Name: Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin, domuz tam kanından globin azaltılmış RNA-seq kütüphaneleri için mRNA ve ncRNA izolasyon protokolünü. Bu yöntem, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser esas olarak tarafından desteklenmiştir USDA NIFA Engelleyeceğiz 2013-67015-21236 tarafından ve kısmen USDA NIFA Engelleyeceğiz 2015-67015-23216 tarafından. Bu çalışmada kısmen randevu Tarımsal Araştırma hizmet araştırma katılım bilim ve eğitim (ORISE) için bize Enerji Bakanlığı (arasında arası bir anlaşma ile Oak Ridge Enstitüsü tarafından yönetilen programı tarafından desteklenen DOE) ve ABD Tarım Bakanlığı. ORISE Hayır DOE sözleşme altında Oak Ridge Associated üniversiteler tarafından yönetilir. DE-AC05-06OR2310.
Dr. Kay Faaberg HP-PRRSV bulaşıcı klonlar, Dr Susan Brockmeier için ona yardım hayvanlarla denemede yer ve Sue Ohlendorf yazının hazırlanmasında sekreterlik yardım için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.
Ticari adlar veya ticari ürünler bu makalede söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya ABD Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işveren olduğunu.

En iyi duruma getirilmiş yapılan protokolündeki ilk kritik adım kalite okuma tam kan örnekleri almak mümkün kılan eklenen globin tükenmesi adımları dahil. Bir tam kan sıralama çalışmalarda kullanma en büyük sınırlamalar globin moleküller için harita ve ilgi18diğer moleküller için harita okuma azaltmak okuma örnek sayısının fazlalığı vardır. Bu nedenle, bizim örnek türü için protokol optimize içinde en yüksek olası mRNA ve kodlamayan RNA aracılığıyla sıralama yakalamak emin olmak için bir globin tü...

Sonraki nesil sıralama (NGS) biyolojik organizmalar genomik düzeyinde meydana gelen değişiklikler incelenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. NGS yöntemleri için numune hazırlama organizma, doku türü, bağlı olarak değiştirilebilir ve daha da önemlisi sorular araştırmacılar adresine keskin burada. Birçok çalışma NGS için gen ekspresyonu hasta ve sağlıklı bireyler1,2,3,4gibi devletler arasındaki farklılıkları eğitim aracı olarak döndü. Sıralama bir bütün genom olarak yerleştirin ve en iyi yakalamak bir araştırmacı sağlar, değilse, genomik için tüm bilgileri belirli bir genetik marker teker teker gelin.
En yaygın veri işaretleyicilerini gözlenen ifade haberci RNA (mRNA) vardır. En çok kullanılan yordamlar prepping kitaplıkları için RNA-seq purifications, fragmentations ve d5,6bir dizi aracılığıyla mRNA molekülleri kurtarılması için optimize edilmiştir. Ancak, bir protokol yapılması için nasıl üzerinde karar ağır örnek türü ve dedi örnek hakkında yöneltilen sorular üzerine dayanmaktadır. Çoğu durumda toplam RNA elde edilir; henüz, tüm RNA molekülleri ilgi ve mRNA ifade çalışmaları gibi durumlarda ribozomal RNA (rRNA) gibi aşırı bol RNA tür tespit tutanakları mRNA'ların ile ilişkili sayısını artırmak için kaldırılması gerekir. Bol rRNA molekülleri kaldırmak için en popüler ve yaygın olarak kullanılan yöntem polyA tükenmesi7olarak anılacaktır poliadenile RNA transkript azalma var. Bu yaklaşım mRNA transkript etkilemez de mRNA ifade analizi için çalışır. Ancak, içinde ya da viral kodlamayan RNA'ların ilgilenen çalışmalarda polyA tükenmesi bu moleküller de kaldırır.
Birçok çalışma (kodlama) ya da mRNA ifade incelemek için RNA dizisi Kütüphane hazırlık veya küçük veya büyük kodlamayan RNA'ın belirli bir sınıfın odaklanmak seçin. Bizimki Çift numune hazırlama için izin gibi diğer yordamlar8 olsa da, birçok çalışma kitaplıkları ayrı örneklerinden ayrı çalışmalar ne zaman elde edilebilir için hazır olun. Bizimki gibi bir çalışma için bu normalde zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artan birden fazla kan örnekleri gerektirecektir. Çalışmamızın amacı belirlemek ve her iki mRNA farklı sınıflar ölçmek için tam kan hayvanlardan kullanmak mümkün olacaktı ve sağlıklı ve yüksek patojenik domuz üreme ve solunum Sendromu virüs (HP-PRRSV) arasında kodlamayan RNA ifade Sadece bir tek tam kan örneği (2.5 mL) her domuz olmasına rağmen domuz9,10 meydan. Bunu yapabilmek için biz tipik çıkarma ve kütüphane oluşturma protokolleri mRNA ve kodlamayan RNA (ncRNA) ifade11 tek bir örnek üzerinden analizi için izin vermek için uygun verileri oluşturmak için en iyi duruma getirmek için gerekli.
Bu mevcut standart kitleri ve RNA-ekstraksiyon ve kütüphane oluşturma yöntemlerini esas mRNA için amaçlanmıştır ve bir poli-A tükenmesi adım12kullanın çünkü mRNA ve kodlamayan RNA analizi için izin verilen bir iletişim kuralı için bir ihtiyaç istenir. Bu adımı kodlamayan RNA veya viral transkript alınan örneğin kurtarmak mümkün olurdu. Bu nedenle, en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi ihtiyaç vardı bu izin olmadan örnek polyA tükenmesi toplam RNA çıkarılması için. Bu el yazması sunulan Yöntem mRNA ve ncRNA'lar küçük ve büyük boyutlarda için sıralama kitaplıkları oluşturmak için ve tam kan bir örnek türü olarak kullanmak için izin vermek için optimize edilmiştir. Yöntem, tüm tespit kodlamayan RNA'ların analiz için izin gibi daha sonra soruşturma13viral RNA'ların korumak için en iyi duruma getirilmiş. Toplamda, bir tek tam kan örneği üzerinden birden çok RNA molekülleri incelenmesi için bizim en iyi duruma getirilmiş Kütüphane hazırlık Protokolü sağlar.
Genel amacı, bu yöntemin kullanılması arkasında hem kodlamayan RNA ve mRNA koleksiyonundan bir tam kan örneği için izin verilen bir süreç geliştirmekti. Bu bir tek örnek9' dan kaynaklı çalışma mRNA, ncRNA ve her hayvan için viral RNA olmasını sağlar. Bu, sonuçta, ek hayvan maliyeti olmadan daha bilimsel keşif için izin verir ve daha kapsamlı bir resmi tek tek her örnek ifade verir. Gen ifadesinin yanı sıra her iki karşılaştırarak bağdaşık çalışmaların tamamlanması için izin düzenleyiciler incelenmesi için açıklanan yöntemi sağlar mRNA ve kodlamayan RNA ifade tek bütün kan örneği kullanarak. Bizim çalışma gen ekspresyonu değişiklikleri incelemek için bu protokolü kullanılan ve olası epigenetik düzenleyiciler virally 9 - hafta eski erkek ticari domuzları enfekte.

