Name: Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin, birincil insan immün hücrelerinde antikor bağımlı Zika virüsü artışını değerlendirmek için gerçek insan serumu kullanarak nicel gerçek zamanlı PCR yöntemiyle enfeksiyon düzeylerini ölçün.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser cömertçe 1R21AI129881-01 (T.M.C. için) başlangıç fonlar Ulusal ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar laboratuvarları ve Boston Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada kullanılan serum numuneleri bir kohort Columbia insan katılımcılardan elde edilmiştir. Örnek koleksiyon Universidad de Pamplona (Columbia, Güney Amerika) ve Los Potios hastane8iç gözden geçirme Kurulu (IRB) tarafından kabul edildi. Örnekleri anonim olarak verilmiştir ve müfettişler hasta bilgi erişim vardı. Serum numuneleri için DENV serotip kontrol edildi. Örnekleri daha fazla DENV enfeksiyon nötralize etmek için teyit edildi tüp bebek. Kumanda pilleri, serum numuneleri ABD sağlıklı bireylerden (HC) kullanılmıştır.
Not: Bu iletişim kuralı, Fcγ reseptör ifade herhangi bir insan hücre tipi ZIKV ADE çoğaltmasında incelemek için kullanılabilir. Protokol üç oluşur parçaları (Şekil 1).
1. hücre tohum ve enfeksiyon Kurulum
Not: Bu belirli çalışma, insan birincil makrofajlar veya U937 myelomonocytic hücre satırı (ATCC-CRL-1593.2) için kullanılmıştır. Hücreleri RPMI büyüme orta % 10 fetal Sığır serum ile (FBS) takıma 37 ° C kuluçka %5 karbondioksit (CO2) ile muhafaza. Tüm adımları bir Biyogüvenlik yapılmıştır 2 (BSL-2) Biyogüvenlik kabini steril koşullarda seviye.
<ol><li>Tohum 3 x 104 hücre başına bir steril düz-alt 96-şey plaka ile birlikte orta 100 µL iyi ve 37 ° C kuluçka %5 CO2koyun.</li>
	<li>Hücreleri tohum sonra serum numuneleri, oda sıcaklığında erimek ve 10 kat seri dilutions yapmak (yani, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000) serum-Alerjik orta örneklerinde karıştırma tarafından. Aliquot steril bir 96-şey plaka içine dilutions. Serum olmadan virüs ek bir denetim kullanın.</li>
	<li>ZIKV hisse senedi 1-2 min için bir su banyosunda 37 ° C'de erimek ve hızlı bir şekilde gelecekte kullanılmak üzere buz aktarabilirsiniz.</li>
	<li>ZIKV gerilme MR766 enfeksiyonu (MOI) eşit miktarda 0.1 çokluğu serum aliquots ekleyin. Not: Seyreltme faktörü sabit kalır ve toplam hacim ~ 200 µL olduğundan emin olun; triplicates her tedavi için yeterli olduğunu. Üç kuyular için aşağı akım analizi negatif kontrol kullanmak için bulaşmamış tutun.</li>
	<li>Serum dilutions % 5 CO2 için 1 h 37 ° C kuluçka eklenen virüs ile DENV karşı antikorlar formu kompleksleri Zika virions (için kullanışlı, bundan sonra "bağışıklık kompleksleri" anılacaktır) ile için izin vermek için kuluçkaya.</li>
	<li>Düz-alt 96-şey plaka numaralı seribaşı hücreleri medyadan Aspire edin. Steril 1 fosfat tamponlu tuz (1 x PBS) x hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Her şey için bağışıklık kompleksleri 50 µL ekleyin ve onları %5 CO2 37 ° C kuluçka 2s için kuluçkaya.</li>
	<li>2 h, kuluçka, Aspire edin hücrelerden bağışıklık kompleksleri içeren medyayı kullanarak bir çok kanallı pipet sonra hücre 2 yıkama x 1 x PBS tamamen bağışıklık kompleksleri ve herhangi bir bekâr virions kaldırmak için ile.</li>
	<li>100 µL FBS her şey ve hücrelerin % 5 CO2 37 ° C kuluçka 48 h için kuluçkaya % 10 ile takıma taze tam medya ekleyin.</li>
</ol>2. RNA çıkarma
<ol><li>96-şey plaka kuluçka makinesi kaldırmak ve Biyogüvenlik kabini aktarın.</li>
	<li>Medya Aspire edin, hücreleri 2 yıkama x 1 x PBS ile ve RNA ayıklama için devam edin. Not: RNA çıkarılan seçim herhangi bir yöntemle ( Malzemeler tabloiçin bakınız).</li>
	<li>Hücre lizis arabelleği ile % 10 β-mercaptoethanol şey başına 250 µL ekleyin. Pipet ucu kadar lizis prosedürü hızlandırmak için hücrelerle tırmalamak ile birlikte en az 5 x yukarı ve aşağı arabellek pipette.</li>
	<li>Hücre lysates yeni, etiketli, steril 1,5 mL tüpler için transfer.</li>
	<li>% 70 etanol (250 µL) eşit miktarda ekleyin. Karışım temizlenene kadar x - 5 x 4 yukarı ve aşağı pipet.</li>
	<li>15.000 x g 30 s. atma için santrifüj kapasitesi ile akışı ve karışımı (~ 500 µL) silis tabanlı sütunlar 2 mL koleksiyonu tüpler transfer ve sütunları aynı koleksiyon tüplerde tutmak.</li>
	<li>Yıkama arabelleği 1 700 µL her sütununu ekleyin ve 15.000 x g 30 s. atma için aracılığıyla akış santrifüj kapasitesi ve sütunları aynı koleksiyon tüplerde tutmak.</li>
