Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme
November 17th, 2018
Yağ dokusu mimarisi ve hücresel bileşeni 3D görüntüleme için ideal bir yöntem olarak bütün Dağı immunostaining ve görselleştirme tekniği göstermek için çalışmanın odak noktasıdır.
Bu yöntem, oruç ve obezite gibi farklı metabolik koşullara göre hücreler arası etkileşimlerin ve yağ dokusu fizyolojisinin nasıl değiştiği gibi yağ biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, orijinal yağ 3D yapısını en iyi şekilde koruması ve genellikle konvansiyonel immünohistokimya için gerekli olan uzun işleme adımlarından kaçınmasıdır. Bu yöntem yağ dokusunun yapısına ışık sağlasa da, beyinde tam montaj boyama ile sinir sistemi gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.
Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler mülkiyet doku siteleri alma zorlukları nedeniyle mücadele edecek, uygun fiksasyon dönemi bulma, ve optimal antikor konsantrasyonları. Diseksiyon tamamlandıktan sonra, %1 paraformaldehitteki doku örneklerini içeren kabı buzdan oda sıcaklığına bir saat aktarın. Daha sonra daha hızlı yıkama için 12 veya 24-iyi hücre kültür plakası dokuları aktarın.
Tüm montaj boyama işleminin diseksiyondan hemen sonra başlaması gerektiğini ve her adım arasında duraklama noktası olmadığını unutmamak önemlidir. PBS-0.3T ile dokuları 22 derecede eğilmiş bir çalkalayıcıda, oda sıcaklığında dakikada 20 ila 25 eğim hızıyla beş dakika boyunca yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
Bundan sonra, %5 hayvan serumu içeren yaklaşık 0,5 ila bir mililitre bloke tampon ekleyin. Bir saat için önceki koşulları kullanarak bir shaker üzerinde plaka kuluçka. Engelleme çözeltisini aspire edin ve PBS-0.3T'de seyreltilmiş primer antikorların mililitresini her kuyuya %1 hayvan serumu ile ekleyin.
Plakayı bir gecede 4 santigrat derecede, 22 derece eğim ve dakikada 20 ila 25 eğim hızıyla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, beş dakika oda sıcaklığında dokuları yıkamak için PBS-0.3T kullanın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
Daha sonra, her kuyuya 0,5 ila bir mililitre uygun ve seyreltilmiş ikincil antikor çözeltileri ekleyin. Alüminyum folyo plaka sarın ve bir saat oda sıcaklığında bir shaker üzerinde kuluçka. Bundan sonra, yıkama başına beş dakika oda sıcaklığında PBS-0.3T ile iki kez plaka yıkayın.
Nötr lipid lekesi sırasında sıvı damlacıklarının görüntülenmesi gerekiyorsa, her yıkama beş dakika süren 1x PBS ile iki kez yıkayın. PBS seyreltilmiş nötr lipid leke ekleyin ve oda sıcaklığında kuluçka 30 dakika. Görüntülemeye başlamak için, 24'e 60 milimetrelik cam kapak fişinin üzerine doku düz döşenmek için terpler kullanın.
DAPI ile çekirdek boyama isteniyorsa, dokuyu tamamen batırmak ve kurumasını önlemek için DAPI içeren bir montaj ortamının bir ila iki damlaekleyin. Daha sonra, ters bir confocal lazer mikroskop sistemi üzerine slayt yerleştirin. Birden fazla odak düzleminde tam montajlı lekeli doku görüntülerini elde etmek için, istenilen büyütme de dört ila altı mikrometre adım boyutu ile derinliği nde 100 ila 150 mikrometre Z yığınları gerçekleştirin.
Bu çalışmada yağ dokusu mimarisini korumak için tam montaj boyama kullanılmıştır. Birden fazla işleme adımları ve kesit içeren yöntemlerin aksine, hangi yağ dokusu morfolojisi şekil bozukluğuna yol açabilir, tüm montaj boyama yöntemi adipositlerin morfolojisi koruyabilir, sonuçları yorumlarken doğruluk sağlanması. Yağ dokusunun aşırı fiksasyonu fiksatif kaynaklı floresan yol açar, hangi aynı bölgeleri örtüşen tarafından endike olabilir, tirozin hidroksilaz ve PECAM-1 sinyalleri burada görülen gibi.
Düzgün sabit, tam montaj leke örnekleri, ancak, bu sinyaller otofloresan olmadığını belirten ayrı ve farklı sinyaller göstermektedir. Tüm montajlı lekeli yağ dokusunun görüntülenmesi, farklı deneysel koşullar altında morfolojik değişikliklerin ölçülmesine olanak sağlar. Özellikle, yağ dokusu yüksek vaskülarize, hangi enerji düzeyinde hızlı değişiklikler üzerine metabolik homeostaz aracılık önemlidir.
Örneğin, 24 saatlik oruç tutan C57 siyah 6J fareler, lipoliz olduğunu gösteren önemli ölçüde daha küçük bir adiposit boyutu ve sürekli beslenen farelerle karşılaştırıldığında kan damarı yoğunluğunda bir eğilim gösterir. iDISCO+ile yağ dokularının temizlenmesi yağ dokularının optik olarak saydam olmasını sağlar. Doku açıklığına geçmiş yağ dokusunun immünetiketleme aynı büyütme doku temizleme olmadan tam montaj boyama gözlenen göre çok daha yoğun nöral arborization gösterir.
