Name: Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Öğrenin, fare epidermal keratinosit izolasyonu ve in vitro klojenik kültür yöntemini. C57BL/6 sıçanlarından yaklaşık 30 milyon canlı hücre elde edilir. Bu teknik, epidermal kök hücre araştırmaları ve cilt karsinojenezi modelleri için yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların hiçbir takdiri yok.

Tüm omurgalı hayvan kullanım protokolleri Önerilen NIH ve hükümet yönergeleri uyarınca Minnesota Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Besleyici Katman Başlatma ve Subculturing
<ol><li>Şişeyi 37 °C'lik su banyosuna 1-2 dakika süreyle yerleştirerek sıvı nitrojen tankından 3T3 dondurulmuş İsviçre faresi içeren bir hücreşişesini eritin. Şişedeki hücre sayısı yaklaşık 1 x 106'dır.</li>
	<li>Son buz parçası eridiğinde 3T3 hücreli şişeyi çıkarın. Tüpü %70 alkol beziyle silin. Sonra şişeyi biyogüvenlik kabinesine aktarın.</li>
	<li>Hücreleri yavaşça Bir T-150 şişesine aktarın ve 3T3 şişesini 1 mL CGM orta ile durula. Yavaş yavaş hücrelere önceden ısıtılmış 3T3 Komple Büyüme Ortamı (CGM) 30 mL ekleyin. Yavaşça eşit 3T3 fibroblast hücreleri yaymak için şişe kaya. Şişeyi hücre satırı ayrıntıları, tarih ve geçiş numarasıyla uygun şekilde etiketle.</li>
	<li>Hücreleri %5 CO2 ve %95 nem ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: ATCC'ye göre, İsviçre faresi 3T3'ün iki katına çıkarma süresi 18 saattir; konfluent (kontak inhibe) zaman, yoğunluğu cm2başına yaklaşık 40.000 hücre . Biz başlatma dan sonra 10-15 pasajlar içinde 3T3 belirli bir çizgi kullanın. Daha hızlı büyüme veya mil şeklindeki hücrelerin varlığı yüksek geçitlerde oluşabilir ve genellikle 3T3 yetişkin fare keratinositler için besleyici hücreler gibi performans olmaz bir işaretidir. Hızlı büyüme oluşursa, alt geçit hücrelerinden yeni bir çizgi başlatmak daha iyidir.</li>
	<li>Ölü hücreleri ve kalan DMSO 'yu (kriyoprezervasyon ajanı) ve ondan sonra haftada iki kez kaldırmak için 24 saat sonra ortamı değiştirin. Hücrelerin %80'inin biraraya gelmesine izin verin ve kültür başlatma için T-150 şişelerini kullanın. Başlatmadan sonra alt kültür için T-225 şişelerini kullanın.</li>
	<li>Altkültür 3T3 fibroblast hücreleri için, hücre kültürü kuluçka dan şişe kaldırmak ve gentamisin ile soğuk steril PBS (1x) ile iki kez yıkayın. Önceden ısıtılmış pipet 10 mL (37 °C su banyosu) tripsin çözeltisi (%0,25) Her T-225 şişesine.
	<ol>
<li>Şişeyi 3-8 dk. Bir ısınma plakasına yerleştirin. Şişeyi çıkarın ve hücreleri ayırmak ve ters mikroskop altında hücre ayrışmasını onaylamak için şişenin duvarlarına dokunmak için avuç içlerini hafifçe kullanın. Trypsin çözeltisi müstakil 3T3 hücreleri ile bulutlu görünebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Şişenin hücre büyüme yüzeyini yıkamak için tripsin çözeltisini 3-4x pipetlendirin ve 50 mL konik tüpte trypsined hücreyi 30 mL CGM'ye aktarın. 50 mL konik tüpten CGM-tripsin hücrekarışımının 10 mL'si ile şişeyi 3-5x yeniden yıkayın. NOT: 50 mL'lik bir tüpe iki şişe içeriği nin içeriği eklenebilir; sadece bir şişe kullanılırsa, 50 mL'lik bir tüpte 10 mL tripsin/hücreyi 20 mL CGM'ye yerleştirin.</li>
	<li>4 °C'de 7 dk için 160 x g'de 50 mL konik boruyu santrifüj edin.</li>
	<li>Şimdi supernatant aspire ve CGM 5 mL ile hücre pelet resuspend, yavaşça pipetting ~ 10x tamamen hücre pelet bozmak için. 50 mL konik borunun toplam hacmini 15 mL'ye çıkarmak için 10 mL CGM ekleyin.
