Name: Sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi Vitro tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Öğrenin, soğuk atmosferik plazma ile sinir kök hücrelerinin tek adımlı farklılaşmasını nasıl artıracağınızı. Bu yöntem, Parkinson hastalığı gibi nörolojik hastalıkların tedavisinde umut vadediyor.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Huazhong Akademik Program, Huazhong Üniversitesi bilim ve teknoloji (No. 2018KFYYXJJ071) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NOS 31501099 ve 51707012) bağımsız yenilik Fonu tarafından desteklenmiştir.

1. hücre kültürleri ve Predifferentiation
<ol><li>
Nöral kök hücre kültür ve predifferentiation
	<ol>
<li>Poli-D-lizin-kaplı coverslips hazırlayın. Steril coverslip (20 mm çapında) 12-şey plaka koymak. Poli-D-lizin, % 0,1 w/v, su (Malzemeler tablo) ile kapak cam coverslips üzerinde daha iyi hücre adezyon için sonraki adımları izleyerek kat. Not: Her hücre kültürünü ve uygulama için en uygun koşulları belirlenmelidir.<ol>
<li>Aseptik poli-D-lizin, % 0,1 w/v, su ile coverslip yüzey kat. Rock yavaşça coverslip yüzey bile bir kaplama emin olmak için.</li>
			<li>Sonra geceleme (~ 12 h) 37 ° C'de kültür, poli-D-lizin çözümü kaldırmak ve yüzey 3 durulayın x 1 mL steril su ile.</li>
			<li>Hücreleri en az 30 dk onları tohum önce kuru.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSC) kültür ve predifferentiation
	<ol>
<li>C17.2-NSCs Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS), % 5 at serum (HS) ve % 1 penisilin/streptomisin 37 ° C ve % 5 CO2 ~ 2-3 d için takıma bir 25 cm2 şişesi içinde kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri % 85 izdiham ulaştığınızda, orta kaldırmak, PBS 1 mL hücrelerle yıkama ve taze tripsin (% 0,25) 1 mL şişe ekleyin. 1 dakika bırakın; daha sonra kültür orta 1 mL şişe ve pipet yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon emin olmak için birkaç kez ekleyin.</li>
		<li>Bir hemasitometre kullanarak süspansiyon hücrelerde yoğunluk saymak. 2 x 104 hücre/mL son hücre konsantrasyon vermek için hücre süspansiyon gerekli hacmi hesaplamak.</li>
		<li>C17.2-NSCs 12-şey plaka ~ 2 x de başına 104 hücre yoğunluğu ile kaplı coverslips üzerinde tohum. Mikroskop altında hücre yoğunluğu kontrol edin. Not: daha iyi bir sonuç için optimum hücre yoğunluğu ayirt deneme önce belirlenmesi gerekir.</li>
		<li>Bir hücre kuluçka için eki için izin vermek 12 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreler 2 ek sonra yıkayın x 1 mL PBS ile ve hücrelerin plazma tedavi öncesi 48 saat için %1 N2 eki ile DMEM/F12 oluşan farklılaşma orta ile yetiştirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Birincil sıçan nöral kök hücre kültür ve predifferentiation
	<ol>
<li>Sıçan NSC büyüme aracı olarak kaplamasız T25 şişeler 5 x 105 hücre yoğunluğu, birincil fare NSC süspansiyon kültür. Not: Birincil fare NSCs Xie vd. protokol sonrası izole 9.</li>
		<li>Ters bir mikroskop altında neurospheres oluşumunu kontrol edin. Neurospheres morfoloji küresel ve şeffaf çok hücreli kompleksleri sergileyen emin olun.</li>
		<li>Neurospheres 3 mm veya daha büyük bir çap ulaştığınızda, bir 15 mL steril santrifüj tüpü ve yerçekimi tarafından neurospheres razı olsun neurosphere süspansiyon aktarın.</li>
		<li>Neurospheres orta hacmi en az çok dikkatli bir şekilde bırakmak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Durulama neurospheres 1 x 5 mL de PBS ve neurospheres yerleşmek yerçekimi tarafından izin ile. PBS bir asgari miktar bırakmak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Farklılaşma orta ~ 12-15 neurospheres mililitre başına için hücre yoğunluğunu ayarlamak için uygun birim ekleme. Farklılaşma orta birincil fare NSCs için DMEM/F12, %2 B27 ve % 1 oluşan FBS.</li>
		<li>Tohum neurosphere süspansiyon kaplamalı her coverslip 12-şey plaka üzerine 1 mL. Not: hafifçe neurospheres eşit olarak dağıtılır sağlamak için plaka sallamak. Daha iyi bir ayirt sonuç için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Plaka da kuluçka yerleştirin ve plazma tedavi öncesi 24 h için predifferentiate sağlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. plazma jetlerin hazırlanması