<table><tbody><tr><td>PAXgene Tüpleri</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı Su</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA İzolasyon Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Temizleme Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>%100 Etanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL ince duvarlı tüpler</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL RNase/DNaz - serbest tüpler</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 kuyulu Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>Globin İndirgeme Oligo (&alpha; 1)</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td>Sıra GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>Globin İndirgeme Oligo (&alfa; 2)</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td>Dizisi TCA, ACG, ATC, AGG, TGC, AA,</td></tr><tr><td>Globin İndirgeme, Oligo (&beta; 1)</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td>, <td>Sıra: AGG, GGA, ACT, TAG, TGG, TAC, TTG, TGG, GT, Globin</td></tr><tr><td>İndirgeme, Oligo (&beta; 2)</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td>: <td>Sıra: GGT, TCA, GAG, GAA, AAA, GGG, CTC, CTC, CT</td></tr>, <tr><td>10X, Oligo, Hibridizasyon</td>, Tampon-Tris-HCl<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pH 7.6</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Moleküler Biyoloji Sınıfı Su</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>Rnaze inhibitörü</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 2100 Elektroforez Biyoanalizör Cihazı</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA&nbsp; Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Örgülü Toplam RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti, Ribo-Zero&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>mRNA kiti; İnsan/Fare/Sıçan Seti A&nbsp; (48 örnek, 12 indeks)</td></tr><tr><td>TruSeq Örgülü Toplam RNA Numune Hazırlama Kılavuzu</td><td>Illumina</td><td></td><td>Mevcut on-line</td></tr><tr><td>RNAClean XP Boncukları</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Boncukları</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optik 8 tüplü Şerit</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>N8010580 0,2 ml ince duvarlı tüpler</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik 8 tüplü Şerit Kapaklı</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase - serbest reaktif rezervuarları</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Ters Transkriptaz</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optik 96 kuyulu plakalar</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>İhtiyaca göre .3 mL plakalar yerine bunlar kullanıldı</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik yapışkan film</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Illumina için NEBNext Multiplex Küçük RNA Kitaplığı Hazırlık Seti&reg; (Set 1)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E73005</td><td>küçük RNA kiti</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Küçük RNA Kütüphanesi Illumina için Hazırlık Seti&reg; (Set 2)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E75805</td><td>küçük RNA kiti</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Arıtma Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S Süper Mıknatıs Plakası</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