	<ol>
<li>Tekrar ~ 10x karıştırın ve 3 ayrı T-150 şişeiçine hücre süspansiyon 5 mL yerleştirin. Alt kültür oranı T-225 şişelerinde 1:3 veya T-150 şişelerinde 1:4'tur. Şişelerin her birine önceden ısıtılmış 3T3 CGM'den 30 mL ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Şişeyi hücre satır adı, hücre tohumlama tarihi ve geçiş numarası ile etiketle.</li>
	<li>Alt kültür adımında santrifüj sonrasında 3T3 hücrelerini dondurmak için 50 mL'lik tüpü santrifüjden çıkarın ve bir buz kovasına yerleştirin. Supernatant aspire ve hasat her şişe için% 5 DMSO-DMEM karışımı 1 mL ile hücre pelet resuspend (Tablo 1bakınız).</li>
	<li>Her cryovial içine hücre süspansiyonu ile DMSO-DMEM karışımı 1 mL yerleştirin (3T3 flask hasat başına bir cryovial). Şişeyi geçiş numarası, hücre satır adı (3T3) ve hücrelerin dondurulduğu tarihle etiketlendi.</li>
	<li>Bu 3T3 hücreli şişeleri hücre dondurucu kavanozuna yerleştirin (bkz. MalzemelerTablosu) ve -70 °C dondurucuya >5 h. Şişeleri hücre dondurucu kavanozundan çıkarıp bir sonraki kullanıma kadar uzun süreli depolama için sıvı nitrojen depolama tankına aktarın . Hücre hattı adı, tanktaki konumu ve laboratuvar sıvı azot envanter sayfasına tarih hakkında bilgi girin.</li>
</ol>2. X-ışını Işınlama ve Tohumlama için 3T3 Besleyici Tabakasının Hazırlanması
<ol><li>3T3 hücrelerini ışınlamalarından bir hafta önce hazırlayın ve ~%100 birleşmelerine izin verin. 3T3 hücreleri genellikle 120 ile 130 arasında olan geçitler içindedir.</li>
	<li>
Primer keratinositlerin başarılı klojen tahlilleri için, 3T3 hücrelerini tohumlamadan önce, yüzey kaplaması 60 mm Petri kaplarını kollajenle kaplar.
	<ol>
<li>Alt yüzeyi kaplamak ve fazla kollajen kaplama sıvısını çıkarmak için 60 mm Petri kaplarına kollajen kaplama çözeltisinin yaklaşık 2-3 mL'lik pipet'i (Bkz. Tablo1). Petri yemeklerini en az 1 saat boyunca %5 CO2 ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesine aktarın. Kuvözde bulaşıkların kurumasına izin vermeyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>X-ışını ışınlama adımı: 1.4-1.6 adımlarını izleyin. Hücre peletini yeniden askıya almak, konik boruyu kapatmak ve parafin sızdırmazlık filmi ile mühürlemek için 50 mL taze CGM kullanın. Herhangi bir kontaminasyonu önlemek için, tüp ve buz üzerinde yer içeren parafin mühürlü hücre çift çanta için plastik torba kullanın. Bir mitomisin tabanlı alternatif besleyici tabaka keratinosit kültürüiçinkullanılabilir 7 .</li>
	<li>
50 mL konik tüpteki fibroblast 3T3 hücrelerini biyolojik bir x-ray makinesi ile 5.000 rad (50 Cgy) dozu ile ışınlayın. Bu hücreleri CGM media ile birlikte ışınla.
