Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Bu yöntem biyopestisit alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, nasıl çift iplikçik RNA etkisi gen ekspresyonu gibi, ve yetişkin dipterans fecundity. Bu tekniğin en büyük avantajı çift iplikçikRna ölçülebilir dozlarda sivrisinek veya sinek teslim olmasıdır, ve çok nesilli öldürücülük üzerinde ortaya çıkan etkiler daha sonra değerlendirilebilir. Bu yöntem sivrisinek, aedes aegypti ve ev sinek, musca domestica için sunulan rağmen, aynı zamanda sivrisinek ve sinek diğer türler için uygulanabilir.

Enjeksiyon prosedürü kendisi mastering bir zaman yatırımı olduğu için genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek. Her bir insecte en uygun iğne ucu boyutu enjekte ederken yaralanma ve mortaliteyi en aza indirirken doğumu sağlamak için çok önemlidir. Başlamak için, sivrisineği dikkatlice sahnelemek için forceps kullanın, böylece yaklaşık yarım santimetre arayla bir mikroskop kaydırağında açığa çıkanlar olur.

Slayt işlemeye yardımcı olmak için, bir tanesini salının solunda veya sağ ucunda bir buçuk santimetrelik bir alana bırakın. Sonra büyük bir petri kabına dört derece santigrat sahnelenen böceklerin slayt yerleştirin. Bir chill table üzerinde bir diseksiyon mikroskop ve mikroenjektör ayarlayın.

Cam kılcal damarları ince bir uca çektikten sonra, kılcal iğneyi mikroenjektöre yerleştirin ve iğne ucunu forceps ile kırın. Daha sonra çekirdeği üç kez çıkararak ve çıkararak iğneyi durulayın. Cam iğne açma boyutları sivrisinek ve ev sinekleri arasında değişir unutmayın.

Sonra, sivrisinekler için uygun bir konsantrasyon ile bir enjeksiyon çözeltisi hazırlamak. Görselleştirmeye yardımcı olmak için çözeltiye Rhodamine B'nin mililitresine üç mikrogram ekleyin. Temiz bir yüzeye çözelti 3-4 mikrolitre aktarmak için bir pipet kullanın ve herhangi bir hava almadan cam iğne içine çizin.

Sıvı iğneden çıkmaya başlayana kadar enjekte düğmesini tekrar tekrar bastırın. Sıvı menisküsten iğne sapına kadar yaklaşık bir milimetre arayla karma işaretler çizmek için ultra ince nokta işaretleyicikullanın. İğne altında sivrisinek slayt ayarlayın ve görüş alanı iğne çözeltisi menisküs görmek için yeterince geniş olduğundan emin olun.

İğneyi mezocarape sternumun üçte birinin ortasıyla hizala. Sivrisineğin karşı tarafına yerleştirilen pifonlar ile iğneye karşı destekle ve iğne ucuyla miğkülü hafifçe delin. Ucu orta hattan geçene kadar iğneyi yavaşça sivrisineğin içine doğru kaydırın.

İstenilen miktarda sıvı enjekte edilene kadar enjekte düğmesine basın. Menisküs hareket etmezse, yavaş yavaş sivrisinek slayt veya menisküs hareketi için izlerken iğne sinek. İğne alındıktan sonra iğnenin bir kısmı kütikülden çıkarılan çözeltinin bir kısmı veya menisküs hareket etmezse, enjeksiyon başarılı olmadığı için böceği atın.

Ev sinek, mezopleuron ile iğne hizalamak. Sineğin karşı tarafına yerleştirilen tersiyle sineği iğneye karşı hazırlayın ve iğne ucuyla miğkülü hafifçe delin. Enjekte edilen böcekleri 10 ila 15'erli gruplar halinde 3,5 ons tutucu bardakları temizlemek için aktarın.

Sonra ağ ile fincan kapağı ve onları oda sıcaklığında kurtarmak için izin verin. Böcekler iyileştikten sonra, %10 sakaroz çözeltisine batırılmış bir pamuk kürenin üzerine tutucu bardağı ters çevirin. İlk olarak, taze kan ile 12 inç yapay membran doldurun ve sıcak su banyosunda 60 santigrat dereceye ısıtın.

