Name: Akciğer mikroRNA profil oluşturma arasında Estrous döngüsünde ozon maruz fareler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Öğrenin, farelerde östrus döngüsü aşamalarında akciğer mikroRNA profil oluşturma yöntemini. Bu teknik, oksijen maruziyetinin inflamatuar gen düzenlemesine etkisini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma hibe NIH K01HL133520 (PS) ve K12HD055882 (PS) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Joanna Floros ozon pozlama deneyleri ile yardım için teşekkür ederiz.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Penn State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Estrous döngüsü aşamasını değerlendirilmesi
<ol><li>Düzgün bir erkek C57BL/6 fare (8 – 9 haftalık) kullanarak Machholz ve ark.10içinde açıklanan tek el fare kısıtlama tekniği dizginlemek.</li>
	<li>Steril plastik pipet 10 μL ultra saf su ile doldurun.</li>
	<li>Plastik pipet ucu vajina içine tanıtmak.</li>
	<li>Yavaşça sıvı 4-5 kez sifonu örnek toplamak için.</li>
	<li>Bir cam slayt üzerinde vajinal sıvı içeren son floş yerleştirin.</li>
	<li>20 x amacı ile hafif bir mikroskop altında günahı vajinal floş gözlemlemek. Not: Pseudopregnancy ya da diğer sebepler nedeniyle normal döngüsü gösterme hayvanlar deneyden dışlanmaları gerekir. Bu endüstriyel onaylamak en az üç ardışık döngüleri için günlük vajinal salgılar gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
</ol>2. Ozon maruz
<ol><li>En fazla 4 fareler iki 1,2 L cam kaplar tel kafes kapakları ve su ile ad libitum yerleştirin.</li>
	<li>Ozon odası ve diğer filtre uygulanmış hava pozlama odasında bir cam kap koymak.</li>
	<li>Ozon konsantrasyonu 2 ppm ve monitör ozon seviyelerine düzenli olarak ayarlayın. Not: Ozon aparatı düzenlenmiş bir hava akımı sağlar (> 30 hava değişiklikleri/h) ile (% 50) sıcaklığı (25 ° C) ve bağıl nem kontrollü. Sistem tarafından izlenen ve11daha önce açıklandığı gibi bir ultraviyole ozon analizörü ve kitle akış kontrolcüler, tarafından kontrol edilen bir elektrik deşarj ozonizer ozon üretir.</li>
	<li>Cam kaplar ozon/filtre hava pozlama 3 h sonra kaldırın. Hayvan yatak, gıda ve su ad libitum ile kafes dönmek.</li>
</ol>3. akciğer koleksiyonu
<ol><li>4 h pozlama sonra bir ketamin/xylazine kokteyl (90 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine) mayi bir enjeksiyon hayvanlarla anestezi. Not: Anestezi uygun bir düzeyde onaylamak için kontrol edin bir pedal için fare (firma ayak tutam) refleks ve anestezi gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>% 70 etanol ile fare cildinizi nemlendirin.</li>
	<li>Vena kava ortaya çıkarmak için bir işletim makas ve cerrahi Cımbız kullanarak bir 2 cm ensizyon olun.</li>
	<li>Fareler tarafından vena kava ve aort transeksiyon kurban. Gerekirse, kan kan kaybı önce toplamak için böbrek damarları yukarıda vena kava 21 G gauge iğne takın. Alternatif olarak, kan yolu ile kalp ponksiyon standart protokolleri takip toplamak.</li>
	<li>Cerrahi makas karın kesip ve cilt/üst kas, yukarı doğru kaburga hareket kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Cerrahi makas diyafram ponksiyon için kullanın. Not: Akciğerler uzak diyafram çökecek.</li>
	<li>Kalp ve akciğerler duyurmak cerrahi makas kullanarak göğüs kafesi kes gitsin.</li>
	<li>Forseps kullanarak, 1.5 mL microcentrifuge tüp RNase free al ve sıvı azot tüpü doldurmak için daldırın. Not: Sıvı azot işlemek için gözlük ve koruyucu eldiven kullanın.</li>
