir. Burada açıklanan yöntemin genel amacı fare karaciğerlerinden doku EVs izole etmektir.
Karaciğerde çoğu hücre tipleri EVs üretmek için gösterilmiştir, ve EV tabanlı sinyal çalışma hepatik hastalıkların temel bilgi ve anlayış ilerliyor. Ancak, dokular içinde farklı hücre tiplerinden EVs kombine etkisi sadece kısmen anlaşılmaktadır. EVs'nin karaciğer dokularından izole edilmesi, EVs'in doku ortamındaki insitu katkılarını anlamak için gereklidir. Burada açıklanan yaklaşım doku bölünmesini artırmak ve hücre hasarını en aza indirmek için iki adımlı perfüzyon dayanmaktadır. Daha sonra, EVs ayrışmış karaciğer dokusundan izole edilir. Hepatositlerin izolasyonu için iki adımlı perfüzyon kullanan yaklaşımlar 1950'lerin başından beri kullanılmaktadır4. Hepatosit izolasyonu için bu yöntemler değiştirilmiş ve sürekli geliştirilmiş ve şimdi kültürlerde hepatosit izolasyoniçin standart yaklaşımlar, hücre süspansiyonlar, ve dokulardan5,6,7. İlk adımda, karaciğer kalsiyumiçermeyen tampon ile bir non-recirculating perfüzyon tabi tutulur, Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS). İkinci adımda, karaciğer desmosomal hücre-hücre kavşakları daha fazla ayrılması için ekstrasellüler matris çözmek için kollajenaz ile perfüzyon. Kollajenaz çözünme için en uygun tedavi süresi 7-10 dakikadır. Tedavinin daha kısa bir süre eksik çözünmeye neden olur ve karaciğerde hücre temasları korumak, daha uzun bir süre karaciğer hasarı veya portal ven bozulmasına neden olabilir ise. EVs sonra hücreleri ve hücresel enkaz kaldırmak için diferansiyel santrifüj kullanılarak izole edilir. Bu, daha fazla akış aşağı analizveya çalışma için kullanılabilecek yüksek verimlerde EV toplama ile sonuçlanır.

<table><tbody><tr><td>125 mL Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher bilimsel</td><td>FB500125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher bilimsel</td><td>FB500125</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli tırtıksız makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14069-12</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Maskeleme bandı</td><td>Ev gereçleri mağazası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Ev malzemeleri mağazası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strafor ped</td><td>Ev malzemeleri mağazası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emici Tezgah Alt Pedi</td><td>Scientific inc.</td><td>B1623</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Dijital Miniflex Pompa</td><td>Cole-parmer</td><td>ZX-07525-20</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Termo Elektron Hassas</td><td>2837</td><td></td></tr><tr><td>Kan alma setleri</td><td>Becton Dickinson</td><td>367292</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı, şeffaf kapak 100x15</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70mm Naylon Hücre Süzgeçleri</td><td>Fisher scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk Uçlu Aplikatörler</td><td>Moore medikal</td><td>69622</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Serolojik Pipet</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Isotec 4 İzofluran Buharlaştırıcı</td><td>BioSurplus</td><td>203-2751</td><td></td></tr><tr><td>O2 gazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Levo Plus Motorlu Pipet Doldurucu</td><td>Scilogex</td><td>74020002</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5804R</td><td>Sigma-aldrich</td><td>22628048</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100 XP</td><td>Beckman</td><td>969347</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Avanti JXN-26</td><td>Beckman</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti Sabit Açılı Rotor</td><td>Beckman</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>JA-25.50Sabit Açılı Rotor</td><td>Beckman</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0028</td><td></td></tr><tr><td>Kapak tertibatlı polikarbonat ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), Ca/Mg içermez</td><td>Fisher bilimsel</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip IV, toz</td><td>Fisher scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Fisher scientific</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

karaciğerden doku ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Ekstrasellüler veziküller (EVs) birçok farklı hücre tiplerinden serbest bırakılabilir ve çoğunda, hepsi olmasa da, vücut sıvılarında saptanabilir. EV'ler, RNA veya protein gibi biyoaktif molekülleri bir hücreden diğerine kapatarak hücreden hücreye iletişime katılabilirler. EVs çoğu çalışmalar hücre kültürü modelleri veya evs vücut sıvıları izole yapılmıştır. Ev'lerin dokulardan izole edilmesine ve fizyolojik süreçlere olan katkılarının ve hastalıkta nasıl değiştirildiklerinin incelenmesine ilgi artmaktadır. Dokulardan yeterli verim ile EVs izolasyon u hücresel hasar olmadan doku bölünmesi ihtiyacı nedeniyle teknik olarak zordur. Bu yöntem, fare karaciğer dokusundan EVs izolasyonu için bir prosedür açıklar. Yöntem, situ kollajenaz sindirim ile başlayan iki aşamalı bir süreç ve ardından diferansiyel ultra santrifüj içerir. Kollajenaz kullanılarak doku perfüzyonu, elde edilen EVs'lerin veriminin artması nedeniyle karaciğer dokusunun mekanik olarak kesilmesi veya homojenleştirilmesi ne kadar avantaj sağlar. KaraciğerDEN EVs izole etmek için bu iki aşamalı sürecin kullanımı doku EVs çalışma için yararlı olacaktır.

