Hücre yapışma teşvik içinde tamamlayıcı protein C1q ve Hyalüronik asit arasındaki Interplay değerlendirilmesi
15 Haziran 2019
Tamamlayıcı bileşen C1q, doku mikroortamında yüksek derecede ifade edilen, hücre dışı matriks ile etkileşimde bulunan, Pro-inflamatuar bir molekül. Burada, biz nasıl C1q hyaluronik asit etkileri hücre yapışma bağlı test etmek için bir yöntem tarif.
Hücre adezyonunu teşvik etmek için kompleman protein C1q ve hyaluronik asit arasındaki etkileşimi değerlendirmek için kapsamlı bir prosedür. Yakın zamanda doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kompleman bileşeni C1q bir molekülün yüksek tümör ve plasenta mikroortamda ifade ve ekstrasellüler matriks bileşeni ile etkileşim edebildiğini tanımlanmıştır. Bu durumda, hyaluronik asit.
Ekronomik ortamda proteinlerin biyolojik fonksiyonlarını incelemek için bir yöntem öneriyoruz. Bu moleküllerin hücre dışı matriks faktörlerinin hücre bölünmesi özelliklerini şekillendirme yeteneğini araştırmak için. Bu etkileşimin çevre dokusunda bulunan hücreler tarafından nasıl hissedildiğini incelemek için, insan dokularından elde edilen ikili hücrelerin hücre dışı matrikse bağlı C1q'a yapışmasına izin verilen bu kolay yöntemi, bu durumda hyaluronik asit.
Kaplama işlemi için ilk adım, yüksek molekül ağırlıklı hyaluronik asitin 96 iyi doku kaplı mikroplakaya bağlanmasıdır. Kaplama için, hyaluronik asit mililitre başına 15 mikrogram konsantrasyonda 0,1 mol karbon tampon PH 9.6 seyreltilir. Ve yavaşça borulama homojen bir çözüm elde etmek için requited olduğunu.
Kuyuları kaplamak için çözeltinin 100 mikrolitresi kullanılır. Plaka daha sonra bir gecede dört santigrat derece ye aktarılır. Ertesi gün vakum tedavi kuyuları aspire.
DPBS ile bir kez yıkayın. İlgili kuyulara C1q veya BSA ekleyin. C1q günümüzde ticari olarak mililitre başına bir miligram konsantrasyonda mevcuttur ve mililitre başına 25 mikrogram konsantrasyonda seyreltilir.
Ve dPBS içeren 0.5% BSA ve 0.7 milimols kalsiyum ve magnezyum ve divalent katyonlar. BSA LPS ücretsiz% 0.5 konsantrasyonda kullanılır ve tarih PBF. Plaka daha sonra bir gecede dört santigrat derece ye aktarılır.
Immobilize hyaluronik asit ile C1q doz bağımlı etkileşimleri enzim bağlı immün SA tarafından belirlenir. Hızlı DiI ile etiketleme hücreleri. Lipophilic tracer hızlı DiI ilgi hücreleri etiketlemek için kullanılır. DPBS'de yeniden askıya alınan hücreler mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonunda kullanılır.
Hızlı DiI doğrudan hücre süspansiyon içine 1-100 seyreltilir. Hücre süspansiyonu elle karıştırılır ve 37 derecede 15 dakika aktarılır. Beş dakika kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunu karıştırın ve bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
Hızlı DiI fazlalığı kaldırmak için, dPBS 10 mililitre ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pivot ve yedi dakika boyunca 250 g santrifüj. 0.1% BSA varlığında insan endophilical serum serbest ortamda bir mililitre hücre pelet resuspend.
Hyaluronik asit C1q matrisler üzerinde hücre yapışma. Vakum kaplı kuyulardan dPBS aspire. 100 mikrolitre etiketli hücre süspansiyonu kaplamalı kuyulara dağıtın.