	<li>Akciğerleri kaldırmak, onları RNase free microcentrifuge 1,5 mL tüpler ek-doku dondurmak için sıvı azot ile dolu içine koyun ve sıvı buharlaşarak kadar birkaç saniye bekleyin.</li>
	<li>Tüp kapağını kapatın ve-80 ° C'de doku kullanmak kadar saklamak.</li>
</ol>4. RNA hazırlık
<ol><li>Tüm akciğer bir paslanmaz çelik dokusu Montaj cihazları-Pulverizatör kullanarak ezmek. Not: Doku Montaj cihazları-Pulverizatör sıvı azot içinde kullanmak için önceden yerleştirilmesi gerekiyor. Montaj cihazları-Pulverizatör RNAse çözümü ile her kullanımdan sonra temiz.</li>
	<li>Toz akciğerler bölünmüş ve iki 1,5 mL tüpler (yarım her akciğer) içine yerleştirin.</li>
	<li>Guanidinium thiocyanate örnek tüp başına 500 µL ekleyip karıştırın.  18 G, 21 G ve 23 G iğneler, sırasıyla kullanarak her örnek lunaparkçı. Not: Örnekleri 5,6 x 108 kopya küçük RNA spike bileşenini denetimden (farklı bir tür) çıkarma işlemine devam etmeden önce ile çivili.</li>
	<li>Her örnek ve 15 için girdap etanol 500 µL eklemek s.</li>
	<li>Yük karışımı bir spin sütunundaki bir koleksiyon tüp ve 1 dk. 12.000 x g , santrifüj atmak akışı aracılığıyla.</li>
	<li>
DNaz için ben tedavi (içinde sütun);
	<ol>
<li>RNA yıkama arabellek ve santrifüj 400 µL 12.000 x g 1 dk. için ekleyin.</li>
		<li>RNase free tüp içinde 5 ekleyin µL DNaz, ben ve DNA sindirim x 1 75 µL tampon ve karıştırın. Mix doğrudan sütun matris ekleyin.</li>
		<li>15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sütun ve 1 dk. atma akışı üzerinden 12.000 x g , santrifüj 400 µL RNA prewash çözüm ekleyin ve bu adımı yineleyin.</li>
	<li>700 µL RNA yıkama arabelleği sütun ekleyin ve 1 dakika süreyle santrifüj 12.000 x g de atın akışı aracılığıyla.</li>
	<li>12.000 x g kalan arabellek kaldırmak 2 min için de santrifüj kapasitesi. Sütun bir RNase free tüp içine aktarın.</li>
	<li>RNA elute sütun matris ve 12.000 x g , santrifüj 1,5 dk 35 µL DNaz/RNase-ücretsiz su ekleyin.</li>
	<li>Ölçmek toplam RNA konsantrasyonu (260 nm) ve saflık bir spektrofotometre kullanarak. RNA miktar bir 1,5 µL örnekte aliquot gerçekleştirmek için yönergeleri izleyin. DNaz/RNase-ücretsiz su elüsyon için kullanılan ile araç boş. Not: ~2.0 260/280 oranında genellikle "gibi saf" RNA için kabul edilir. Tipik RNA konsantrasyonu genellikle 750 ve 2500 ng/µL arasında değişmektedir.</li>
	<li>Mağaza-80 ° C'de</li>
</ol>5. miRNA profil oluşturma
<ol><li>
Küçük RNA'lar, kullanım 200 ng toplam RNA'ın Retro uyarlamak için.
	<ol>
<li>(Toplam reaksiyon başına 20 µL birimdir) buz üzerinde ters transkripsiyon tepki karışımı hazırlayın. Her reaksiyon için 4 µL 5 x arabellek, nükleotit mix 10 x 2 µL, ters transkriptaz 2 µL ve 2 µL RNase free su ekleyin. Mix tüm bileşenleri ve aliquot 600 µL RNAse free Plastik tüpler (Mix tepki başına 10 µL). Not: Ters transkripsiyon ana şablon RNA dışında ilk iplikçikli cDNA sentezi için gerekli tüm bileşenleri içermektedir. Not: Aşırı cilt (% 10) ana karışımı hazırlarken hesaplayın.</li>
		<li>RNA şablonu ekleme (200 ng 10 µL) Ters transkripsiyon ana karışımı içeren her tüp için. Mix, santrifüj 15 1000 x g, s ve buza thermocycler veya kuru blok yerleştirme kadar saklayabilirsiniz.</li>
		<li>37 ° C'de 60 dk için kuluçkaya</li>
		<li>95 ° C'de 5 min için kuluçkaya ve tüpler buza koyun.</li>
