Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama
November 28th, 2018
Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.
Bu yöntem, T-hücre immünolojisi ve viral vektör aşılarının geliştirilmesi alanındaki anahtar soruların cevapsız ına yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, aynı fareden tekrarlanan ölçümler sağlayan sadece az miktarda kana ihtiyaç duyulmasıdır. Ayrıca, virüs ve transgene özgü CTLs aynı örnekten tespit edilebilir.
Prosedürü gösteren Jasmine Rinnofner, bir teknisyen ve Annika Rossler, yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Numunelerin ölçülmesi ve analiz edilmesi, doktora sonrası Zoltan Banki olacaktır. Başlamak için, metin protokolüne göre fareyi güvenli bir şekilde dizginleyin.
Bir farenin kuyruk damarından EDTA kaplı bir tüpte 20 mikrolitre kan toplayın. Splenositler ile çalışırken, dalak izole ve bir hücre süzgeci ile doku basın için bir şırınga piston kullanın. Eritrositler üzerinde lysis yaptıktan sonra hücreleri sayın ve numunenin konsantrasyonu ayarla.
Her örnek için bir Facs tüpü hazırlayın ve etiketlendirin ve 100 mikrolitre organ süspansiyonu veya 20 mikrolitre kanı tüpe aktarın. Splenositler ile çalışırken, beş dakika boyunca organ süspansiyon santrifüj ve supernatant atın. Sonra, hücre pelet yeniden askıya almak için tüp girdap.
Kullanılacak her kanal için, bir telafi örneği için bir Facs tüpü de hazırlayın. Lekesiz kontrol olarak bir ek örnek hazırlayın. En uygun seyreltmelerde tetramerile Facs tamponları ve karıştırmak için girdap içeren bir tüp hazırlayın.
Daha sonra, her numuneye tetramer seyreltme 50 mikrolitre ve karıştırmak için girdap ekleyin. Telafi kontrollerine ve lekesiz örneğe tetramer olmadan Facs arabelleği ekleyin. Daha sonra, örnekleri karanlık koşullarda 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Örnekler kuluçkaya yatarken, bir tüpe Facs tamponu ekleyin. Daha sonra, metin protokolünün Tablo 2'sinde belirtilen seyreltmelere göre antikorları tampona ekleyin ve çözeltiyi girdap. Bilimsel soru bekleyen marker kombinasyonları, burada açıklanan dışında, kullanılabilir.
Panele CD3 ve CD8'e karşı her zaman antikor lar eklediğinden emin olun. Her kanal için, Facs tampon 200 mikrolitre ile bir tüp hazırlamak ve kendi renk CD8 karşı bir antikor seyreltme bir mikrolitre ekleyin ve girdap karıştırmak için. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi antikor seyreltmeleri saklayın.
Örnekleri yıkamak için, örneklere bir mililitre Facs tamponu ekleyin ve santrifüj edin. Sonra, supernatant atın ve kağıt havlu ile kalan sıvı drenaj. Kanla çalışırken, kalan sıvıyı boşaltırken dikkatli olun.
Eritrositlerin lysis önce, kan tüpün altına sopa olmaz. Alternatif olarak, supernatant aspire edebilirsiniz. Daha sonra, her hücre pelet ine 50 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin ve yavaşça girdap.
Karşılık gelen kompanzasyon kontrolüne her bir kompanzasyon karışımının 50 mikrolitresini ve lekesiz kontrolün hücre peletine 50 mikrolitre Facs tamponu ekleyin ve girdap yavaşça. Splenositlerle çalışırken, antikor boyamadan sonra numuneleri doğrudan bir ila iki mililitre Facs tamponu ve santrifüj ile beş dakika yıkayın. Sonra, supernatant atın ve kağıt havlu üzerinde kalan sıvı drenaj.
Her kan örneğine 500 mikrolitre ACK tamponu ekleyin ve yavaşça girdap. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika karanlıkta örnekleri kuluçkaya yatırın. Örneklere bir mililitre Facs tamponu ekleyin ve santrifüj ekleyin.