	<li>Her sütun ve santrifüj yıkama arabelleğinin 2 500 µL 15.000 x g 30 s. atma süpernatant için ekleyin. 2 x bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Transfer sütunları yeni 2 mL koleksiyonu tüpler ve 2 dk. silis tabanlı sütunlar tamamen kuru olsun ve orada hiçbir etanol sağlamak için 15.000 x g , santrifüj yıkama arabelleğinden 2 yaptı.</li>
	<li>2 mL tüpler atın ve sütunlarda yeni, steril, etiketli, 1,5 mL kurtarma tüpler yerleştirin.</li>
	<li>Her sütun ve 1 dak için 15.000 x g , santrifüj ortasındaki prewarmed (42 ° C) 30 µL RNase free su ekleyin.</li>
	<li>Eluted RNA yeniden elde etmek ve bir spektrofotometre bir 260 nm dalga boyu kullanarak örnekleri, ölçmek. Not: İdeal olarak, RNA saflığı 260 absorbans değerleri arasındaki oran hesaplayarak belirlemek nm ve 280 nm. Arıtılmış RNA'ın 260/280 ideal 1.8-2.0 orandır.</li>
</ol>3. kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
Not: Nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) genellikle SYBR ben boya yeşil, Taq DNA polimeraz, deoxynucleotide trifosfatlardan (dNTPs) ve pasif bir boya oluşan herhangi bir SYBR yeşil karışımı kullanılarak yapılabilir. Herhangi bir qPCR makine SYBR yeşil tespiti kabil reaksiyonu gerçekleştirmek ve verileri elde etmek için kullanılabilir. Bu deneme için bir tek adımlı RT-PCR kiti SYBR yeşil kokteyl aldım kullanıldığı ben, ROX boya, Taq DNA polimeraz, dNTPs ve transkriptaz ek bir karışımı ( Tablo malzemeleriçin başvurmak). Zarf bölge karşı tasarlanmış ve ZIKV genomik düzeylerini ölçmek için bu çalışmada kullanılan astar ZIKV-qF için CCGCTGCCCAACACAAG ve CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT ZIKV-qR için vardır. İnsan β-2-mikroglobulin (b2a) ölçülen ve ZIKV (kat hizmetleri gen) ifade normalleştirmek için kullanılan bir denetim. Bu çalışmada kullanılan b2a gen ekspresyonu ölçmek için astar dizileri b2a-qF için CTCCGTGGCCTTAGCTGTG ve TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT b2a-qR için vardır. Her örnek için üç teknik çoğaltır ZIKV ve b2a genler için koymak için emin olun. RT-PCR Kur aşağıda kısaca açıklanmıştır.
<ol><li>
RT-PCR Kur
	<ol>
<li>Örnek başına kullanım 100 ng RNA'ın.</li>
		<li>1 µL ileriye ve geriye doğru astar her reaksiyon için belirli bir gen 10 µM stokları ekleyin.</li>
		<li>Ters transkriptaz Mix örnek başına 0,25 µL ekleyin.</li>
		<li>Her bireysel tepki için 12.5 µL SYBR yeşil karışımı ekleyin.</li>
		<li>En çok 25 µL su ekleyin. RNA, aliquot dışında tüm yukarıda belirtilen reaktifler, 96-şey PCR tabak içinde karıştırın ve RNA son eklemek bir şablonu alın.</li>
		<li>Şeffaf Yapışkan bant ile plaka mühür.</li>
		<li>1000 x g reaktifleri karıştırmak 1 dk için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Plaka qPCR alete koyayım.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RT-PCR profili Not: Tablo 1gösterilen RT-PCR profili kullanın.
	<ol>
<li>Örnekleri için 10 min 50 ° c tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi sağlamak için kuluçkaya.</li>
		<li>CDNA sentez sonra Taq DNA polimeraz 95 ° c 5 min için aktif hale getirin.</li>
		<li>10 s ve astar tavlama ve uzantısı için 30 60 ° C'de denatürasyon 95 ° C'de 40 döngüleri gerçekleştirmek s.</li>
		<li>Ek eritebilir eğrisi adım (65 ° C) sonunda koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Algori gösteren, ideal olarak, tek bir tepe tek bir amplicon ve bir amplifikasyon değeri varlığını doğrulamak belirli bir gen için tüm örneklerde fazla 1,6 Eğer qPCR makine çalıştırmak için kullanılan programın içinde erime eğrisi sekmesini tıklayarak eritebilir eğrisi izlemek THM 2 (amplifikasyon değeri qPCR makine tarafından kullanılan algoritmaya göre değişir) % 100 amplifikasyon değer olarak düşünür. 0.5 ° C sıcaklık artışları merdivenleri ve en az 10 saat holding arasında kullandığınızdan emin olun en iyi sonuçlar için erime eğrisi protokolündeki s.</li>
		<li>Emin yaptıktan sonra bir tek amplicon ve iyi amplifikasyon değer, ilk tıklayın bir nicel döngüsü (Ct/Cq değer) her örnek alın ve Microsoft Excel'e aktarmak için miktar veri sekmesinde.</li>
		<li>Bir elektronik tablo kullanarak, Ct değeri kullanarak her örnek ortalamasını hesaplamak. Ardından, formüller'i tıklatın ve ortalama seçin. Her örneği (çoğaltma) ortalama CT değerler daha ayrıntılı bir çözümleme için kullanılır.</li>
		<li>Daha sonra formül ΔCt kullanarak ΔCt hesaplamak = Ct hedef gen ortalama - Ct denetim gen ortalama (Bu durumda, ΔCt = ZIKV gen Ct ortalama - Ct b2a gen Ortalama).</li>
		<li>ΔΔCt verileri normalleştirmek için hesaplamak (Bu durumda, ΔΔCt ΔCt ZIKV örnekleri - b2a örnekleri =).</li>