<ol><li>Bir iç çapı 2 mm ve bir dış çapı 4 mm. ile bir yarı-açık kuvars tüp takın bir yüksek gerilim tel çapı 2 mm ile tüpün içine seçin.</li>
	<li>Kuvars tüp yüksek gerilim tel ile 5 mL şırınga yerleştirin ve bir tutucu şırınga merkezi içinde bağlamak için kullanın. Kuvars tüp kapalı sonu ve şırınga ucu arasındaki mesafe 1 cm ayarlamak.</li>
	<li>Açık belgili tanımlık tenkıye sonuna kadar bir 1 m silikon kauçuk kanal (ile bir iç çapı 12 mm) bağlanmak ve sonra sırayla için akış ölçer ve gaz vanası bağlayın.</li>
</ol>3. Jets edinimi
<ol><li>Devre Şekil 1' de gösterildiği gibi bağlayın. Güç kaynağının çıkış tel plazma jeti cihaza bağlayın ve yüksek gerilim sonda ucu gerilim algılamak için çıkış kabloyla bağlayın. Çıkış voltajı bilgileri kaydetmek için osiloskop yüksek gerilim sonda diğer ucunu bağlayın. Tüm devre kontrol ve güç kaynağı, osiloskop ve yüksek gerilim probu tüm cezalısın emin olun.</li>
	<li>Gaz hattı kontrol edin. Tüp gaz plazma jeti aygıta bağlı olduğundan emin olun; o zaman, gaz vanası helyum (birim kesir, % 99.999) ve oksijen (birim kesir, % 99.999) açın ve gaz akışı 1 L:0.01 L/dk (o: O2) ayarlayın. Not: ilk kez güç kaynağı açmadan önce birkaç dakika için gaz akışı sağlar.</li>
	<li>Darbe genlik, frekans ve darbe genişliği 8 olarak ayarla kV, 8 kHz ve 1600 ns, anılan sıraya göre. Devre yeniden denetleyin ve ardından, bir plazma jet oluşturmak için Çıkış düğmesini açın. Uyarı: yüksek gerilim tel herhangi bir zamanda dokunmayın.</li>
</ol>4. nöral kök hücre tedavisinde plazma
<ol><li>Şırınga meme ve hücre iyi deliğe 15 mm arasındaki mesafeyi ayarlayın. Not: 12-şey plaka yerleştirildiği platformu alttan mesafe ölçülür.</li>
	<li>12-şey plaka kuluçka makinesi dışarı alın ve orta predifferentiated hücrelerinin taze farklılaşma orta 800 µL için değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri üç gruba ayırın: bir tedavi edilmemiş kontrol grubu, 60 s o ve O2 (% 1) gaz akışı tedavi grup ve 60 s plazma tedavi grup. Not: Hiçbir belirgin sıvı kaybı tedavi koşul altında vardır.</li>
	<li>12-şey plaka plazma jetlerin altında yer, her deliğin ortasına şırınga başlık sabit olduğundan emin olun ve farklı gruplara 4.3 adımda belirtilen ilgili tedavi vermek. Not: Tek tip tedavi koşulları sağlamak için deneysel bir işlem sırasında farklılaşma Orta oda sıcaklığında tedavi edilmezse denetimleri tutuldu. O ve O2 (% 1) gaz akışı tedavi grubunda yalnızca bir o ile tedavi edildi ve O2 (% 1) gaz akışı, plazma üretimi olmadan. Tüm tedaviler nüsha gerçekleştirilmelidir.</li>
</ol>5. sinirsel kök hücre farklılaşması
<ol><li>Tedavi sonra özgün kültür kaldırın ve her şey için yeni farklılaşma orta 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka 6 için kuluçkaya ö değiştirmek orta her geçen gün.</li>
	<li>Her gün bir ters faz kontrast ışık mikroskobu altında farklı grupların ayırt etme durumunu denetleyin. Rastgele en az 12 alanları seçin ve morfolojik değişiklikleri kaydetmek için fotoğraf çekmek.</li>
</ol>6. ayirt boyama
<ol><li>
Durulama
	<ol>
<li>Hücre inkübatör dışında örnekleri ve orta aspirasyon tarafından sökün. Durulama hücreleri 1 x 1 mL PBS ile. Not: farklılaşma sonra hücreleri kolayca ayrılır. Hücreleri dışına yıkama önlemek için kültür wells tarafındaki PBS eklemek gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fiksasyon
	<ol>
<li>Hücreleri 500 µL % 4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 20 dakika ile düzeltmek. Fiksasyon sonra yavaşça hücreleri 3 durulama x 1 mL kalan % 4'paraformaldehyde kaldırmak için PBS, 5 min her, ile. Not: Hücre fiksasyon için en uygun zaman noktası hücre tiplerine göre belirlenmelidir. Fiksasyonun sonra PBS 1 mL kültür wells taraftan ekleyin ve 5 min için tablo örnek bırakmaktır. Bir laboratuar shaker en az bir hücre kaybı sağlamak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Permeabilization
	<ol>
<li>Örnekleri % 0,2 ile permeabilize TritonX-100 oda sıcaklığında 10 dakika için PBS içinde. Permeabilization sonra üç kez, 5 min her için 1 mL PBS yavaşça hücrelerle durulayın. Not: Cep permeabilization için uygun zaman noktası hücre tiplerine göre belirlenmelidir. Permeabilization sonra 1 mL PBS kültür wells, yan eklemek tablo 5 min için örnek bırakın. Bir laboratuar shaker hücreleri en az kaybı sağlamak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Engelleme