Sonra, supernatant atın ve kağıt havlu ile kalan sıvı drenaj. Eritrositlerin düzgün bir şekilde ölçülmesi Facs ölçümlerini kolaylaştırmak için çok önemli bir adımdır, bu nedenle pelet daha ıslak olduğunda eritrositlerin tekrar Örnekleri daha önce açıklandığı gibi tekrar yıkayın.
Sonra, supernatant atın ve bir kağıt havlu üzerinde kalan sıvı drenaj. Fiksasyon dan önce, kümeoluşumunu önlemek için hücrelerin iyice askıya alındıklarından emin olun. Her tüpe tampon sabitleme Facs 150 ila 300 mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için girdap.
Ardından, akış sitometrik ölçümü ne kadar hızlı bir şekilde devam edin. İlk olarak, telafi kontrollerini ölçün ve herhangi bir spektral çakışmalar için doğru. Daha sonra, CD3-pozitif ve CD8-pozitif hücreler için seçmek için sıralı kapılar ayarlayın.
İleri ve yan saçılma alanını kullanarak lenfositler üzerinde kapı. Daha sonra, lenfosit popülasyon içinde, alan karşı ileri dağılım genişliği kullanarak tek hücrelerüzerinde kapı. Tek hücreli lenfositleri çizmek için CD3 ve CD8 kanallarını kullanın.
CD3-pozitif ve CD8-pozitif hücrelere gating ederek CD8-pozitif T-hücrelerini tanımlayın. CD8-düşük hücrelerin gating dahil olduğundan emin olun. CD3/CD8-pozitif hücrelerde yayılmabu protokolde kritik bir adımdır.
Hücrelerin aktivasyonu genellikle CD3 ve/veya CD8'in aşağı düzenlenmesine yol açtığından, CD3/CD8-düşük hücreler de eklenmelidir. Bundan sonra, CD8-pozitif/tetramer pozitif hücrelerüzerinde gating, tetramer hücreleri karşı CD8-pozitif hücreleri çizin. Mümkünse, her örnek için CD3-pozitif ve CD8-pozitif kapısına 20.000 hücre kaydedin.
Son olarak, ölçümleri FCS dosyası olarak kaydedin. Bu protokolde kan ve doku örneklerinde antijene özgü CD8+T hücreleri kan ve doku örneklerinde kantitatif olarak saptırıldı. CD3-pozitif ve CD8-pozitif hücreler gating sonra, tetramer-pozitif hücreler tespit edildi.
İki farklı tetramer boyama için aynı tüpte birleştirilerek iki farklı CTL özgülünün aynı anda ölçülmesi olanak sağladı. Bu protokol kullanılarak, her ölçüm için sadece küçük miktarda kan gerektiğinden, aynı fareden gelen T-hücre yanıtları zaman içinde izlenebilir. Ayrıca, antijene özgü CTL'lerin fenotipleri analiz edilebilir.
Bu prosedürü çalışırken, bu T-hücre reseptörlerinin içselleşmesine yol açabilir gibi, uzun kuluçka süreleri önlemek için önemlidir. Tetramer teknolojisinin keşfinden bu yana, tetramer boyama T-hücre analizi için önemli bir araç haline gelmiştir ve tetramerlerin birikmesi de dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi. Parlak tetramerler için parlak bir gelecek.
Genel Bakış
Bu protokol, küçük kan örnekleri veya organlardan elde edilen tek hücre süspansiyonları kullanarak antijene özgü CD8 + T hücrelerinin ex vivo niteliksel tespiti için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu, özellikle aşılama ve kanser immünoterapileri ile ilgili sitotoksik T hücre yanıtları üzerine yapılan çalışmalarda yararlıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- T-hücre immünolojisi
- Kanser immünoterapileri
- Viral vektör aşıları
Arka Plan
- Antijene özgü CD8 + T hücreleri, bağışıklık yanıtlarında önemli bir rol oynar.
- Küçük kan örnekleri, aynı denekten tekrarlanan ölçümlerin yapılmasını sağlar.
- Virüs ve transgen-spesifik CTL'lerin tespiti aynı anda gerçekleştirilebilir.
- Tetramer teknolojisi, T-hücre popülasyonlarının analizini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Antijene özgü CD8 + T hücrelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Zaman içinde T-hücre yanıtlarının incelenmesini kolaylaştırmak.