		<li>Her tek ΔΔCt normalleştirilmiş değeri için formül 2^-(ΔΔCt) yazarak gen ekspresyonu kat artırmak hesaplayın. İstatistiksel testler gerçekleştirmek için kat artış sonuçlarını daha önceki çalışmalar9,10' açıklandığı gibi elde edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hayes, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outside+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus outside Africa.</a> Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).</li>
<li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+Gabon+%28Central+Africa%29+-+2007%3A+a+new+threat+from+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).</li>
<li>Fauci, A. S., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+in+the+Americas--Yet+Another+Arbovirus+Threat%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat.</a> New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).</li>
<li>Hawkes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+Infectivity+of+Arboviruses+by+Specific+Antisera+Produced+in+Domestic+Fowls%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Experimental+Biology+and+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls.</a> Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).</li>
<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).</li>
<li>Vaughn, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+viremia+titer%2C+antibody+response+pattern%2C+and+virus+serotype+correlate+with+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity.</a> The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).</li>
<li>Khandia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Dengue%2FZika+Virus+Pathogenicity+by+Antibody-Dependent+Enhancement+and+Strategies+to+Protect+Against+Enhancement+in+Zika+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection.</a> Frontiers of Immunology. 9, 597(2018).</li>
<li>Londono-Renteria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relevant+in+vitro+human+model+for+the+study+of+Zika+virus+antibody-dependent+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement.</a> Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).</li>
<li>Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+base+method+for+analysis+of+qPCR+data+and+the+application+of+simple+blocking+in+qPCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 534(2017).</li>
<li>Renn, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+real-time+RT-PCR+assay+for+determining+expression+profiles+of+types+I+and+III+interferon+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52650(2015).</li>
<li>McArthur, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+vaccines%3A+recent+developments%2C+ongoing+challenges+and+current+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates.</a> Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+cross-reactivity+between+Zika+and+dengue+viruses%3A+implications+for+protection+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology.</a> Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33(2017).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+antibody-mediated+neutralization+and+protection+against+flavivirus%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus.</a> IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+Zika+Virus+Envelope+Protein+and+Its+Complex+with+a+Flavivirus+Broadly+Protective+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody.</a> Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).</li>
<li>Sirohi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3.8+A+resolution+cryo-EM+structure+of+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus.</a> Science. 352 (6284), 467-470 (2016).</li>
<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+Exposure+to+Zika+Virus+Significantly+Enhances+Peak+Dengue-2+Viremia+in+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
<li>Charles, A. S., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+a+Dengue-Derived+Monoclonal+Antibody+to+Enhance+Zika+Infection+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Currents%22%5BJournal%5D)">Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro.</a> PLoS Currents. 8, (2016).</li>
<li>Swanstrom, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Virus+Envelope+Dimer+Epitope+Monoclonal+Antibodies+Isolated+from+Dengue+Patients+Are+Protective+against+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Olan diğer DENV serotipi ADE için önde gelen DENV antikorların bir etkili aşı11gelişimine engel. ZIKV Flaviviridae, aynı ailesine ait ve diğer flaviviruses, özellikle DENV12ile önemli bir Homoloji vardır. Hem ZIKV hem de DENV için antikorları nötralize ana hedef çok yüksek yapısal ve Kuvaterner sırası Homoloji arasında iki virüs13,14,15hisse zarf proteindir. Ya DENV ya da ZIKV önce...