		<li>CDNA her 20 µL Ters transkripsiyon tepki 200 µL RNase free su ekleyerek sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerçek zamanlı PCR fare inflamatuar yanıt ve otoimmünite miRNA PCR dizi kullanarak gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Bir reaksiyon mix (Toplam hacim 1100 µL) hazırlamak: 550 µL 2 x PCR ana Mix, 10 evrensel astar mix x 110 µL, 340 µL RNase free su ve şablon cDNA (adım 5.1.5 seyreltilmiş reaksiyon) 340 µL her tepki için ekleyin.</li>
		<li>Reaksiyon Mix 10 µL PCR çok kanallı bir pipettor kullanarak dizi önceden yüklenmiş miRNA her şey için ekleyin.</li>
		<li>MiRNA PCR dizi plaka optik yapıştırıcı film ile kapatın.</li>
		<li>1 dk 1000 x g kabarcıklar kaldırmak için oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Program gerçek zamanlı cycler, PCR ilk harekete geçirmek için 95 ° C'de 15 dakika, adım 3-adım Bisiklete binme içeren denatürasyon 15 94 ° C'de 30 için TAV, s s 55 ° C ve uzantısı için 30 s 40 70 ° C'de devir sayısı. Not: Takip üreticisinin Bisiklete binme talimatları kadar gerçek zamanlı cycler ayarlamak için koşullar. Gerçek zamanlı cycler yazılımı yerleşik ayrılma eğrisi adımı gerçekleştirin.</li>
		<li>Veri çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. veri analizi
<ol><li>CT değerleri bir analiz yazılımı her örnek için gerçek zamanlı PCR yazılım ayıklayın. Not: 34 A Ct değerini kesme kabul edilir. Örnekleri spike denetimi (örneğin, cel-mir-39) içeriyorsa, ani artış her örnek için denetimi için Ct değerleri normalize. Eşik değerleri el ile ayarlamanız gerekebilir. Temel değerlerini otomatik olarak ayarlanır.</li>
	<li>Altı miRNA temizlik denetimleri ortalama ct ct değerleri normalize: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, aşağıdaki denklemi kullanarak: ΔCt (Ct_Target − Ct_housekeeping) =</li>
	<li>Kat için hesaplamaları değiştirebilir, belirli bir örnek göreli ifade denklem12kullanarak denetimi kullanarak ΔΔCt değerleri hesaplamak: miRNA göreli ifade: 2-∆∆Ct, nerede - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct kontrol] Not: 200 kat değişimine kesim kabul edilir.</li>
	<li>İhracat kat Bioconductor8' limma paketi kullanarak r istatistiksel analiz gerçekleştirmek için ifade değerleri değiştirin.</li>
	<li>13Benjamini-Hochberg yöntemini kullanarak birden çok karşılaştırmaları için düzeltin. Not:  R senaryonun bir kopyasını elde edilebilir vasıl: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>. Veri kümeleri ve analiz veri are da elde edilebilir, gen ifade Omnibus numarası GSE111667 altında https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.</li>
</ol>7. veri analizi: Fonksiyonel analiz yazılımı
<ol><li>Veri kümesi düzenleyin. MiRNAs ile onların anılan sıraya göre ifade Günlük oranları ve p-değerleri içerir. Belirli veri kümesi biçimlendirmek için bkz: Tablo 1 .</li>
	<li>Açık fonksiyonel analiz yazılımı (sürüm 01-10).</li>
	<li>Aşağıdaki biçimi kullanarak veri kümesi upload: dosya biçimi: "Esnek Format", sütun üstbilgisi içerir: "Evet", tanımlayıcı türünü seçin: "miRBase (Olgun)", deneyler için kullanılan dizi platformu: dizi platform seçebilir. Not: Dosya biçimleri .txt kabul edilmektedir (sekmeyle sınırlandırılmış metin dosyaları), .xls (excel dosyaları) ve .diff (cuffdiff dosyaları).</li>
	<li>"Sonucuna gözlemler" seçin ve deney grubu etiketleme doğru olduğundan emin olun.</li>