	<ol>
<li>X-ışını ışınlamasonra, 4 °C'de 7 dakika için 160 x g santrifüj hücreleri. Süpernatant ortamı aspire edin ve 5 mL CGM ile hücre peletini yavaşça yeniden askıya alın ~10x.'ı hafifçe üçe katlayın. Şimdi orta ve triturate 10x ek 25 mL ile 30 mL için son hacmi getirmek. Bu üçleme adımları clonojenite tsay için tek tip 3T3 fibroblast tabakası için çok önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Canlı Hücre sayma: Düzenli cam hemositometre kullanarak keratinositleri sayın. Hücrelerin yaklaşık 0,5 mL'sini alın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Hücre karışımı 200 μL çıkarın ve eşit hacim ekleyin 0.4% Trypan mavi çözelti ve karışım 3-4x. Hücreleri hemositometre ile aktarın ve tüm çekirdekli hücreleri (küçük altın ve pembe hücreler) canlı hücreler olarak sayın. Canlı altın hücrelerin son konsantrasyonu hesaplayın.</li>
	<li>Pipet 1 x 106 3T3 hücreler (en az 7 x 105) hücre kullanılabilir) içine 60 mm kollajen kaplı Petri kapları (adım 2.2) ve yavaşça modifiye edilmiş yüksek kalsiyum Williams E medya 4 mL ekleyin (Tablo 1bakınız). Taze tohumlu 3T3 hücrelerinin 24 saat boyunca bağlanmasına izin verin. Ertesi gün, taze birincil keratinosit hasat ve aşağıda belirtildiği gibi clonogenic tsay için ekli 3T3 fibroblast tabakasının üstüne tohum.</li>
</ol>3. Birincil Keratinosit Hasat ve Tohumlama
<ol><li>Onaylanmış hayvan tesisi/IACUC standartlarına göre CO2 inhalasyonu ile dört ila beş yetişkin dişi fareyi ötenazi. Ancak, bu protokol tek dişi/erkek fareler için de kullanılabilir.
	<ol>
<li>Bir elektrikli hayvan makası ile dorsal kürk yaklaşık 9 cm2 Klip ve yeterli poviyo iyot antiseptik çözeltisi ile 500 mL kavanoza tüm kırpılmış fareler yerleştirin (fırçalamak değil) 1-2 dakika boyunca onları kapsayacak şekilde. fareler üzerinde çözelti.</li>
		<li>Çözeltiyi dökün ve sıvı temizolana kadar temiz suyla durulayın. Aynı antiseptik yıkamayı tekrarlayın ve ardından su durulayın. İyot çözeltisi ile antiseptik yıkama sonra, 5-10 dakika boyunca% 70 etanol tüm fareler ıslatın. NOT: Açık kürklü fareler (örneğin, BALB/c) antiseptik iyot yıkarlarından hafif sarımsı bir renk korurken, koyu fareler (örneğin, C57BL/6) tutamaz. Özellikle, hücre canlılığı veya kültür büyüme sarı renk nedeniyle etkilenmez.</li>
	</ol></li>
	<li>Dikkatle bir laminar akış kaputunda başparmak forceps ve makas kullanarak kırpılmış sırt derisi çıkarın. Excised dorsal deri konik tüp PBS/2x gentamisin ile dolu yerleştirin. Kültürde meme hücresi kontaminasyonunu önlemek için ventral yan deri kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Otoklavlı forceps ve neşter kullanarak, ince bir Petri çanak üzerine aşağı bir anda kıllı tarafında bir dorsal deri yerleştirin. Yarı saydam olana kadar deri dokusunun ventral tarafında yağ da dahil olmak üzere tüm deri altı doku kazıma başlayın. Deri (saç folikülü parçası) yırtılma olmadan deri altı doku maksimum izleri kaldırmaya çalışın. Ayrıca, uzun süre kazıyın ve cilt kurumasını önlemek.