	<ol>
<li>1 mL % 10 keçi serum PBS içinde her örnek için eklenir ve örnek spesifik olmayan herhangi bir etkileşimi engellemek 1 h için masaya bırakılır. Not: bir laboratuvar shaker slayttan ayırma hücreleri önlemek için kullanmayın. Bir durulama Bu adım gerekli değildir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kuluçka birincil antikor ile
	<ol>
<li>Birincil antikor seyreltme tampon kullanarak birincil antikor sulandırmak. Not: en iyi sonuçlar için birincil antikor son seyreltme oranı öntest tarafından belirlenmelidir. Anti-testin (için farklılaşmamış kök hücre), seyreltme oranları anti-β-tübülin III (nöron için) anti-O4 (için oligodendrocyte), anti-NF200 (için olgun nöronlar), Anti-sohbet (için kolinerjik nöronlar), anti-LHX3 (için motor nöronlar), anti-GABA (için GABAergic nöronlar), anti-serotonin (için serotonerjik nöron) ve anti-TH (için dopaminerjik nöron) are 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 ve 1: 100, anılan sıraya göre.</li>
		<li>Seyreltilmiş birincil antikorların 300 µL farklı örnekleri için geçerlidir.</li>
		<li>Gecede 4 ° C'de hücre örnekleri kuluçkaya Not: Bu 4 ° C'de arka plan ve nonspesifik boyama azaltmak için birincil antikorlar kuluçkaya önerilir.</li>
		<li>Birincil antikorlar kaldır ve yavaşça hücreleri 3 durulayın x 1 mL PBS ile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kuluçka ikincil antikor ile
	<ol>
<li>Cy3-Birleşik veya Alexa Fluor 488 Birleşik ikincil antikorlar % 3 keçi serum içinde PBS kullanarak sulandırmak. Not: en iyi sonuçlar için ikincil antikor son seyreltme oranı öntest tarafından belirlenmelidir.</li>
		<li>Her birincil antikor algılamak için ilgili ikincil antikorların 300 µL uygulanır. Not: Sonraki adımlar floresans Şoklama önlemek için karanlıkta gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
		<li>Hücre örneği içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.</li>
		<li>İkincil antikorlar kaldırmak ve PBS 1 mL oda sıcaklığında 10 dakika hafifçe hücrelerle durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nükleer boyama
	<ol>
<li>500 µL Höchst 33258 çalışma çözüm hücre örnek sokmak için geçerlidir.</li>
		<li>Hücre örnek çekirdeklerin etiketlemek için oda sıcaklığında 8 min için karanlıkta kuluçkaya.</li>
		<li>Nazikçe yıkayın hücreleri 3 x 1 mL PBS, 10 min her, ile korunan ışıktan. Not: hücreleri en az kaybı için en iyi çamaşır koşulu ampirik olarak belirlenmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaj
	<ol>
<li>Montaj orta bir damla microslide ortasına yerleştirin.</li>
		<li>Cımbız kullanarak coverslips dışında (örnekler ile) almak ve dikkatli bir şekilde örnek montaj orta üstüne getirin. Hava kabarcıkları kaçının.</li>
		<li>Emici kağıt ile her aşırı montaj ortam kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Floresans mikroskobu gözlem
	<ol>
<li>Höchst 33258, Alexa Fluor 488 ve Cy3 için filtre ile donatılmış floresans mikroskobu altında örnekleri gözlemlemek. Her örnek için rasgele bir kamera ile en az 8-12 alanları ve kayıt görüntüleri seçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li>
<li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases%3A+dreams+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).</li>
<li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Physics+and+Controlled+Fusion%22%5BJournal%5D)">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).</li>
<li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+Plasma%3A+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li>
<li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure%3A+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li>
<li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Treatment+of+Onychomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li>
<li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huazhong+University+of+Science+and+Technology.+%5BMed+Sci%5D%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li>
<li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fixatives+for+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