	<li>"Veri kümesi eşlenen ve eşlenmemiş miRNAs toplam miktarını gözden geçirmek için Özet" için gidin.</li>
	<li>
Üst "yeni" düğmesine tıkladığınızda program yaptı. "Yeni mikroRNA hedef filtresi" seçin ve mikroRNA veri kümesi yükleyin.
	<ol>
<li>Ayarlanmış kaynak: TarBase, marifet uzmanlar bulgular, miRecords.</li>
		<li>Güven ayarla: deneysel olarak gözlenen veya yüksek (tahmin).</li>
		<li>"Eklemek çeşitli türler, hastalıklar, dokular, yollar ve daha fazla gibi hedefleri hakkında biyolojik bilgiler eklenecek sütunları" seçin.</li>
		<li>İfade deneyinde değişti hedeflerine odaklanmak için seçin "Ekle / mRNA veri kümesini değiştirmek". "Eşleştirme ifade" mikroRNA'lar aynı veya farklı ifade düzeyleri ile bulmak için kullanın. Not: Filtre analiz mikroRNA adları ve semboller, mRNA hedefleri, hedef ilişki ve tahmin edilen ilişki (Şekil 2) güven düzeyini tanımlayan kaynak sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Eklemek için My filtre uygulanmış veri kümesi bir yolu tuvale göndermek ve daha fazla biyolojik ilişkileri keşfetmek için yolu"'ı tıklatın.</li>
	<li>Yol bir yayın kalitesinde model mikroRNA efektleri oluşturmak için Designer'ı kullanın.</li>
	<li>
Diğer bir seçenek bir çekirdek analiz oluşturmaktır.
	<ol>
<li>Temel analiz türü için "İfade analizi" seçin.</li>
		<li>Ölçüm türü için "Expr günlük oranı" seçin.</li>
		<li>Analiz filtre Özeti: yalnızca molekülleri ve/veya ilişkileri düşünün nerede: (tür fare =) ve (güven deneysel olarak gözlenen =) ve (veri kaynakları = "Marifet uzman bulgular", "Marifet ExpertAssist bulgular", "miRecords", "TarBase", veya " TargetScan insan").</li>
		<li>P-değeri bir kesim seçin = 0,05.</li>
		<li>Analizi yap. Not: Rapora dahil edilir: kanonik yolları, ters yönde düzenleyiciler analiz, hastalıklar ve işlevler, düzenleyici etkileri, ağlar, moleküller ve daha fazlası.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+microRNAs+regulate+gene+expression%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">How do microRNAs regulate gene expression?</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li>
<li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microrna%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li>
<li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li>
<li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Sex+Differences%22%5BJournal%5D)">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18(2018).</li>
<li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li>
<li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.681.4748">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2346101">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Stomatologica+Croatica%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+purification-+precipitation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/0-387-29362-0_23">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li>
<li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59745-123-1:129">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li>
<li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TarBase%3A+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRecords%3A+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li>
<li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Informatics%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

