Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi

Shalom.The BW Muhabir Sistemi reseptör-ligand etkileşimleri çalışma sağlar. Belirli bir reseptörün ligandının bilinmediği durumlarda veya endojen ligand ile yapılan deneylerin teknik olarak zor olduğu durumlarda son derece yararlıdır. Bu yöntem hassas ve bireysel bir reseptöre özgü, kullanımı kolay ve tekrarlanabilir.

Prosedürü gösteren Shira Kahlon, laboratuvarım için bir doktora sonrası olacak. Transfeksiyondan bir gün önce, 10 mililitre 100, 000 BW5147 hücreli 10 plaka ve rpmi takviyesi. Sonra bir tüp içine pcDNA3 plazmid 100 mikrogram yerleştirin.

Tüpe pH 5.3'te sodyum asetat ekleyin. Bundan sonra, plazmid karışımı% 100 etanol 2.5 hacimleri ekleyin. Sonra plazmid karışımını bir gecede eksi 20 derecede kuluçkaya yatırın.

24 saat bw hücreleri kaplama sonra, iki 50 mililitre tüpler hücreleri toplamak. Sonra hücreleri 515 g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Peloton RPMI'yi eklemeyapmadan yeniden askıya alın ve santrifüjü tekrarlayın.

Eklemeler yapmadan 1 mililitre RPMI'de ortaya çıkan peleti yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan peleti buz üzerinde 4 santimetrelik bir cuvet'e aktarın. Etanol yağışı yapılan plazmidi santrifüj edin.

Sonra% 70 etanol bir mililitre ile plazmid yıkayın. Ve 20 dakika daha santrifüjtekrar. Tüm etanol çıkarın ve pelet kısmen kurumasını bekleyin.

Daha sonra peleti önceden ısıtılmış 100 mikrolitre RPMI'de ilave olmadan yeniden askıya alın. Bundan sonra, cuvet hücrelere resuspended plazmid ekleyin. Hücreleri beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.

Sonra, hücreleri elektroporate. Sonra elektroporated hücreleri 50 mililitrelik bir tüp e aktarın. 515 g's, beş dakika için tüp ve santrifüj için tam orta 50 mililitre ekleyin.

Supernatant atın ve tam orta 50 mililitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra hücreleri 24 kuyulu kültür tabaklarına koyun ve 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tam orta bir mililitre ekleyin, her kuyuya G418 mililitre başına 10 miligram ile takviye.

48 saat sonra, her kuyunun üst hacminin bir mililitresini atın. Sonra her kuyuya G418 mililitre başına beş miligram ile takviye tam orta bir mililitre ekleyin. 96 kuyulu bir plakanın tek bir kuyuda, istenilen hedefleri ile 50.000 transfected BW hücreleri kullanın.

Plakayı 48 saat kuluçkaya yatırın. Sonra plakayı eksi 20 derecede dondurun. Anti-fare IL-2 antikorlu bir ELISA plakası katlayın.

Her kuyuya 50 mikrolitre PBS hacminde 05 mikrogram fare karşıtı IL-2 yerleştirin. Kaplamalı tabağı bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha önce hedefleri ile kuluçkaya yatırılabilen donmuş BW hücrelerini eritmek için 37 santigrat derecede kısa bir kuluçka süresi kullanın.

Sonra plakayı santrifüj edin ve her kuyudan 100 mikrolitre süpernatantı önceden kaplanmış ELISA plakasına aktarın. Ve 37 derecede iki saat kuluçkaya yat. Bundan sonra ELISA plakasına biotin anti-mouse IL-2 ekleyin.

Sonra kuluçka ve yıkama sonra, plaka için HRP konjuge streptavidin ekleyin. Kuluçka ve yıkamadan sonra, ELISA plakasının her kuyuya 100 mikrolitre TMB substrat çözeltisi ekleyin. Son olarak 650 nanometre de ELISA plaka okuyun.

Bu örnekte, CLL hücreleri farklı anti-CD20 antikorları ile önceden kuluçkaya yatırıldı. Ve sonra ELISA ile analiz edilmeden önce Fc reseptörlerini CD16 ifade transfected BW hücreleri ile birlikte inkübe. ELISA ile analiz edildikten sonra sonuçlar ölçüldü.

Optik yoğunluk seviyeleri, standart eğriye göre fare IL-2 konsantrasyonlarına dönüştürüldü. Ek bir deneyde, farklı dozlarda anti-CD20 antikorları CLL hücreleri ile ön kuluçkaya yatırıldı. Ve sonra transfected BW hücreleri ile kuluçkaya yat.

Parçacık dört ana bölümden oluşur. Klonlama, BW hücrelerinin transfeksiyonu, aktivasyon ve ELISA. Parçaların her biri bağımsız olarak doğrulanmalıdır.

Bu prosedürü takiben, nk hücre reseptörleri ile etkileşimleri incelemek için NK hücreleri ile asitleri öldürmek gibi endojen reseptörleri ifade eden hücrelerle ek deneyler yapılabilir. Bu sistemi NK hücre reseptörlerinin yeni ligandlarını keşfetmek için kullandık. Örneğin, hemagglutinin NKp46 bir ligand ve PVL TG bir ligand olduğunu.