	<ol>
<li>Kalan tüm ciltler işlenene kadar kazınmış cildi PBS çözeltisinde tutun. Neşter kullanarak derileri 0,5 cm x 1-1,5 cm şeritler halinde dilimleyin ve kıllı tarafı steril bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Dikkatle pipet 20 mL PBS/2x Gentamicin çözeltisi tripsin (%0.25) ile karıştırılır 100 mm x 20 mm plastik Petri kabına. Steril forsepskullanarak, derileri aktarın ve 32 °C'lik bir kuluçka makinesinde 2 saat boyunca tripsin çözeltisinin yüzeyinde tüylü tarafı yüzdürün. NOT: Tripsinizasyon süresi ve sıcaklık, yüksek oranda ekilebilir primer keratinositlerin verimi için çok önemlidir. Diğer yöntemler canlı hücrelerin iyi verimleri sağlayabilir rağmen, keratinositlerin kültür daha az tatmin edici olmuştur.<ol>
<li>Bu 2 saat kuluçka süresi boyunca, kollajen kaplama ile kaplama yemekleri ve 37 °C'de 1 saat (bkz. adım 3.1.2). Clonogenic tahliller için, 60 mm Petri kaplar zaten 24 saat önce keratinosit hasat önce ışınlanmış 3T3 besleyici tabakası alt eklemek ve eşit olarak yayMak için izin kaplı olmuştur. NOT: Klojenik kültür için kültür yemeklerinin kapama uygun bağlanması, koloni oluşumu ve fare epidermal keratinositlerin nihai büyümesi/çoğalması için çok önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Epidermal kazıma adımı: Steril plastik kare Petri kabı nı düzenleyin ve 15 mL hasat ortamıyla uygun epidermal kazıma için 30° eğimde bir yüzey oluşturun (Bkz. Tablo 1). Dikkatle kavisli forseps ile tripsin çözeltisi yüzen bir deri şeridi çıkarın. Yeni bir neşter bıçak ile, epidermis ve orta içine tüyleri kazıyın.
	<ol>
<li>Aşırı güç kullanmayın, ancak epidermisin kazınması için yeterli güç kullanın, yoksa hücrenin canlılığını etkiler.</li>
		<li>Epidermis kazıma sırasında, bıçak deri parçasıdik tutun. Bıçak bıçağın hareketine doğru açılı ise, cilt yırtılma şansı daha fazladır. Bıçak bıçak hareketinden uzağa açılı ise, yetersiz epidermis çıkarma şansı daha fazladır.</li>
	</ol></li>
	<li>Dikkatle steril bir 60 mL kavanoz (otoklavable ve yeniden kullanılabilir) içine kazınmış epidermal hücreleri içeren hasat ortamı dökün 1.5 inç manyetik karıştırma çubuğu ile. Kalan epidermal hücreleri toplamak ve son hacmi 30 mL'ye getirmek için Petri kabını ek hasat ortamıyla durulayın. Bir manyetik karıştırıcı kullanın ve oda sıcaklığında 20 dakika için 100 rpm karıştırın. Bu işlem kıllardan kapana kısılmış epidermal hücreleri ortadan kaldıracaktır.</li>
	<li>Steril 70 m hücreli bir süzgeci 50 mL konik tüpün üzerine yerleştirin. Hücre süzgeci 50 mL konik tüpün üstüne sığar.
	<ol>
<li>Kavanozu biyogüvenlik başlığının içine götür. Karıştırma çubuğunu çıkarın ve içindekileri 50 mL konik bir tüpe bağlı süzgeç filtresine dökün. İstenmeyen saç ve stratum korneum yaprak dışarı süzün.</li>
		<li>Süzgeç içinde stratum korneum malzemeleri ile birlikte saç basın ve sıkışmış saç hücrelerini serbest bırakmak için onları işlemek. Kalan kapana kısılmış hücrelerin serbest bırakılması ve tüp içine akmasını sağlamak için 5 mL hasat ortamı kullanın. Konik tüpte toplam hacmi 50 mL'ye kadar getirin.</li>
	</ol></li>
	<li>4 °C'de 7 dk için 160 x g hücre filtrasyon ve santrifüj ile 50 mL konik tüp kaplayın. Sonraki supernatant aspire ve hasat orta 5 mL ekleyin. Hücre peletini 5 mL pipetle hafifçe ~20x'i üçe katlayarak yeniden askıya alın.