- Farklı CTL spesifitelerinin eşzamanlı olarak nicellenmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare kan örneklerinin toplanması ve splenositlerin izole edilmesi.
- Akış sitometrisi için tetramerler ve antikorlar ile numunelerin hazırlanması.
- Doğru boyama ve lizis sağlamak için inkübasyon ve yıkama adımları.
- CD8 pozitif T hücrelerinin tanımlanması ve nicellenmesi için akış sitometrik ölçüm.
Ana Sonuçlar
- Kan ve doku örneklerinde antijene özgü CD8 + T hücrelerinin başarılı bir şekilde tespiti.
- Tetramer boyama kullanılarak CD3 pozitif ve CD8 pozitif hücrelerin tanımlanması.
- Minimal kan hacmi ile zaman içinde T-hücre yanıtlarını takip edebilme.
- Birden fazla CTL spesifitesinin eşzamanlı analizi gerçekleştirildi.
Sonuçlar
- Bu protokol, çeşitli immünolojik bağlamlardaki T-hücre yanıtlarını incelemek için etkilidir.
- Antijene özgü T-hücre popülasyonlarının detaylı analizini sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar, immünoloji araştırmalarında tetramer teknolojisinin kullanımını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous quantification of anti-vector and anti-transgene-specific CD8+ T cells from minimal blood samples, supporting iterative monitoring of immune responses in vaccine development. By allowing repeated measurements from the same animal, it reduces animal usage and increases data density in preclinical immunogenicity studies. The method directly informs go/no-go decisions by de-risking target antigen selection and vector construct efficacy early in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying T-cell responses against both vector and transgene antigens in parallel.
- Operational Value: Uses only 20 microliters of blood per measurement, facilitating longitudinal tracking in the same mouse model.
- Predictive Value: Supports predictive confidence in antigen selection by distinguishing immune responses to the antigen of interest from anti-vector immunity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative flow cytometry outputs for antigen-specific CD8+ T-cell frequencies.
- Reproducibility: Includes compensation controls and unstained samples to ensure spectral overlap correction and assay consistency.
- Scalability: Compatible with high-throughput screening of multiple tetramer specificities in a single tube.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase T-cell profiling to preclinical validation by enabling phenotype analysis (e.g., activation status via CD43/CD44/CD62L).
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed immunogenicity stems from the transgene or vector components, informing construct optimization.
- Preclinical Model Relevance: Works with blood or spleen-derived single-cell suspensions, supporting flexible use across anatomical compartments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, specifically supporting early immune profiling after vaccination and prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct ex vivo quantification of antigen-specific TCR engagement without functional stimulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts that allow comparison of immune responses across different vaccine constructs.
- Analytics: Provides tetramer-positive cell frequencies as a key metric for comparing conditions and tracking responses over time.
- Translational Research: Connects to preclinical work by permitting phenotypic characterization of antigen-specific CD8+ T cells to assess differentiation state.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunological profiling platform applicable across viral vector vaccine and immunotherapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by decoupling anti-vector from anti-transgene T-cell responses.
- Operational Value: Ensures standardization through defined tetramer dilutions, antibody panels, and erythrocyte lysis steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of immunogenic liabilities or suboptimal antigen expression.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying immune responses that may compromise vaccine efficacy or safety.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for lymphocyte and T-cell subsets.
- Dependent on access to MHC I tetramers specific to viral vector and transgene epitopes, and compatible flow cytometer configuration.
- Necessitates standardized SOPs for blood collection, erythrocyte lysis, and antibody staining to maintain inter-experiment consistency.
- Must account for potential TCR internalization by avoiding prolonged tetramer incubation beyond 20 minutes at 37°C.
- Limited to murine models in the current protocol; adaptation to other species would require validation of cross-reactive reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Sample Collection
1:21
Staining Set-up
1:59
Tetramer Staining and Preparation of Antibodies
3:17
Staining of Samples
4:24
Lysis of Erythrocytes
5:09
Flow Cytometric Measurement and Analysis
6:53
Results: Quantification of Antigen-specific CD8+ T Cells in Mouse Blood of Lymphoid Organs
7:36
Conclusion