C17.2-NSCs olan bir tür ölümsüzleştirdi nöral kök hücre satırı yenidoğan fare serebellar taneli katman hücrelerden, Snyder ve diğerleri tarafından geliştirilen10,11. C17.2-NSCs nöronlar, astrocytes ve oligodendrocytes ayırabilir ve nörolojik12' yaygın olarak kullanılmaktadır. Bizim önceki çalışmada, CAPs C17.2-NSCs farklılaşma nöronların içine geliştirmek. Bir kanıt prensibi çalışma da birincil fare NSCs kullanılarak gerçekleştirilmiştir v...

NSCs yönlendirilmiş farklılaşma doku ulaşım için belirli bir soy içine nörodejeneratif ve neurotraumatic hastalıkları1için en umut verici tedavilerin biri olarak kabul edilir. Örneğin, catecholaminergic dopaminerjik nöron özellikle Parkinson hastalığı (PD) tedavisinde istenen. Ancak, istediğiniz hücreleri taşıma için hazırlamak için geleneksel yöntemlerle kimyasal toksisitesi, yara oluşumu veya büyük ölçüde engellemektedir rejeneratif tıp2NSCs uygulamalarda diğerleri gibi birçok sakıncaları vardır. Bu nedenle, bir roman ve güvenli bir şekilde NSC farklılaşma için bulmak çok gereklidir.
Plazma konularda, aşağıdaki katı, sıvı ve gaz dördüncü durumudur ve bu konularda tüm evrenin % 95'den fazla teşkil eder. Plazma ilişkisiz pozitif/negatif ve tarafsız parçacıkları ile elektriksel olarak nötr ve genellikle yüksek gerilim deşarj Lab tarafından oluşturulur. Son yirmi yılda, biyomedikal plazmada uygulanması soğuk atmosferik basınç plazma teknoloji geliştirme dünya çapında büyük dikkat çekti. Bu teknik sayesinde istikrarlı düşük sıcaklık plazma ark oluşumu olmadan atmosferi çevreleyen havasında oluşturulacak ve reaktif nitrojen türler (RNS), reaktif oksijen türleri (ROS), ultraviyole (UV) gibi çeşitli reaktif türler oluşur radyasyon, elektronlar, iyonlar ve elektrik alanı3. Kapaklar mikro-organizma inactivation, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, cilt hastalıkları, hücre çoğalması ve hücre farklılaşması4,5,6,7tedavisi için benzersiz avantajları vardır. Önceki çalışmalarda, biz soğuk atmosferik plazma jet NSCs farklılaşma fare nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSCs) ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirebilirsiniz yönettiği için güçlü bir araç olmak için büyük bir potansiyele sergilenmesi gösterdi NSCs8farklılaşma. CAP geliştirme NSC farklılaşma mekanizması henüz tam olarak anlaşılmaktadır değil, ancak Hayır kapaklar tarafından oluşturulan sürecinde önemli bir faktör olduğu ortaya çıktı. Bu çalışmada, biz bir atmosfer basıncı helyum/oksijen plazma jeti NSCs vitro, hücre hazırlık ve Önarıtma, morfoloji gözlem tarafından ters mikroskop, tedavisi için kullanmanın ayrıntılı bir deneysel protokol sağlamayı amaçlamaktadır ve floresans mikroskobu gözlem ayirt boyama.