Sivrisinekler yoluyla bulaşan viral hastalıklar arasında Zika enfeksiyon en klinik olarak önemli1biridir. Enfeksiyon flavivirus kullandığı, çoğu durumda, Aedes aegypti onun birincil vektör1,2ZIKV neden olur. Ancak, Aedes albopictus bazı ZIKV salgınlar3birincil bir vektör olarak bildirdin çalışma vardır. Enfeksiyon birçok durumda asemptomatik olmakla birlikte, hastalığın en yaygın belirtileri ateş, baş ağrısı ve kas ağrı2vardır. Herhangi bir tedavi veya aşı ZIKV enfeksiyonu için kullanılabilir ve mevcut tedavi çoğunlukla destek oluyor. ZIKV Güney Amerika'da son salgınları şiddetli vakalarda hastalık ve yaklaşık 20-fold microcephaly2adlı fetusa nörogelişimsel bozuklukta artışa yol açtı. Güney Amerika DENV ve Batı Nil virüsü gibi birkaç arboviruses endemik bir alan olduğu için diğer flavivirus(es) için önceden dokunulmazlık, ZIKV enfeksiyonlar ve hastalık şiddetinde bir rol oynar olup olmadığını araştırmak çok önemlidir.
Çağlar boyunca, virüs infektivite konak hücre makine almak ve antiviral yanıt bastırmak için onların şansını artırmak için farklı stratejiler geliştirmişlerdir. Biri en büyüleyici tüm ana bilgisayar önceden bağışıklık antikorlar yanında onların çoğaltma fenomen ADE4ile geliştirmek için virüs kullanımıdır. ADE DENV tüm dört serotipleri arasında iyi okudu ve viral titreleri ve hastalık sonucu5,6,7artırmak için kanıtlanmış oldu. Bir önceki tüp bebek çalışmada, önceden var olan birincil insan bağışıklık hücreleri8DENV bağışıklık nedeniyle ZIKV çoğaltma önemli enhancement göstermiştir. Biz de ZIKV çoğaltma primer hücre içinde geliştirmek için DENV önceden varolan antikor kapasitesini ölçmek için ilgili bir tüp bebek yöntemi gösterdi.
TCID-50 DENV nötralize için test edilir insan serum numuneleri geliştirdiğimiz protokolünü kullanan veya plak azaltma nötralizasyon testi (PRNT), ZIKV biyolojik ilgili hücre veya hücreleri ZIKV bulaşabilir dokulardan türetilmiş birlikte deneyleri.