Bu izolasyonlar için gerekli olan cihaz standart laboratuvar ekipmanından oluşur ve bu da bunu nispeten basit ve uygun maliyetli bir yaklaşım haline getirir. İzolasyonlar on iki ila otuz haftalık erkek ve dişi Balb/c veya FVB farelerden yapılmıştır. Fareyi tutan tepsi, perfüzyon sırasında fazla sıvı toplayan sert duvarlı bir kabın içinde alüminyum folyo ile kaplıdır. HBSS veya kollajenaz içeren ortam içeren şişeler kullanılmaya hazır bir su banyosuna (40 °C) batırılır. İki steril 10 cm kültür yemekleri kullanılır. Biri PBS ile yüzey yıkama için, diğeri ise bağ dokusu bileşenlerinden hepatosit ayrılması için gereklidir.
Bu yöntemde, karaciğer inferior vena kava dan kanülasyon tercih portal ven yoluyla sürekli olmayan bir şekilde perfüzyon. Alternatif ve yaygın olarak kullanılan perfüzyon yaklaşımı, inferior vena kavasını tutarak ve drenaj için portal damarı keserek retrograd perfüzyon gerçekleştirmektir. Ancak, portal ven kanülasyonu erişmek kolaydır ve karaciğere kısa bir mesafe içerir, portal ven doğrudan karaciğer içine beslenir gibi8. Kanülasyon için bir ekleme noktasının seçimi optimal başarıiçin çok önemlidir (Şekil 2). Kanül mide ve pankreas damarlarının dalları geçmiş ama ilk portal dalı (sağ ve sol hepatik portal venler) ötesinde yerleştirilir. Portal ven içinde optimal ekleme konumu tespit edildikten sonra, kavisli çifenekler portal ven altında bir iplik yerleştirmek ve gevşek bir düğüm bağlamak için kullanılır. Kanül iğnesi, iğnenin düşmesini önlemek için stoper düğümü kullanılarak iplikle sabitlenir.
Şekil 3 karaciğer dokusu EVs izolasyon uğruyor diferansiyel santrifüj için genel işleme şeması özetliyor. Ultracentrifugation hücreleri, enkaz ve diğer kirleri kaldırır. İlk dört santrifüj basamak (50 x g, 300 x g, 2.000 x g, 10.000 x g) hepatositleri, bozulmamış diğer hücreleri, ölü hücreleri veya hücre enkazlarını kaldırmak için tasarlanmıştır. (Şekil 4A ve 4B). Bu adımlardan sonra, ultrasantrifüj tekrar 100.000 x g pelet toplamak için yapılır (Şekil 4C). Pelet PBS'de yeniden askıya atılarak yıkanır ve 100.000 x g'de son bir ultrasantrifüje maruz kalır. Ultracentrifugation sonrası pelet şartlı kültür medyasından EVs ile karşılaştırıldığında bu prosedürde kesinlikle görünür ve viscid. Pipetleme birçok kez herhangi bir kahverengi agrega gözden uzak ve tamamen çözülmüş kadar gereklidir. Son pelet 1000 μL PBS (Şekil4D) ile yeniden askıya alınır. Ultracentrifugation plazmadan kirleri ve diğer çözünür kirleticimaddeleri temizler, bu da fonksiyonel deneysel sonuçları etkileyebilir. Santrifüj 4 °C'de yapılır.
Fare karaciğerinden, bu yöntem nanopartikül izleme analizi (NTA) tarafından belirlenen mL başına ortalama 3,46 x 1012 partikül ile 1,74 ila 4,00 x 1012 arasında değişen bir doku EV konsantrasyonu verir (Şekil5). İzole karaciğer dokusu EVs ortalama boyutu 157.7 nm, 144.5 nm ve EV boyutları 100-600 nm NTA tarafından değişen bir mod boyutu ile oldu. EV verimi karaciğer ağırlığı ve perfusate veya ultracentrifugation adımlar içinde kayıplar gibi faktörlere bağlıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> Şekil 1 : Tezgah hazırlığı. Malzemeler ve konumları şunlardır: (A) pompa, (B) HBSS ve su emme portu içeren 125 mL şişe ısıtılmış, (C) bir Isofluranbuharı bağlı burun konisi, (D) iğne ile bağlanan pompanın su egzoz portu, (E) tepsi içinde alüminyum folyo ile kaplı bir sert duvarlı konteyner ve (F) kollajenaz orta önceden dökülür 10 cm kültür çanak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> Şekil 2 : Kannülasyon sitesi. Fare karın anatomisi gösterilir. Kavisli forceps kullanılarak, portal ven (PV) altına bir iplik yerleştirilir ve gevşek bir düğüm bağlanır. Ekleme yeri karaciğer