MikroRNA profil oluşturma hastalık tanı ve mekanik araştırma için avantajlı bir tekniktir. Bu makale, ozon için farklı estrous döngüsü aşamaları içinde maruz dişi farelerin akciğerlerde inflamatuar genler düzenleyen tahmin edilmektedir miRNAs ifade değerlendirmek için bir protokol tanımlı. Yöntemleri gibi görsel algılama yöntemi, estrous döngüsü belirlenmesi için açıklanan16olmuştur. Ancak, bu tek seferlik ölçümler güveniyor ve bu nedenle güvenilir değildir. Doğru bir şekilde tüm estrous döngüsü a...

mikroRNA (miRNAs) çoğu kısa (19-25 nukleotid), doğal olarak meydana gelen, kodlamayan RNA molekülleri. MiRNAs dizisi evrimsel türlerin fizyolojik fonksiyonları1düzenlenmesinde miRNAs önemini telkin, karşıdan karşıya korunmuş. mikroRNA ifade profil oluşturma işlemleri, bağışıklık yanıtı, hücre farklılaşması, gelişimsel süreçleri ve Apoptozis2de dahil olmak üzere çeşitli Yönetmelikte önemli miRNAs belirlemek için yardımcı olmak için kanıtlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, miRNAs potansiyel kullanımları hastalığı teşhis ve tedavi için kabul edilmiştir. Özellikle miRNA bilgi mRNA profil oluşturma ve diğer genom ölçekli veri3ile birleştirildiğinde gen düzenlemesi mekanizmaları eğitim araştırmacılar için miRNA ifade ölçme sistemleri düzey modelleri düzenleyici işlemlerin aydınlatmak olabilir. Öte yandan, miRNAs mRNA'ların örnek türleri bir dizi daha kararlı olmak da gösterilmiş ve aynı zamanda protein4' ten büyük hassasiyetle ölçülebilir. Akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli moleküler tanı uygulamaları için biyolojik olarak miRNAs gelişiminde büyük ilgi yol açmıştır.
Akciğer miRNAs gelişimsel süreçleri ve homeostasis bakımında önemli rol oynarlar. Ayrıca, onların anormal ifade gelişme ve ilerleme çeşitli göğüs hastalıkları5ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hava kirliliği tarafından indüklenen inflamatuar akciğer hastalığı büyük önem ve hormonlar ve estrous döngüsü akciğer doğuştan gelen bağışıklık ve miRNA ifade yanıt çevre sorunları olarak düzenleyen gösteren dişilerde yoksul prognoz göstermiştir 6. bu protokol için biz edinilmiş bağışıklığın yokluğunda oluşur dişi farelerde akciğer iltihabı şeklinde ikna etmek için hava kirliliği önemli bir bileşenidir, ozon pozlama kullanın. Ozon kullanılarak, hava yolu epitel hücre hasarı ve nötrofil artış ve proksimal airways7inflamatuar aracılar ile ilişkili hava yolu hyperresponsiveness gelişimi inducing. Şu anda değil karakterize ve ozon günese maruz kalan farelerde estrous döngüsü boyunca miRNAs analiz için iyi tarif protokolleri vardır.
Aşağıda, estrous döngüsü aşamaları ve ozon için maruz dişi farelerin akciğer dokusunda miRNA ifade tanımlamak için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca miRNA bulma ve hedef tanımlama, İşlemsel Biyoloji üzerine vurgu ile etkili Biyoinformatik yaklaşımlar ele. Biz limma, gen ifade deneyler8verileri analiz etmek için tümleşik bir çözüm sağlar bir R/Bioconductor yazılım kullanarak Mikroarray veri analiz. Analizini PCR dizi verileri limma diziler/örnekler az sayıda ifade karşılaştırmak için kullanırken t-test dayalı prosedürleri güç açısından avantaj vardır. MiRNA ifade sonucu biyolojik bağlamında anlamak için o zaman fonksiyonel analiz yazılımını kullanmıştır. Transkripsiyon değişiklikleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için ve olası sonuçları tahmin etmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı miRNA-ifade veri kümeleri ve bilgi edebiyat9birleştirir. Bu sadece miRNAs kümeleri için üst üste yapılan istatistiksel zenginleştirme arayın yazılım ile karşılaştırıldığında bir avantajdır.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td>8 haftalık</td></tr><tr><td>UltraPure Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>Steril plastik pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-25</td><td>Kapasite: 1.7 mL</td></tr><tr><td>Buzlu Mikroskop Slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Mikroskop Dünyası</td><td>MW3-H5</td><td>10x ve 20x objektif</td></tr><tr><td>Ketattezi-Ketamin HCl Enjeksiyonu USP</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>55853</td><td>90 mg / kg. Kontrollü ilaç.</td></tr><tr><td>Ksilazin Steril Çözelti</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>10 mg / kg. Kontrollü ilaç.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Su ile% 70 etanole seyreltin.</td></tr><tr><td>21 G ölçü iğnesi</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>329654</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Ameliyat Makası</td><td>World Precision Instruments</td><td>501221, 504613</td><td>14 cm, Keskin/Künt, Kavisli ve 9 cm, Düz, İnce Keskin Uçlu</td></tr><tr><td>Cımbız Seti</td><td>World Precision Instruments</td><td>504616</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp; Bessman Doku Pulverizatörleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-418-1</td><td>Kapasite: 10 ila 50 mg</td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>TRIzol Reaktif</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT kiti</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>Fare İnflamatuar Yanıtı & Otoimmünite miRNA PCR Dizisi</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>İnce duvarlı, DNaz içermeyen, RNaz içermeyen PCR tüpleri</td> 20 &mu için <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12225</td><td>; L reaksiyonları</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plazma Spike-in Kontrolü</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr> <tr><td>Yaratıcılık Yolu Analizi</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr> <tr><td>R Yazılımı</td><td>R Vakfı</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Termal döngüleyici veya soğutma/ısıtma bloğu</td><td>Genel Laboratuvar Tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikrosantrifüj Genel Laboratuvar Tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı PCR döngüleyici</td><td>Genel Laboratuvar Tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çok Kanallı pipetleyici</td><td>Genel Laboratuvar Tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA yıkama tamponu</td><td>Zymo Research</td><td>R1003-3-48</td><td>48 mL</td></tr><tr><td>DNA sindirim tamponu</td><td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td><td>4 mL</td></tr><tr><td>RNA ön yıkama tamponu</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Ultraviyole ozon analizörü</td><td>Teledyne API</td><td>Model T400</td><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td></tr><tr><td>Kütle akış kontrolörleri</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