<table><tbody><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>İKİZLER</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>iCycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>785BR02188</td><td>model numarası. CFX96 Optik Modülü</td></tr><tr><td>Mikrofüj 18 Santrifüj</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop-1000</td><td>Termobilimsel&nbsp;</td><td>1072</td><td></td></tr><tr><td>Quantifast SYBR-Tek adımlı RT-PCR kiti ve nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>204154</td><td>1 adımlı RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy RNA İzolasyon Kiti</td> için kullanılır.<td>Qiagen&nbsp;</td><td>74106</td><td>RNA ekstraksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>RPMI-orta&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr></tbody></table>

antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde zika şunun miktar

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Flavivirus Zika ve Guillain-Barré sendromu ve bebeklerde, microcephaly gibi nörolojik komplikasyonlara son ortaya çıkması ciddi genel güvenlik endişeleri getirdi. Son yeniden doğuş Zika virüs (ZIKV) öncelikle alanlarda nerede nüfus maruz kalmış ve öncesi dokunulmazlık için diğer yakından ilgili bir durumda olduğu gibi risk faktörleri arasında en ciddi tehdit, antikor bağımlı geliştirme (ADE) teşkil etmektedir flaviviruses, özellikle dang virüs (DENV). Burada, DENV karşı insan serum antikor ZIKV enfeksiyon birincil insan hücreleri veya hücre hatları üzerinde etkisini miktarının bir protokol açıklayın.

Şekil 1' de, ADE Protokolü taşımak için ilgili tüm adımları adım adım grafiksel gösterimi var. Bu DENV için ZIKV ADE tüm prosedürü önceden varolan dokunulmazlık nedeniyle gösteren bir Şematik diyagramı. Şekil 2 gösterir nasıl insan serum örnekleri üç farklı gruplar halinde kategorize: DENV enfeksiyon doğruladı örnekleri DENV enfekte grup olarak bilinir, DENV antikor-teyit örnekleri DENV maruz kalan grup olarak da adlandırılır ve ...