kodlama ve rna sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Yenilikçi ve giderek güçlü bir sonraki nesil sıralama teknikleri gelişiyle faiz biyolojik süreçleri ile ilgili temel gen ekspresyonu incelemek için yetenek içine yeni yollar açtı. Bu yenilikler sadece araştırmacılar ifade mRNA dizilerinden genler için bu etkin hücresel işlevi kod gözlemlemek için izin, ancak çevrilmeyen ama hala kalır kodlamayan RNA (ncRNA) molekülleri düzenleyici fonksiyonları da mevcuttur. Araştırmacılar mRNA ve ncRNA ifade gözlemlemek yeteneği olmasına rağmen alışılmış odaklanmak bir veya diğer bir çalışma oldu. Çalışmalar mRNA ve ncRNA ifadede ilgileniyor musunuz, ancak, birçok kez onlar ayrı örnekleri kodlama veya RNA'ların Kütüphane hazırlıklar farklılığı nedeniyle kodlamayan incelemek için kullanın. Bu zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artırabilir daha fazla örnek için gereken yol açabilir. Ayrıca, araştırmacılar örnekleri tek bir analizi için genellikle mRNA soruşturma olması biyolojik soru sayısını sınırlama, hazırlamak karar vermek neden olabilir. Ancak, ncRNA'lar o etkisi mRNA ifade düzenleyici rollere sahip birden çok sınıf span. NcRNA olduğundan temel biyolojik süreçler ve bu süreçlerin bozukluğu için önemli enfeksiyon sırasında bu nedenle, tedavi için çekici hedefler hale getirebilir. Bu el yazması değiştirilmiş bir protokol oluşturmak için gösterir mRNA ve tam kan tek bir örnek üzerinden viral RNA da dahil olmak üzere kodlamayan RNA ifade kütüphaneler,. Bu protokol optimizasyon RNA saflık geliştirilmiş, ligasyonu metillenmiş RNA'ların kurtarılması için arttı ve boyut seçimi, daha fazla RNA türlerin yakalama izin vermek için ihmal.

Bizim çalışma temsilcisi örneklerinde globin ve ribo tükenmiş tam kan örnekleri vardır. Globin tükenmiş Kütüphane örneği bir sayıyla RNA bütünlüğü (RIN) 7 (Şekil 1bir) ve 260/280 nm konsantrasyon oranlarının ya da 2 (Şekil 1b ve 1 c) üzerinde yukarıda protokol temsilcisi sonucu oluşur. Doğrulama örnek sonucu her kitaplık son konsantrasyonu vermek için spektrofotometre kullanarak gerçekleştirilmiş...

Burada, biz (mRNA) kodlama işlem için optimize edilmiş bir iletişim kuralı mevcut ve (ncRNA) globin kodlamayan RNA-seq kitaplıkları bir tek tam kan örneğinden azaltılmış.