	<ol>
<li>Bu adımda, herhangi bir toplama önlemek için bir buzlukta hücreleri tutun. 25 mL hasat orta ve triturate tekrar (20-25x) ekleyin.</li>
		<li>Bu adımda doğru bir keratinosit sayımı sağlamak için, hücre süspansiyon 1 mL almak ve 19 mL hasat orta ekleyin. Hücre seyreltme 50 mL konik tüp 1:20 olduğunu. Keratinositler tek bir fareden hasat edilirse, hücre süspansiyonunun hacmini ayarlayın. 30 mL yerine, 15 mL kullanın ve hücreleri saymak için 1:10 seyreltme yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Pipet 50 mL konik tüpten seyreltilmiş hücrelerin 0,5 mL 'si (1:20 seyreltme) ve 1,5 mL otoklavlı mikrosentrifuge tüpüne aktarın. 0,2 mL (200 μL) hücre karışımını başka bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe çıkarın ve %0,4 Trypan mavi çözeltisi eşit hacim (200 μL) ekleyin. Bu çözeltiyi 3x'i yavaşça karıştırın ve çekirdekli keratinositleri saymak için hücreleri hemositometreye aktarın.
	<ol>
<li>Trypan mavisi için tüm koyu mavi hücreleri canlı olmayan ölü hücreler olarak puanlayın ve küçük altın ve pembemsi hücreleri canlı hücreler olarak puanlayın. Fare başına son keratinosit verimi yaklaşık 30 milyon canlı hücre olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>4 °C'de 160 x g'de 7 dk için orijinal 50 mL konik tüpü (adım 3.8'den) santrifüj edin. Bu adımda, istenilen ortamda hücreleri resuspend ve tohumlama hücreleri için gerekli seyreltme yapmak.
	<ol>
<li>Kitle kültürü için, hücre kültürü orta (KGM tipi orta + monolayer kültürler için takviyeleri) her 35 mm Petri çanak tohum 2 ila 4 milyon canlı altın hücreleri (Tablo 1bakınız). Bir klojen (koloni oluşumu) taht için, x-ışını Üzerinde 60 mm Petri çanak başına 1.000 hücre tohum Kollajen kaplama ile İsviçre fare 3T3 besleyici katmanları ve takviyeleri ve serum ile modifiye William's E orta.</li>
		<li>35 mm ve 60 mm Petri kapları için sırasıyla 2 ila 4 mL orta kullanın. Ayrıca, formüle DMEM ve Williams E orta ATCC'den% 5 CO2kullanmak için sodyum bikarbonat azaltılmış düzeyleri ile temin .</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür hücrelerini (kütle veya klonojenik) 32 °C'de, %95 nem de %5 CO2ile büyütün. Kitle kültürü için ilk tohumlama bir gün sonra medya değiştirin, ve daha sonra 3x haftalık sonra. Ancak, klonal tahliller için, ilk orta değişim hücre tohumlama sonra 2 gün ve 3x haftalık bundan sonra.</li>
	<li>Klonal kültür için, iki ve dört haftalık aralıklarla hücreleri yetiştirmek. Klonal kültürlerin tamamlanmasından sonra (2 veya 4 hafta), orta aspire. Kolonileri oda sıcaklığında bir gecede %10 tamponlu formalin ile düzeltin ve otoklav suyunda %0,5 rhodamine B ile 1 saat boyunca lekeleyin. Daha sonra, bulaşıkların kenarından bir pipet ile rhodamine B lekesini çıkarın.