yakın, ligatür altında 5-10 mm, ancak ilk portal dalı ötesinde değil (sol ve sağ hepatik portal damarlar). Kanül sabit veya stoper düğüm ile iplik kullanılarak sabit. Kanül yerinden ise bu düğüm PV konumunun bir işareti olarak hizmet vermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> Şekil 3 : Santrifüj basamaklarının şeması. Amaç, istenmeyen hücreleri ve diğer bileşenleri kaldırmak ve EVs'leri yalıtmaktır. İlk dört santrifüj adımları hepatositler ve diğer hücreler, ölü hücreler veya hücre enkazdimidiredidial santrifüj kullanarak kaldırmak için tasarlanmıştır. Bu adımlardan sonra, ultracentrifugation 100.000 x g evs pelet toplamak için gerçekleştirilir. Pelet PBS'de yeniden askıya atılarak yıkanır ve 100.000 x g'de son bir ultrasantrifüje maruz kalır. Tüm santrifüj basamakları 4 °C'de gerçekleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> Şekil 4 : Diferansiyel santrifüj. (A) 10 dk için 50 x g santrifüjden sonra hepatosit içeren bir pelet görülür. (B) Hücre enkazLarını temizlemek için 10.000 x g'de 70 dk'lık bir yuvarlak alt tüp santrifüj için kullanılır. (C) 100.000 x g 70 dk için santrifüj için bir polikarbonat ultracentrifuge tüp kullanılır. Pelet bir tüp içinde toplanır ve PBS ile yeniden askıya alınarak yıkanır. (D) Son pelet 1000 μL PBS'de yeniden askıya alınır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> Şekil 5 : Temsili sonuç. Karaciğer dokusu EVs boyutu ve konsantrasyonu nanopartikül izleme analizi (NTA) ile belirlenebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu karaciğerden doku ekstrasellüler (EVs) izole etmek için bir protokoldür. Protokol, kollajenaz perfüzyonunu içeren iki aşamalı bir süreci ve ardından karaciğer dokusu EVs'lerini izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüji tanımlıyor.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Bu yöntem bize yerel doku mikroçevresini temsil eden vezikülkaynağı sağlayarak, in vivo hücre dışı veziküllerin rolü ile ilgili önemli soruları ele almamıza yardımcı olabilir. Doku ortamında ki ekstrasellüler veziküllerin çalışmaları, ekstrasellüler veziküllerin fizyolojik rollerini ve bunların in vivo patofizyolojik süreçlerdeki değişimlerini daha iyi anlamamızı sağlayabilir. Portal ven kanülasyonunun görsel bir gösterimi, damarın küçük boyutu manipüle etmeyi zorlaştırması nedeniyle yararlıdır.Doktor Kaori Ishiguro ile prosedürü gösteren Irene Yan, benim laboratuvar bir araştırma teknoloji uzmanı olacaktır. İşleme başlamadan önce, anestezili farenin uzuvlarını sabitle ve kanatlı kan toplamanın 23 gauge iğnesini şırınga pompası boruparçasının serbest ucuna bağlayın. Farenin karın derisini %70 etanol ve alkol yastığı ile temizleyin ve fareyi göğüs ön kısmından pelvik kemiğe kadar açmak için makas kullanın, iç organlara zarar vermemeye özen gösterdi.Portal ven ve inferior vena kava maruz bırakmak ve portal ven altında bir iplik yerleştirmek için kavisli forceps kullanmak için yavaşça karın boşluğunun sağ tarafına bağırsakları taşımak için bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. Kanülasyondan sonra cinching'e hazırlanmak için dikişe gevşek bir düğüm bağlayın ve kanülü 40 santigrat derece HBSS ile doldurun, ta ki çözelti kanül iğne ucuna ulaşana kadar. Kanülleri bağın 5 ila 10 milimetre altındaportal damara yerleştirin ve kanüle sütüyle sabitleyin.Dakikada bir ila iki mililitre akış hızında infüzyon başlatın. Eğer kanül doğru yerleştirilirse, karaciğer beyazletmeye başlar. Inferior vena kava kesin ve karaciğer içinde aşırı sıvı drenaj sağlar.