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Bu yöntem, konak amino yanıtında yer alan kodlama, kodlamama ve viral RNA ekspresyonunun incelenmesine ve bir patojenin konakçının biyolojik fonksiyonlarını nasıl etkileyebileceğine izin vererek konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesinde anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, globin azaltılmış RNAseq kütüphanelerinden mRNA ve kodlamayan RNA'nın tek bir tam kan örneğinden işlenmesi için optimize edilmiş bir protokol sunmasıdır. Tekniği gösteren Sarah Anderson, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 20 kez G'de kan tüplerini santrifüj ederek başlayın. Biyolojik bir güvenlik kabininde çalışan, supernatant çıkardıktan sonra, pelet için RNase içermeyen su sekiz mililitre ekleyin. Tüpleri kapatın ve pelet görünür cereyana kadar girdap, sonra 50 20 kez G'deki tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin ve peleti geri verin.Biyolojik bir güvenlik kabininde çalışarak, süpernatant'ı atın ve peleti kurtarın. Toplam RNA'yı izole etmek için, 300 mikrolitre likis bağlama tamponunun pelete boruile titreştirilerek başlayın. Girdap sonra, yeni etiketli 1.5 mililitre santrifüj tüp için her tüp karışımı aktarın.miRNA izolasyon kitinden 30 mikrolitre homojen katkı maddesi ekleyin. Tüpleri girdap ve 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Bir duman kaputunda çalışan, buz tüpleri kaldırmak ve tekrar karıştırmak için kiti ve girdap asit fenol kloroform reaktif 300 mikrolitre ekleyin.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10,000 kez G santrifüj ettikten sonra, sulu fazı yeni bir tüpe dikkatlice çıkarın. Önceki adımdaki sulu geri kazanım miktarına bağlı olarak, karıştırmak için her tüp ve pipet sulu faj için% 100 etanol hacmi 1,25 kat ekleyin. Her numune için filtre kartuşunu içeren yeni toplama tüpleri hazırlayın.Pipet yaklaşık 675 mikrolitre lysate-etanol karışımı filtre kartuşuna. Filtreden sıvı geçirmek için 10.000 kez G'de kısaca santrifüj edin. Akışı atın.Tamamen kullanılana kadar filtre ve santrifüj ekleyerek lysate-etanol karışımı tekrarlayın. 700 mikrolitre yıkama çözeltisi ekleyin bir kitten filtre kartuşu için. Çözeltiyi filtrelerden geçirmek için kısa bir süre santrifüj edin.Akış tan atın ve aynı filtre kartuşları ve toplama tüplerini saklayın. Her filtre kartuşu için 500 mikrolitre yıkama çözeltisi iki-üç ekleyin. Tekrar santrifüj den sonra, akış tan atın ve yıkama adımını tekrarlayın.Filtre kartuşlarından kalan sıvıyı çıkarmak için 60 saniye daha döndürün. Kartuşları yeni toplama tüplerine aktarın. Her filtre kartuşunun ortasına 100 mikrolitre 95 derece santigrat önceden ısıtılmış nükleaziçermeyen su ekleyin.Kartuşları masa üstü santrifüjünde maksimum hızda yaklaşık 20-30 saniye santrifüj edin. Globin azaltma oligoları ile melezleşmeyi sağlamak için, ilk olarak alınan her numuneyi 0,2 mililitre ince duvarlı çekirdeksiz reaksiyon tüpüne ekleyerek RNA'yı denatüre edin. Tüpleri 70 derecede bir termal döngüye iki dakika yerleştirin.Bundan sonra, optimum RNA kalitesini elde etmek için tüpleri hemen buza yerleştirin. Tüpler soğurken, 400 mikrolitre 10X globin azaltma oligo karışımı ve 10X oligo hibridizasyon tamponiki mililitretüp hazırlayın. Hibridizasyon karışımı yapmak için, RNA örnek altı mikrogram ekleyin, 10X globin azaltma oligo karışımı iki mikrolitre, 10X oligo hibridizasyon tampon bir mikrolitre, ve her 10 mikrolitre son hacmine çekirdeksiz su 0.2 mililitre ince duvarlı, çekirdeksiz reaksiyon tüpü.Tüpleri termal döngüye 70 derecede iki dakika yerleştirin. Bundan sonra, hemen buz tüpleri yerleştirin. RNase H sindirimini gerçekleştirmek için, ilk olarak 10X RNase H'yi bir X RNase H tamponuyla bir X RNase H'ye seyreltin.10X RNase tamponunun iki mikrolitresini, bir mikrolitre RNase inhibitörünün ve bir X RNase H'nin iki mikrolitresini ve toplam 10 mikrolitre lik çekirdeksiz suyun beş mikrolitresini birleştirerek RNase H reaksiyon karışımını hazırlayın. Globin azaltma hibridizasyon örneklerine 10 mikrolitre RNase H reaksiyon karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. Bu reaksiyonu 37 derecede 10 dakika sindirin ve sonra 4 santigrat dereceye kadar soğutun.Tüpe bir mikrolitre 0,5 molar EDTA ekleyerek sindirimi durdurun ve tüpün tüm içeriğini 1,5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Bundan hemen sonra, 80 mikrolitre RNase içermeyen su, 350 mikrolitre lysis tampon, sonra her tüpe %100 etanol 250 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Her 700 mikrolitrelik numuneyi, akış tanzimi için iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirilen ayrı bir elüsyon filtresi kartuşuna aktarın.8, 000 kez G veya daha fazla 15 saniye santrifüj ve sonra akış atmak. Aynı elution filtresi kartuşlarını yeni iki mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin. Filtre kartuş membranlarını yıkamak için, filtre kartuşlarına 500 mikrolitre hafif yıkama tamponu ekleyin ve 8, 000 kez G veya daha fazla 15 saniye santrifüj yapın.Akışı atın. Daha sonra, aynı toplama tüplerini kullanarak, filtre kartuşlarına %80 etanol 500 mikrolitre ekleyin. 