akciğer mikrorna profil oluşturma arasında estrous döngüsünde ozon maruz fareler

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MikroRNA (miRNA) profil oluşturma biyoloji ve tıp çeşitli araştırma alanlarında çalışan araştırmacıların ilgi haline gelmiştir. Mevcut çalışmalar tanı ve akciğer hastalıkları Bakımı miRNAs kullanarak gelecekteki bir umut verici göster. Burada, biz miRNA inflamatuar bir ozon kaynaklı hava yolu iltihabı fare modeli akciğer dokusundan genlerinde düzenleyen tahmin miRNAs bir grup göreli bolluk ölçmek için profil oluşturma için bir iletişim kuralı tanımlar. Çünkü seks hormon düzeyleri dolaşan akciğer doğuştan gelen bağışıklık dişilerde Yönetmeliği etkileyebilir gösterilmiştir, bu yöntemin amacı protokolü dikkate alındığında estrous döngüsü dişi farelerde profil oluşturma bir enflamatuar miRNA tarif etmektir Her hayvan ozon pozlama zaman aşaması. Biz de limma, bir R/Bioconductor yazılım kullanarak miRNA bulma ve hedef tanımlama yöntemleri uygulanabilir Biyoinformatik yaklaşımlar adresi ve biyolojik bağlam ve yolları anlamaya fonksiyonel analiz yazılımı ile ilişkili fark miRNA ifade.

Smear içinde gözlenen farklı hücre tipleri fare estrous döngüsü aşamasını (Şekil 1) tanımlamak için kullanılır. Bunlar hücre morfolojisi tarafından tanımlanır. Proestrus sırasında neredeyse sadece kümeleri yuvarlak şekilli, iyi biçimlendirilmiş çekirdekli epitel hücresi (Şekil 1A) hücrelerdir. Fare estrus aşamasında olduğunda, cornified skuamöz epitel hücreleri, yoğun paketlenmiş kümelerinde (Şekil 1B</strong...

Burada biz akciğer ifade değerlendirmek için bir yöntem tarif tahmin edilmektedir miRNAs inflamatuar genler düzenleyen fare kullanarak ozon için maruz veya hava estrous döngüsünün farklı aşamalarında filtre.

Akciğer mikroRNA profil oluşturma arasında Estrous döngüsünde ozon maruz fareler

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Bu yöntem akciğer içinde inflamatuar genleri düzenleyen tahmin mikroRNA'ların ekspresyonunu değerlendirmek için nasıl akciğer-bağışıklık alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu teknik akciğer mikroRNA ekspresyonu dolaşan hormonların katkılarını belirlemek için basit bir yol sunuyor. Estrous döngüsü aşamasını değerlendirmek için, sekiz ila dokuz haftalık bir dişi fareyi elle dizginleyin ve vajinaya ultra saf su yla dolu 10 mikrolitrelik plastik pipetin ucunu tanıtın.Bir numuneyi toplamak için 4-5 kez hafifçe yıkayın ve vajinal sıvının son floşkısmını cam bir kaydıranın üzerine yatırın. Sonra 20X büyütme bir ışık mikroskop altında lekesiz vajinal floş gözlemleyin. Ozon ve filtrelenmiş hava maruziyeti için, tel örgü kapaklı 1,2 litrelik cam kaplardan birine en fazla dört fare yerleştirin.Bir cam kabı ozon odasına, bir tanesini de filtrelenmiş hava maruziyet odasına koyun. Daha sonra ozon konsantrasyonu milyonda iki parçaya ayarlayın ve üç saat sonra kabı nı çıkartın. Maruz kaldıktan dört saat sonra, ilk deneysel farenin maruz kalan deri yüzeyini %70 etanol ile dezenfekte edin ve kalp ve akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.Sıvı nitrojen bir 1.5 mililitre