Biz insan serumu, birincil insan hücreleri ve enfeksiyon miktar nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tarafından kullanarak Zika virüs enfeksiyonu önceden varolan bağışıklık dang virüs karşı etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Bu yöntem, dang virüsüne karşı önceden var olan bağışıklığın Zika virüs enfeksiyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, gerçek insan hasta serumu ve birincil insan bağışıklık hücreleri kullanılarak kullanılabilir. Gerçek insan hasta serum örnekleri ve insan birincil hücrelerinin kullanımı ön-bağışıklık sera ve antikorlar tarafından Zika virüsü antikor bağımlı geliştirme içine daha derin bir fikir sağlar. Bu yöntem, diğer insan hücrelerinde bir virüs enfeksiyonu geliştirmek için bir hastanın kanında antikorların yeteneği içine fikir sağlar.Viral enfeksiyon düzeylerinin tespit için yeterince yüksek ama hücreleri bunaltacak kadar düşük olduğundan veya veri yorumlanmasına müdahale edilemeyeceğini sağlamak önemlidir. Steril, düz alt 96-iyi plaka iyi başına hücre kültürü orta 100 mikrolitre dördüncü hücrelere üç kez on tohumlama ile başlayın. Tüm hücreler kaplandığında, tabağı 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit inkübatöre yerleştirin ve çözülmüş insan serumu örneklerinin 10 kat seri seyreltilmesini serumsuz ortamda yapın.Virüs çözümleri ve hücrelere seyreltme eklemeden önce tüm pre-immün serumlar için serum seyreltme ve seyreltme faktörü sabit tutmak için emin olun. Daha sonra, çözülme Zika virüsü, stokları hızla buza aktarmadan önce 37 derece lik bir su banyosunda 1-2 dakika santigrat derecede santigrat siler. Serum aliquots için Zika virüsü enfeksiyon eşdeğer hacmi 0.1 çokluk ekleyin ve dang virüsü antikorları Zika virions ile kompleksleri oluşturmak için izin vermek için bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin.Kuluçka sonunda, iyi başına PBS 100 mikrolitre ile hücreleri yıkayın ve her kuyuya bağışıklık kompleksi 50 mikrolitre ekleyin. İki saatlik kuluçkadan sonra, orta yıkın ve tamamen bağışıklık kompleksleri ve herhangi bir bekar virions kaldırmak için iyi başına PBS 100 mikrolitre ile iki kez kuyuları yıkayın. Daha sonra hücre kültürü orta kuyu başına 100 mikrolitre ile hücreleri beslemek% 10 fetal sığır serum uymaktadır.Sonra hücreleri 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Enfeksiyondan iki gün sonra, her kuyuya %10 beta mercaptoetanol ile 250 mikrolitre hücre lisis tamponu eklemeden önce hücreleri her biri 100 mikrolitre steril PBS ile iki kez yıkayın. Pipet, lysis işlemini hızlandırmak ve hücre lisatlarını steril etiketli 1,5 mililitrelik tüplere aktarmak için çizilme ile en az beş kez yukarı ve aşağı.Her tüpe %70 etanol eşit hacim ekleyin ve lysat çözeltisini 4-5 kez yukarı ve aşağı inceleyip. Lysat süspansiyonları net olduğunda, santrifüj için iki mililitrelik toplama tüplerinde her çözeltiyi etiketli silika bazlı kolonlar halinde aktarın. Aynı toplama tüpleri sütunları tutarak akış atın ve ikinci bir santrifüj için her sütuna Wash Tampon 1 700 mikrolitre ekleyin.Akış tan sonra, yıkama başına iki yıkama Tamponu 500 mikrolitre ile iki kez daha kolonları durulayın. İkinci yıkamadan sonra, başka bir santrifüj için yeni iki mililitrelik toplama tüpleri sütunaktarın. Santrifüj için her sütunun ortasına 42 derece RNase-Free su 30 mikrolitre ekleyin ve eluted RNA kurtarmak.Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu veya QRTPCR analizi için 10 mikromolar stoktan bir mikrolitre gen spesifik ileri ve ters astarlar ve reaksiyon başına 0,25 mikrolitre ters transkriptaz karışımı ekleyin. Zika virüsü genetik materyalini tanıyan astarların viral genleri tespit edeceğini ve enfeksiyon nicelemesine olanak sağlayacağını unutmayın. Daha sonra, 96-well QPCR plaka her kuyuda Master Mix 15 mikrolitre ekleyerek her reaksiyona 25 mikrolitre su ardından SYBR Green Mix 12,5 mikrolitre ekleyin.Master Mix kullanırken, Karışıma 100 nanogram RNA numunesi ekleyin ve Master Mix'i QRTPCR plakasının tek tek kuyularına pipetlendirin. Örneklerin aynı QRTPCR plakasında üç kat olarak çalıştırılması gerektiğini unutmayın. Daha sonra örnekleri tabloda belirtilen parametrelere göre nicel bir PCR makinesinde çalıştırın.Erime eğrisini izlemek için sistem yazılımındaki erime eğrisi sekmesini tıklatma. Erime eğrisi, belirli bir genin sadece bir amplicon varlığını doğrulamak için tüm örneklerde tek tepe gösterecektir. Optimum sonuçlar için, erime eğrisi protokolünde adımlar arasında 0,5 derece sıcaklık artışları ve en az 10 saniye tutma süresi kullanın.Ardından, her örnek için nicel bir döngü elde etmek ve daha fazla niceleme çözümlemesi için verileri bir elektronik tabloya aktarmak için niceleme veri sekmesini tıklatın. İnsan serum örnekleri üç farklı gruba kategorize edilebilir: dang virüsü enfeksiyonu doğrulanmış örnekler, dang virüsü antikor onaylı örnekler, ve hiçbir dang virüsü nötralize antikorlar veya RNA ile sağlıklı sera. 48 saatlik enfeksiyondan sonra QRTPCR analizi, dang virüsü içeren seraların çoğunun 1-4 antikor içeren seranın Zika virüsü replikasyonunu farklı seviyelerde geliştirebildiğini göstermektedir.Zika virüs titres en yüksek artış zika virüsü nispeten daha düşük indüksiyon gösteren serotip bir ve üç göre sera içeren dang virüsü serotip iki ve dört antikorile tedavi makrofajlarda bulunur. Steril bir ortam sağlamak, uygun kişisel koruma ekipmanLarını takmak ve çözülmüş virüs serum örneklerini ve QPCR reaktiflerini her zaman buz üzerinde tutmak önemlidir. Bu protokol kolayca hasta serum bir panel kullanarak sarı humma virüsü, dang virüsü veya Batı Nil virüsü gibi diğer flavivirus antikor bağımlı geliştirme çalışma için değiştirilebilir.Bu teknik, arbovirüs veya viroloji alanlarında gelecekteki antikora bağımlı geliştirme çalışmaları yürütmek için son derece yararlı olacaktır. Uygun biyogüvenlik seviyesi her zaman iki kişisel koruma ekipmanı kullanılmalı ve tüm viral atıklar imha edilmeden önce 30 dakika boyunca %10 çamaşır suyu yla dezenfekte edilmelidir.