Önümüzdeki beş dakika boyunca karaciğerde tam 50 mililitre HBSS nüfuz edilene kadar akış hızını yavaş yavaş dakikada sekiz mililitreye yükseltin. HBSS bitmeden hemen önce, taze hazırlanmış 40 santigrat derece kollajenaz dört çözeltiyi perfusate kabına değiştirin ve karaciğerin şişmesine ve doku sindirimine ve ayrışmasına yardımcı olmak için beş saniye aralıklarla inferior vena kava'ya geçici basınç uygulamak için forseps kullanın. Sindirim ilerledikçe, karaciğer şişecek ve beyaz olacak.Bir pamuk uçlu aplikatör ile nazik sondalama sonra depresif kalır, pompa durdurmak ve kanül kaldırın. Karaciğerden safra kesesi çıkarın, safra kesesi dokusu gözyaşı değil dikkatli olmak, ve pbs steril bir 10 santimetre kültür çanak içine karaciğer hasat için temiz makas ve forceps kullanın. Nazik yıkama sonra, taze kollajenaz dört çözüm içeren yeni bir 10 santimetre kültür çanak içine karaciğer transferi ve hafifçe karaciğer dokusundan hücreleri ayırmak için sallayarak karaciğer gözyaşı iki temiz forseps kullanın.Tüm organ parçalandığında, karaciğerin sindirilmemiş parçaları silkelenene kadar doku bulamaç triturate için üç mililitrelik şırınga kullanın. 50 mililitrelik konik tüp içine 70 mikron naylon örgü süzgeç ile ortaya çıkan hücre çözeltisi dökün, kalan hücreleri toplamak için HBSS ile çanak yıkama. Tek hücreli süspansiyon ile yıkama havuzu ve santrifüj ile hepatositkaldırın.Sonra yeni bir 50 mililitrelik tüp için supernatant aktarın. Diğer hücreleri çıkarmak için, yeni bir 50 mililitrekonik tüp içine transfer önce supernatant santrifüj. Başka bir santrifüj ile ölü hücreleri çıkarın ve herhangi bir hücre enkaz ve agregaları kaldırmak için yuvarlak dipli tüp içine supernatant aktarın.Şimdi bir polikarbonat ultra santrifüj tüp içine supernatant aktarın ve ikinci ve son ultra santrifüj için PBS yaklaşık 20 mililitre pelet resuspend. Sonra veziküller hemen analiz edilmezse eksi 80 santigrat depolama için PBS bir mililitre ekstrasellüler nanovezikül pelet resuspend. Tek bir fare karaciğerinden, bu yöntem nanopartikül izleme analizi ile belirlenen mililitre başına 3,46 kez 10 ortalama ile 1,74 ila dört kez 10 arasında değişen bir doku ekstrasellüler vezikül konsantrasyonu verir.İzole karaciğer dokusunun ortalama boyutu hücre dışı veziküller 157.7 nanometre mod boyutu ile 144.5 nanometre ve ekstrasellüler 100 ile 600 nanometre arasında değişen nanopartikül izleme analizi. Bu yaklaşım kullanılarak izole edilen hücre dışı veziküller downstream uygulamaları için uygundur ve daha fazla karakterizasyon elektromikroskopi veya yüzey belirteçleri veya içeriğinin analizi ile morfolojik değerlendirmeler içerebilir.

isolation-of-tissue-extracellular-vesicles-from-the-liver

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, taze veya donmuş dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması tekniği açıklanmaktadır. İzole edilen hücre dışı veziküller, hastalık patogenezindeki önemli rollerini ortaya çıkarmak için daha ileri analizler için kullanılabilir.

Hücre Dışı Vezikül Ekstraksiyonu: Diferansiyel Santrifüjleme Kullanarak Tüm Doku Örneklerinden Hücre Dışı Vezikülleri İzole Etme Tekniği

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

İnsan mitral kapağının protein kompozisyonu halen kısmen bilinmemektedir, çünkü analizi düşük selülarite ve dolayısıyla düşük protein biyosentezi ile karmaşıktır. Bu çalışma, mitral kapak proteomunun analizi için verimli bir şekilde protein çıkarmak için bir protokol sağlar.

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Öğrenin, fare karaciğerinden ekstraselüler veziküllerin kolajenaz perfüzyon ve diferansiyel ultrasantrifüjasyon ile izolasyonunu. Bu yöntem, doku mikroçevresini yansıtan veziküller sağlayarak hastalık mekanizmalarının araştırılmasına yardımcı olur.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Daha fazla video keşfet