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, basit, non-invaziv toplama ve vaginal smear örneklerinin sitolojik değerlendirmesi ile fare üreme (Proestrus, kızgınlık, metestrus veya diestrus) aşamasında nasıl belirleneceği açıklanmaktadır. Biz daha vajinal sitoloji fare üreme döngüsü boyunca geçiş yatan hormonal seviyeleri dolaşımdaki nasıl yansıttığını açıklar.

Fare Östrus Döngüsü Evreleme Tanımlaması Vajinal Lavaj, Kristal Violet Boyama ve Vajinal Sitolojik Değerlendirilmesi Sahne

İki paradigmalar egzersiz egzersiz kapasitesi ve egzersiz kardiyak adaptasyon menopozun etkisini incelemek için yeni geliştirilen kimyasal kaynaklı menopoz fare modeli üzerinde test edildi.

Farelerde Egzersiz Kapasitesi ve Kardiyak Uyum Kimyasal kaynaklı Yumurtalık Yetmezliği Etkisi Eğitim için Bir Yöntem

Bu çalışmada art arda fareler için ozon yüksek konsantrasyonda açarak yeni bir kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hayvan modeli başarılı nesil açıklar.

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı manken tekrarlanan ozon maruz farelerde nesil

Bu el yazması, hava kirletici bir kriter olan ozon maruziyetinin alveoler makrofaj efferositozisinin in vivo'yu bozup bozmadığını belirleyen bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol yaygın olarak kullanılan reaktifler ve teknikler kullanır ve alveoler makrofaj eferositoz üzerindeki etkilerini belirlemek için pulmoner yaralanma birden fazla modeladapte edilebilir.

Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi

Kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruz fareler nötrofiller de dahil olmak üzere geniş yayılmış hücre ölümü gösterir. Sitoskeletal lamellipodia'nın bozulması, karmaşık V ATP sintaz alt β birliğinin hücresel ekspresyonunun artması ve bronko-alveoler lavajda anjiyostatin, akciğer immün yanıtının baskılanması ve nötrofil alımının gecikmesi gibi hücresel adaptasyonları gözlemledik.

Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi

RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.

Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu

Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.

Fare yumurtalık epigenomu ve transkriptomunun hücreye özgü eşleştirilmiş sorgulaması

Çeşitli ekstragonadal doku ve organlarda folikül stimüle edici hormon (FSH) birçok hastalığın patogenezi ile ilişkilidir. Yumurtalıklı ve FSH ile tedavi edilmiş fare modeli (OVF), FSH'nin ekstragonadal etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Folikül Uyarıcı Hormonun Bağımsız Etkilerinin Bir Fare Modelinde İn Vivo Olarak Araştırılması

Bu makale, farelerde solunan çevresel kirleticilere maruz kalmanın koku alma fonksiyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gömülü gıda testinin ve sosyal koku ayrımcılığı deneyinin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır.

Solunan Çevresel Kirleticilerin Farelerde Koku Alma Fonksiyonu Üzerindeki Etkilerinin İncelenmesi

Burada, yenidoğan farelerde hipoksiyi indüklemek için değişen oksijen konsantrasyonlarına sahip kontrollü ortamlarda vererek bir protokol sunuyoruz. Doğumda oksijen varyasyonlarına maruz kalan fare modelleri, otizm gibi davranışsal fenotipik değişikliklerin indüksiyonunda yer alan miRNA'ların ekspresyonunu kalıcı olarak değiştirmiştir.

Hipoksi, farelerde otizm spektrum bozukluğunun mendel dışı kalıtımında yer alan miRNA seviyelerini değiştirir

Öğrenin, farelerde östrus döngüsü aşamalarında akciğer mikroRNA profil oluşturma yöntemini. Bu teknik, oksijen maruziyetinin inflamatuar gen düzenlemesine etkisini incelemek için kullanılır.

Akciğer mikroRNA profil oluşturma arasında Estrous döngüsünde ozon maruz fareler

Daha fazla video keşfet