quantification-antibody-dependent-enhancement-zika-virus-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Bu videoda, Zika Virüsü Nekahet Serumu kullanılarak Dang virüsü enfeksiyonunun antikora bağlı artışını (ADE) ölçmek için yapılan bir test gösterilmektedir. Tahlil, yeşil bir floresan proteini kodlayan Dang muhabiri viral partiküllerini (RVP'ler) kullanır. Zika Virüsüne karşı serum antikorları, bir kompleks oluşturmak için RVP'lerle çapraz reaksiyona girer. Bağlı antikorlar, akış sitometrisi kullanılarak tespit edilen Fc reseptörünü eksprese eden hücreler tarafından RVP alımını arttırır.

Viral Enfeksiyonun Antikora Bağlı Artışını İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Video, bir insan patojeni olan Zika virüsüne karşı antiviral aktiviteye sahip interferonların taranması için bir in vitro testi göstermektedir. Konakçı hücre içinde, Zika virüsü içselleştirildikten sonra çoğalır, komşu hücreleri enfekte eder ve farklı bölgeler veya viral plaklar oluşturur. Antiviral bir ajan olarak işlev gören tip I interferon, virüs çoğalmasını engeller, böylece konak hücre tek tabakasında viral plakların oluşumunu önler.

Zika Virüsü Büyümesinin Güçlü İnhibitörleri Olarak İnterferonları Taramak için İn Vitro Test

Bu video, insan fetal nöral kök hücrelerini Zika virüsü ile enfekte etmek için bir prosedürü göstermektedir. Enfekte olmuş hücreler daha ileri çalışmalar için kullanılabilir.

Fetal Nöral Kök Hücrelerin Zika Virüsü Enfeksiyonu

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Bu protokol, iki-plazmid bulaşıcı bir cDNA klonundan bulaşıcı Zika virüsünün iyileşmesini tanımlıyor.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Biz enfeksiyon antikor bağımlı geliştirme tarafından Zika virüs nekahat serum dang virüs muhabir Viral parçacıkların kullanarak ölçmek için basit ve kolay bir iletişim kuralı tanımlamak.

Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

Mevcut protokol, Zika virüsünün (ZIKV) Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinde yayılımını ve 24 oyuklu ve 96 oyuklu (yüksek verimli) formatlarda hücre bazlı kolorimetrik immüno-tespit yöntemleri kullanılarak ZIKV'nin miktar tayinini açıklamaktadır.

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

Burada, insan hücrelerinde Zika virüsü enfeksiyonunu ve replikasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için çok kolay ve basit bir yöntem olarak hücre bazlı elektriksel empedansın (CEI) kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca, CEI testi antiviral bileşiklerin değerlendirilmesi için yararlıdır.

Zika Virüsü İnhibitörlerini Gerçek Zamanlı Olarak Değerlendirmek için Hücre Tabanlı Elektriksel Empedans Platformu

Öğrenin, birincil insan immün hücrelerinde antikor bağımlı Zika virüsü artışını değerlendirmek için gerçek insan serumu kullanarak nicel gerçek zamanlı PCR yöntemiyle enfeksiyon düzeylerini ölçün.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

Daha fazla video keşfet