<table><tbody><tr><td>Lamel</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ortamı</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td><td>, 4 & derece; C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 orta</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>, 4 > C</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>-20 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>-20 ° C'de saklanır; C ve -</td></tr><tr>20 ° C'de saklanan<td>Fetal sığır serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03'ten</td> koruyun<td>; C, tekrarlanan donma ve çözülmeyi önleyin</td></tr><tr><td>Donör At serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30074.03</td><td>-20 °C'de tored ; C,</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>4 ° C'de saklanarak tekrar tekrar dondurulmasını ve çözülmesini önleyin; C</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>HyClone</td><td>25300054</td><td>4 derece'de saklanır; C</td></tr><tr><td>PBS çözümü</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>, 4 > C</td></tr><tr><td>% 4 paraformaldehit</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>-20 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu Engelleme Çözeltisi</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>S-1000-20</td><td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>anti-Nestin</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td><td>-20 °C'de saklanır; C, tekrarlanan donma ve çözülme</td></tr><tr><td>anti-&betasından kaçının;-Tubulin III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>-20 ° C'de saklanır; C,</td></tr><tr><td>anti-O4</td> R<td>& D Sistemleri</td><td>MAB1326</td><td>-20 ° C'de saklanır; C,</td></tr><tr>-20 ° C'de saklanan<td>anti-NF200</td><td>Sigma'nın</td><td></td> tekrarlanan dondurulmasını ve çözülmesini önleyin<td>; C,</td></tr><tr>-20 ° C'de saklanan<td>anti-ChAT</td><td>Sigma'nın</td><td></td> tekrarlanan donmasını ve çözülmesini önleyin<td>; C,</td></tr><tr>-20 ° C'de saklanan<td>anti-LHX3</td><td>Sigma'nın</td><td></td> tekrarlanan donmasını ve çözülmesini önleyin<td>; C,</td></tr><tr>-20 ° C'de saklanan<td>anti-GABA</td><td>Sigma'nın</td><td></td> tekrar tekrar dondurulmasını ve çözülmesini önleyin<td>; C,</td></tr><tr>-20 ° C'de saklanan<td>anti-Serotonin</td><td>Abcam, Cambridge, MA'nın</td><td></td> tekrarlanan donmasını ve çözülmesini önleyin<td>; C,</td></tr><tr>-20 ° C'de saklanan<td>anti-TH</td><td>Abcam, Cambridge, MA'nın</td><td></td> tekrarlanan donmasını ve çözülmesini önleyin<td>; C, tekrarlanan donma ve çözülmeyi önleyin</td></tr><tr><td>İmmünol Boyama Birincil Antikor Seyreltme Tamponu</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Cy3 Etiketli Keçi Anti-Tavşan IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>-20 °C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- Etiketli Keçi</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>-20 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>Anti-Fare IgG & nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 şişe</td><td>corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>-20 °C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>-20 ° C'de saklanır; C ve ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Nanjing Jiangnan Yeni Optik Şirketi</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek ve ndash; voltaj Güç Amplifikatörü</td><td>Yönlendirilmiş Enerji</td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>DC güç kaynağı</td><td>Spellman</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td>Fonksiyon Jeneratörü Aligent</td><td>&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Tektronix</td><td>DPO3034</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek gerilim probu</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi vitro tarafından