Standart eğri üretimi için kullanılmak üzere ependure tüpünde 200 mikrolitre etiketli hücre parçalanır. Plakayı 37 derecede 35 dakika kuluçkaya yatırın. Kuvözdeki tabağı çıkar.
Dengesiz hücreleri yavaşça aspire edin. %0,5 BSA ve 0,7 milimol kalsiyum ve magnezyum içeren dPBS ile bir kez yıkayın. Lys yapışık hücreleri 200 mikrolitre lysis tampon ekleyerek.
Aynı zamanda lysis tampon etiketli hücrelerin bir ila iki seri seyreltme üzerine standart eğri hazırlamak. Floresan sinyalinin sonsuz F 200 T-can cihazında uyarma dalga boyu olarak 544 nanometre ve emisyon dalga boyu olarak 590 nanometre kullanarak okunmasını gerçekleştirin. Temsili sonuçlar.
Temsili sonuçlardan da anlaşıldığı gibi, hyaluronik asit üzerindeki hücre adezyonunun C1q'u tek başına HA veya HA'ya bağlı BSA ile karşılaştırıldığında güçlü bir şekilde geliştirilmiş olduğu açıktır. Her matristeki yapışık hücrelerin yüzdesi standart eğriye göre hesaplanır. Sonuç. Deneylerimizde öncelikle kompleman bileşeni C12'nin bu durumda hyaluronik asidi arisal bir metal kullanarak ekstrasellüler matriks bağlama yeteneğini değerlendirdik.
İkinci olarak, floresan boya ile boyanmış insan birincil hücrelerinin bağlı hyaluronik asit takibini yapmak için yeteneğini analiz ettik. Bu çalışmada önerdiğimiz model, bu hücresel yanıtın uyaranların bir kombinasyonuna karşı değerlendirilmesi için hücre dışı matris iskelelerin 3Boyutlu modeline alternatif olarak daha kolay ve daha ucuz bir yöntemdir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, tamamlayıcı bileşen C1q ve hyaluronik asit arasındaki etkileşimi araştırmakta ve bu etkileşimin hücre yapışmasını nasıl etkilediğine odaklanmaktadır. Enflamatuar bir molekül olan C1q, tümör ve plasenta mikroçevrelerinde önemli ölçüde ifade edilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- C1q, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir parçasıdır.
- Spesifik doku mikroçevrelerinde yüksek oranda ifade edilir.
- C1q, hücre dışı matrisin bileşenleriyle etkileşime girer.
- Hiyalüronik asit, hücre dışı matrisin önemli bir bileşenidir.
Çalışmanın Amacı
- C1q'nun hücre yapışmasındaki rolünü değerlendirmek.
- Hiyalüronik aside bağlı C1q'nun hücre davranışını nasıl etkilediğini araştırmak.
- Hücre dışı ortamda protein etkileşimlerini incelemek için bir yöntem geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan dokularında türetilmiş ikili hücreler kullanıldı.
- Hücrelerin, hiyalüronik aside bağlı C1q'ya yapışmasına izin verildi.
- Değerlendirme için kapsamlı bir prosedür oluşturuldu.
- Proteinlerin biyolojik fonksiyonları, hücre dışı matris bağlamında değerlendirildi.
Ana Sonuçlar
- C1q ve hiyalüronik asit arasındaki etkileşim, hücre yapışmasını artırır.
- Hücreler, hücre dışı matrisde C1q'nun varlığına tepki verir.
- Bu yöntem, hücre bölünmesi özelliklerini etkileyen hücre dışı faktörler hakkında bilgiler sağlar.
- Bulgular, doku ortamlarında bağışıklık tepkilerini anlamada önemli olabilir.
Sonuçlar
- C1q, hiyalüronik asitle olan etkileşimi yoluyla hücre yapışmasında önemli bir rol oynar.
- Geliştirilen yöntem, protein etkileşimlerini daha fazla incelemek için uygulanabilir.
- Bu etkileşimleri anlamak, çeşitli dokularda bağışıklık sistemi fonksiyonları hakkında bilgiyi artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