Bu yordamı denerken, PFA oda sıcaklığında bir saatten fazla numuneleri aşırı yayıltmamak için hatırlamak önemlidir, aksi takdirde, bu arka plan otofloresansını artıracaktır. Ancak, numuneler dört santigrat derecede sabitlenirse bu fiksasyon süresi uzatılabilir. Bu prosedürü takiben, ImageJ kullanarak nicelleştirme gibi diğer yöntemler, adiposit siteleri ve kan damarı yoğunluğu gibi hücresel mimari, çeşitli fizyolojik koşullara yanıt olarak nasıl değiştirmek gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, yağ dokusu yapısının ve hücresel bileşenlerin 3D görüntülemesine ideal olan bir tam-montaj immün boyama tekniğini gösterir. Bu yöntem, yağ biyolojisinin önemli sorularına yardımcı olur, özellikle metabolik durumlar gibi oruç ve obezite altında hücrelerarası etkileşimlerin ve doku fizyolojisinin nasıl değiştiğini açıklar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Yağ dokusu yapısı
- Metabolik durumlarda hücresel etkileşimler
- Immün boyama teknikleri
Arka Plan
- Yağ dokusu morfolojisini korumanın önemi
- Klasik immünohistokimyanın sınırlamaları
- Diğer organ sistemlerinde olası uygulamalar
Kullanılan Yöntemler
- Tam-montaj immün boyama
- Yağ dokusu ve diğer organ sistemleri
- Görüntüleme için konfokal lazer mikroskobu
Ana Sonuçlar
- Tam-montaj boyama, adiposit morfolojisini korur ve sonuçların doğru yorumlanmasını sağlar
- Oruç sırasında adiposit boyutunda ve kan damar yoğunluğunda önemli değişiklikler gözlendi
- Doku temizleme sonrası sinirsel yapıların görünürlüğünün arttığını gösterir
Sonuçlar
- Teknik, yağ dokusunun 3D yapısını etkili bir şekilde koruyarak metabolik tepkiler üzerinde çalışmayı kolaylaştırır
- Metabolik araştırmalarla ilgili yağ dokusunun hücresel yapısı ve işlevselliği hakkında bilgiler sağlar
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Preserving native 3D adipose tissue architecture enables accurate assessment of metabolic responses and intercellular interactions under physiological stress. This approach supports target validation by maintaining morphological fidelity, reducing artifacts that confound mechanistic interpretation in obesity and diabetes research. Whole-mount staining provides a scalable, reproducible platform for phenotypic screening of adipose remodeling in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipocyte morphology and vascular density changes under metabolic conditions like fasting.
- Operational Value: Preserves intact tissue structure without sectioning artifacts, improving data reliability for target hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports functional assessment of adipose tissue plasticity, aiding in de-risking targets involved in lipid metabolism and energy homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with lineage tracing and neutral lipid staining to quantify cellular fate and lipid storage dynamics.
- Operational Value: Standardized washing and blocking steps using PBS-0.3T and animal serum ensure reproducibility across samples.
- Scalability: Compatible with 12- or 24-well plate formats, facilitating medium-throughput imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal assessment of adipocyte size and vascular remodeling in disease models.
- Operational Value: When combined with tissue clearing (e.g., iDISCO+), allows whole-organ neural mapping in adipose tissue.
- Translational Continuity: Supports correlation of structural changes with functional metabolic readouts like lipolysis and glucose homeostasis.
Pipeline & Workflow Integration
Whole-mount staining fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical assessment of metabolic tissue responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how nutrient status alters adipose tissue architecture and cellular interactions.
- Screening: Enables standardized, quantitative imaging of adipocyte morphology and vascular density across experimental conditions.
- Analytics: Facilitates Z-stack confocal imaging and ImageJ-based morphometric analysis for objective comparison of structural phenotypes.
- Translational Research: Links structural observations (e.g., adipocyte shrinkage, vascular density) to physiological states like fasting-induced lipolysis.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organ systems (e.g., nervous system), increasing platform utility across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by preserving native 3D tissue architecture for accurate phenotype interpretation.
- Operational Value: Minimizes processing steps and fixation variability, enhancing reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable structural data on target engagement in metabolic tissues.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on adipose tissue remodeling profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, fixation timing, and antibody optimization to avoid overfixation artifacts.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure capable of Z-stack acquisition at 4–6 μm step sizes.
- Necessitates standardization of washing conditions (PBS-0.3T, 20–25 tilts/min, 22° tilt) for consistent staining.
- Adaptation to clearing protocols (e.g., iDISCO+) may be required for deep-tissue neural visualization.
- Limited by light scattering in uncleared tissues, restricting depth of accurate signal detection without clearing.
![[18F]FDG Micro-PET/MR Görüntüleme Kullanılarak Farelerde Kahverengi ve Bej Yağ Dokularının Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A25%253A48.878Z&w=384&q=75)