Bir kağıt havlu ile membran kuru ve tutma fincan ağ kapağı boyunca yatıyordu. Sivrisinekler besledikten sonra, pamuk topun yerini ve sivrisineklerin 24 saat dinlenmesini bekleyin. Daha sonra, deiyonize su yaklaşık 30 milimetre ile net 3,5 ons biyo asetat bardak doldurarak oviposition bardak inşa.

Sonra bardağın altına tohum çimlendirme kağıt bir parça yerleştirin. Ağ ile fincan kapağı ve ağ kapağı küçük bir yarık kesti. 24 saat beslendikten 24 saat sonra, tutucu bardağın kapağına küçük bir yarık kesin ve başarılı bir şekilde yumurtalık kaplarına beslenen dişileri transfer edin.

Sonra% 10 sakaroz doymuş pamuk topu ile oviposition kap küçük yarık mühür. Sivrisinekleri izleyin ve günlük mortaliteyi takip edin. Sivrisinekler beş ila yedi gün oviposit izin sonra, bir diseksiyon mikroskop altında yumurta saymak.

Prosedürü gösteren Dr Christopher Geden, bir USDA ARS Araştırma Entomolog olacaktır. Enjeksiyondan üç gün sonra sinekleri karbondioksitle anestezi edin. Sonra su ve hazırlanan sinek diyet ile temiz bir kafese sinek aktarın.

Ölüm verilerini kaydedin ve her gün ölü sinekleri çıkarın. Daha sonra, larva yetiştirme ortamını hazırlamak için %75 buğday kepeği ile %25 peletli canlı hayvan yemi ağırlıkla karıştırın. % 62 nem elde edilene kadar karışıma su ekleyin.

Siyah bir bez bir kare için nemlendirilmiş buğday kepeği canlı hayvan yem karışımı ekleyin ve bir top haline rulo. Bezin yerinde kalmasını sağlamak için lastik bir bant kullanın ve sıvı ortam sızana kadar hafifçe sıkın. 60 mililitrelik bir fincan topu yerleştirin ve beş saat boyunca sinek kafesi yerleştirin.

Bundan sonra, yumurtaların bezin kıvrımlarının altından alınmasını sağlayarak yumurtaları toptan durulayın. Herhangi bir kümeleri bozmak için yumurta çalkalayın ve mezun 20 mililitrelik santrifüj tüp aktarın. Yumurta yerleşmek için izin verin ve tüp yerleşmiş yumurta hacmine dikkat edin.

Daha sonra 20 kat yerleşmiş yumurta hacmi hacmi getirmek için yeterli su ekleyin. Sonra, su ve yumurta süspansiyon karıştırmak için bir manyetik karıştırma çubuğu kullanın. Son olarak, bir dizi hat halinde önceden nemlendirilmiş siyah bir bez parçasına 0,5 mililitre süspansiyon dağıtmak için değiştirilmiş bir pipet ucu kullanın.

Bu protokolde, dişi sivrisinekler gen ekspresyonunu değerlendirmek için mikro enjekte edildi. Dişilere çift iplikli RNA enjekte etmek, birden fazla ovipozisyon döngüsü boyunca göreceli ifadede önemli azalma göstermiştir. İlk gonotrofik döngüde sivrisineklerde ortalama debriyaj boyutları hem dsRPS6 hem de dsRPL26 tedavi edilen gruplar için önemli ölçüde azaltıldı.

DSRPS6'yı bir mikrogramdan 50 nanograma dişi sivrisineklere enjekte ederken debriyaj boyutlarında belirgin bir doz etkisi gözlenmiştir. Ev sineklerine de beş mikrogram çift iplikçikli RNA yapısı enjekte edildi. Sivrisinek gözlemlerine benzer şekilde, hem özel transkript ekspresyonunda hem de debriyaj boyutunda önemli bir azalma kaydedildi.

Bu prosedürü çalışırken, başarılı bir şekilde enjekte edilmedi böcekleri atmak için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü kullanarak, herhangi bir çift iplikçik RNA yapı veya diğer biyorasyonel sivrisinek veya sinekteslim edilebilir. Cam iğnelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve her zaman uygun keskin liklerde atık kaplara atılması gerektiğini unutmayın.