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Fiziksel plazma teknoloji, soğuk atmosferik plazmasının (CAP) yaygın olarak araştırdık gibi dekontaminasyon, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, kök kanal tedavisi, vb, yeni bir araştırma alanı oluşturan plazma tıp adında. Elektrik, kimyasal ve biyolojik reaktif türlerin bir karışımı olarak, kapaklar her iki vitro sinir kök hücre farklılaşması geliştirmek için yeteneklerini göstermiştir ve vivo içinde ve are olma nörolojik hastalık tedavisi için umut verici bir yol gelecekte. Çok daha heyecan verici haber büyük harfler kullanarak tek adımlı farkında olmayabilir ve güvenli bir şekilde yönettiği, sinir kök hücreleri (NSCs) ayrımında doku ulaşım için olduğunu. Biz burada detaylı Deneysel protokol NSC farklılaşma C17.2-NSCs ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirmek için kendini yetiştirmiş bir kap jet aygıtı kullanarak hem de hücre kaderi ile ters gözlemleyerek ve floresan mikroskopi göstermek. Teknoloji boyama ayirt yardımıyla daha işlenmemiş grubu hızlandırılmış bir Diferansiyel oranı gösterdi her iki NSCs bulduk ve ~ %75-in NSCs seçmeli olarak esas olarak Olgun, kolinerjik ve motor nöronların farklı nöronlar.

Hücre morfolojisi ters mikroskop altında her gün kap tedavi sonrasında görülmüştür. Şekil 2 , her iki hücre hatlarında sıradan ters faz kontrastlı ışık mikroskobu görüntüler hücre farklılaşma göstermektedir. Plazma tedavi grubu bir hızlandırılmış farklılaşma oranı ve denetim ve gaz akışı grubuna kıyasla yüksek farklılaşma oranı sergiler.
C17.2-NSCs ve birincil fare NSCs tedavi göst...

Bu iletişim kuralı bir soğuk atmosferik plazma tedavisinin ayrıntılı deneysel adımlar sinir kök hücreleri ve farklılaşma Geliştirme için ayirt algılama sunmayı amaçlamaktadır.

Sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi Vitro tarafından

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Bu yöntem in vitro nöral kök hücrelerin farklılaşmasını artırmak ve Parkinson hastalığı gibi nörolojik hastalıkların tedavisine katkıda bulunma potansiyeline sahiptir. Bu tekniğin en önemli avantajları, doku nakli için nöral kök hücrelerin güvenli yönlendirilmiş farklılaşması için soğuk atmosferik plazmaların tek adımda uygulanabiliyor olmasıdır. Soğuk atmosferik plazma kısa bir tedavi süresi içinde nöral kök hücre farklılaşmasını artırabilir.Ve hücrelere daha fazla hasar ihtiyacı ile, transplantasyon için istenilen hücreleri sağlayan. 25 santimetre karelik bir şişede beşinci murine nöral kök hücreleri yaklaşık beş kez on tohumlama ile başlayın. 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit 2-3 gün boyunca tam DMEM beş mililitre içerir.Hücreler %85'lik biraraya geldiğinde, kültürü bir mililitre PBS ile yıkayın. Tedaviden önce, bir dakika için yüzde 25 tripsin bir mililitre ile. Hücreler ayrıldığında, bir mililitre kültür ortamıyla reaksiyonu durdurun.Ve pipet birkaç kez tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için. Saydıktan sonra, mililitre konsantrasyonu başına dördüncü hücrelere iki kez on hücreleri seyreltin. 12 hücreli kültür plakasının dokuz kuyuda bir poli-D-lizin kaplı kapak üzerine bir mililitre kök hücre tohumu.Hücre yoğunluğunu mikroskop altında kontrol edin. Ve hücreleri 12 saat boyunca kuvöze geri ver. Hücreler bağlandığında, kapak fişlerini yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 48 saat boyunca farklılaşma ortamıyla tedavi edin.Jet alımı için, önce güç kaynağının çıkış kablosunu plazma jet cihazına bağlayın. Ve gerilimi tespit etmek için çıkış teli ile yüksek gerilim sondasının ucu. Daha sonra çıkış geriliminden gelen bilgileri kaydetmek için yüksek gerilim probunun diğer ucunu osiloskopa bağlayın.Güç kaynağının, osiloskopun ve yüksek gerilim sondasının topraklı olduğundan emin olmak için tüm devreyi kontrol edin. Ve gaz tüpünü plazma jet cihazına bağlı olduğundan emin olmak için gaz hattını kontrol edin. Daha sonra, helyum ve oksijen gaz vanaları açın ve oksijen helyum dakikada 01 litre bir litre gaz akışını ayarlayın.Devreyi tekrar kontrol edin ve plazma jeti oluşturmak için çıkış düğmesine basın. Plazma nöral kök hücreleri tedavi etmek için, şırınga meme ve hücrelerin ilk kuyu arasındaki mesafeyi ayarlamak 15 milimetre. Nöral kök hücre kültürlerinde supernatants taze farklılaşma ortamı 800 mikrolitre değiştirin.Ve tabağı plazma jetlerin altına yerleştirin. Şırınga nozulunun her kuyunun ortasına sabitolduğundan emin olun. Tedavi başına 60 saniye plazma ile üç kuyu ve tedavi başına 60 saniye için yüzde helyum ve oksijen gazı ile üç kuyu oluşturun.Kontrol olarak üç kuyuyu tedavi edilmezse bırakmak. Daha sonra süpernatantları bir mililitre taze farklılaşma ortamıile değiştirin. Ve hücreleri altı gün boyunca kuvöze geri ver.Ters faz kontrast ışık mikroskobu altında, her gün farklı grupların farklılaşma durumunu kontrol edin. Tedaviden sonra, hücrelerin taze farklılaşma ortamı ile supernatant değiştirmeden önce yaklaşık bir saat boyunca durum orta tam olarak dengelemek için izin verin. İmmünofloresan analizi için, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca her kuyu başına %4 paraformaldehitin 500 mikrolitresi ile kültürleri düzeltin.Ardından yıkama başına bir mililitre PBS ile üç hafif beş dakikalık durulama. Daha sonra, sabit numuneleri PBS'de yüzde 2 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 10 dakika geçirin. Gösterildiği gibi nazik durulama izledi.Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca pbs başına pbs yüzde 10 keçi serumu bir mililitre ile herhangi bir nonspesifik bağlama blok. Kuluçka sonunda, her kuyudaki hücreleri bir gecede 4 derece lik bir ilgi antikorunun 300 mikrolitresiyle etiketle. PBS'de gösterildiği gibi üç yıkıntı takip etti.Son yıkamadan sonra, hücreleri uygun ikincil antikorların 300 mikrolitresi ile etiketlendirin. Oda sıcaklığında iki saat kuluçka, ışıktan korunmaktadır. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca her kuyubaşına bir mililitre PBS ile hafifçe durulayın.Uygun filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobundaki hücreleri görüntüleyin. Plazma da tedavi edilen nöral kök hücreler, işlenmemiş kontrole ve gaz akışına göre hızlandırılmış bir farklılaşma hızı ve daha yüksek bir farklılaşma oranı sergilerler. Plazma tedavisinden sonra Nestin azalır.Beta-Tubulin III önemli ölçüde artar. Ve O4 biraz artar, kontrol tedavi ve gaz akışı tedavi kök hücreleri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, plazma tedavisi nin 60 saniye sonra, olgun nöron sağlam bir ifade, kolinerjik nöron, ve motor nöron belirteçleri gözlenir.Çok az GABAerjik ve serotonerjik nöronlar ile, ve hiçbir dopaminerjik nöronlar tespit. Uzun ve yoğun bir plazma tedavi süresi hücre apoptosis veya nekroz neden olur, çünkü bu prosedürleri çalışırken, hatırlamak önemlidir, uygun plazma dozu ile hücreleri tedavi. Ayrıca downstream uygulamadan önce hücre canlılığını önceden test etmeyi unutmayın.