8, 000 kez G ve daha büyük iki dakika santrifüj.Hem akış ve toplama tüplerini atın ve elüsasyon spin sütunlarını kaydedin. Her elution spin sütunu yeni bir iki mililitretoplama tüpü neyer. Spin kolon membranlarını kurutmak ve etanol taşımasını önlemek için filtre kartuşlarının açık kapağı yla beş dakika boyunca tam hızda santrifüj yapın.Toplama tüplerini attıktan sonra, kurutulmuş filtre kartuşuher bir 1,5 mililitrelik toplama tüpü içine yerleştirin. Doğrudan filtre kartuş membranının ortasına 14 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. RNA'yı elemek için tüpleri tam hızda 60 saniye santrifüj edin ve daha fazla RNA değerlendirmesi ve hazırlığıyla devam edin.Globin tükenmiş örnek şimdi bölünmüş ve küçük hazırlamak için kullanılabilir, kodlamayan RNA kütüphaneleri yanı sıra ribo-tükenmiş mRNA ve uzun, kodlamaolmayan RNA kütüphaneleri. Bu protokolü kullanarak globin tükenmiş ve ribo-tükenmiş tam kan örneklerinin ekspresyon kütüphaneleri hazırlandıktan sonra, elektroforez dosya çalışma özeti 6.3 ile 9.2 arasında değişen RNA bütünlüğü numaraları ile globin tükenmiş kütüphane örneği gösterdi. Bu globin tükenme yöntemleri kullanılan ve sadece altı veya yakın RIN numaraları elde edebildi diğer çalışmalara göre bir gelişme olduğunu kanıtladı.Tek bir domuz tam kan örneğinin globin öncesi ve globin sonrası indirgeme oranı nın 260-280 nanometre konsantrasyon oranlarının iki veya üzerinde olduğunu göstermiştir. Bu protokol kullanılarak havuzlama ve sıralama öncesinde globin ve riboz-tükenmiş tam kan mRNA kütüphane örneklerinin çip bazlı elektropherogramları elde edildi. mRNA kütüphaneleri için temsili elektrofegram yaklaşık 280 baz çifti ile zirveye sahiptir.Küçük ncRNA'lar için temsili çip bazlı elektropogramlar yaklaşık 100 ila 400 baz çifti arasında bir dizi tepe içerir. Yaklaşık 143 baz çifti ndeki zirveler miRNA'lara karşılık gelir ve yaklaşık 153 baz çifti ndeki zirveler piRNA'lara karşılık gelir. Bu prosedürü çalışırken, hemen nerede belirtildiği buz tüpleri hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, diferansiyel ifade, epigenetik değişiklikler ve bunların biyolojik yollar ve süreçler üzerindeki etkileri gibi ek soruları cevaplamak için yeni nesil sıralama gibi başka yöntemler de uygulanmalıdır. Fenol-kloroform reaktifile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve duman kaputunda çalışma gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Ayrıca, tam kan veya enfeksiyöz organizmalar ele alırken, çalışma bulaşıcı organizmanın aktivasyonu önce biyolojik bir güvenlik kabininde yapılmalıdır.

identification-coding-non-coding-rna-classes-expressed-swine-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Nanopore sıralamasını uzak konumlarda ve kaynak kötü ayarlarında maliyet-etkili sıralamaya izin veren bir yeni teknoloji. Burada, mRNAs 'ın bu şartlar ile uyumlu olan tüm kandan sıralanması için bir protokol sunuyoruz.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA'nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Ribozomların çevrilmesi, kodon başına üç nükleotidin peptitlere şifresini çözer. Ribozom profillemesi ile yakalanan mRNA boyunca hareketleri, karakteristik üçlü periyodiklik sergileyen ayak izlerini üretir. Bu protokol, tüm transkriptom düzeyinde aktif olarak çevrilmiş açık okuma çerçevelerini tanımlamak için ribozom profil oluşturma verilerinden bu belirgin özelliği deşifre etmek için RiboCode'un nasıl kullanılacağını açıklar.

De novo Aktif Olarak Çevrilmiş Açık Okuma Çerçevelerinin Ribozom Profil Oluşturma Verileri ile Tanımlanması

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Öğrenin, domuz tam kanından globin azaltılmış RNA-seq kütüphaneleri için mRNA ve ncRNA izolasyon protokolünü. Bu yöntem, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

Daha fazla video keşfet