nerve-stem-cell-differentiation-one-step-cold-atmospheric-plasma

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinin veya hESC'lerin, besleyici hücreler veya herhangi bir ara adım kullanmadan doğrudan nöral progenitör hücrelere farklılaşmasını göstermektedir. Kemik morfogenetik proteininin veya BMP'nin seçici inhibisyonu ve transforme edici büyüme faktörü-beta veya TGF-β sinyal yolakları, hESC'lerin nöral progenitör hücrelere veya NPC'lere farklılaşmasına yol açar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Progenitörlere Farklılaşması

Bu video, soğuk atmosferik plazma kullanarak nöral kök hücrelerde farklılaşmayı tetiklemek için bir yöntem sunmaktadır. Bu, sinir hücrelerini projeksiyonlar üretmeleri için uyarmak için UV radyasyonu ve reaktif moleküller üretir, bu da nöronal hücre farklılaşmasını gösterir.

Soğuk Atmosferik Plazma Tedavisi Kullanılarak Sinir Kök Hücre Farklılaşmasının Uyarılması

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinden oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) üretilmesi sürecini ve ardından OPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını göstermektedir. Bu oligodendrosit üretme süreci, Alzheimer da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların araştırma ve tedavisini iyileştirmek için çok sayıda yol açar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Oligodendrositlere Farklılaşması

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

İnsan pluripotent kök hücrelerinden farklılaştırılmış hücre türleri üreten (hPSCs) büyük terapötik söz tutar ama zorlu kalır. PSC 'ler genellikle uygun bir sinyal seti ile uyarıldığında bile ayrım yapmak için doğal bir yetersizlik sergiler. Burada açıklanan PSC hatları çeşitli arasında multilineage farklılaşma geliştirmek için basit bir araçtır.

Insan pluripotent kök hücrelerinin DMSO ile geçici tedavisi farklılaşma teşvik etmek

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Öğrenin, soğuk atmosferik plazma ile sinir kök hücrelerinin tek adımlı farklılaşmasını nasıl artıracağınızı. Bu yöntem, Parkinson hastalığı gibi nörolojik hastalıkların tedavisinde umut vadediyor.

Sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi Vitro tarafından

Daha fazla video keşfet