	<ol>
<li>Bulaşıklar temizolana kadar bulaşıkları soğuk otoklavlı suyla durulayın. Tabakları tabakların kapağına koyup son koloni sayımı için kurutun. Özellikle, klojenik kültür analizi yaparken, asla pipet <1 mL hücreleri. Hücreler konsantre ise, seri hücre konsantrasyonu seyreltmek.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+primary+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+from+normal+adult+murine+epidermis%2C+following+initiation%2C+and+during+promotion+of+epidermal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors.</a> Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).</li>
<li>Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+murine+keratinocyte+stem+cells+based+on+cell+surface+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).</li>
<li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).</li>
<li>Redvers, R. P., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+primary+adult+murine+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).</li>
<li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li>
<li>Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C-treated+3T3+fibroblasts+used+as+feeder+layers+for+human+keratinocyte+culture+retain+the+capacity+to+generate+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids.</a> Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).</li>
<li>Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorris%2C+RJ+%22Procedure+for+harvesting+epidermal+cells+from+the+dorsal+epidermis+of+adult+mice+for+primary+cell+culture+in+%E2%80%9Chigh+calcium%E2%80%9D+defined+medium%22">Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium</a>. , Cambridge University Press. (1994).</li>
<li>Wu, W. Y., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+harvest+and+assay+of+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+stem+cells+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).</li>
<li>Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+keratinocyte+stem+cell+regulatory+loci+implicated+in+skin+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).</li>
<li>Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+keratinocyte+colony+number+is+genetically+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled.</a> Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).</li>
<li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+microarray+transcriptome+profiling+of+CD34-enriched+mouse+keratinocyte+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).</li>
<li>Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+covalent+DNA+adducts+in+mouse+epidermal+subpopulations+after+topical+application+of+benzo%28a%29pyrene+and+7%2C12-dimethylbenz%28a%29anthracene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene.</a> Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).</li>
<li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal%2C+multipotency%2C+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118 (5), 635-648 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan keratinosit hasat yöntemi yetişkin dişi farelerin arkasından yüksek küllü primer epidermal keratinositler üretmek için geliştirilmiştir. Bu keratinositler akış sitometrisi, moleküler biyoloji uygulaması ve kloojenik tsay da dahil olmak üzere birincil hücre kültürü için uygundur. Bu keratinosit hasat yöntemi de kutanöz kimyasal karsinogenez ve tümör promosyondiğerdownstream yönlerini incelemek için yararlı olmuştur1 ,13.
Protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, sertlik ve tekrarlanabilirlik için 54 ± 2 gün yaş kadın fareler kullanıldı. Bu bize farelerin birden fazla suşları hassas ve kantitatif koloni tahlilleri gerçekleştirmek ve bağlantı analizinde en az bir yeni kök hücre düzenleyici gen10,11belirlenmesine yol açan bir fenotip olarak kullanmak için sağladı. İkinci olarak, tripsinizasyon cildi bütün tutmaya çalışırken daha etkili olduğu gibi, daha küçük parçalar halinde derileri kesmek için yararlıdır. Üçüncü olarak, tripsin yüzdürme zamanı ve sıcaklığı sonraki suçluluk için çok önemlidir. Ayrıca, bir ekli hücreleri yerinden etmek için filtre üzerinde kalan kılları "önemli ölçüde dürtmek" gerekir. Bu adım hücrelerin yüksek verim elde etmek için önemlidir. Ayrıca, kuvöz32 °C sıcaklık yetişkin farelerkeratinositlerin uzun vadeli ekimi için önemlidir. Son olarak, bu protokolde, in vitro ve in vivo deneyler1 paralel okumalar alt kültürler veya hücre hatları yerine birincil kültürlere dayanmaktadır. Özellikle, bu protokolü kullanarak ilk kez birincil keratinosithas eğer, histopatolojik gözlem ile epidermis ile birlikte saç köklerinin tam kaldırılmasını onaylamak için kazıma sonra kalan dermis tutun.
Yetişkin fare keratinosithas için bu protokolün temel gücü birçok downstream uygulamaları için uygun culturable hücrelerin yüksek verimleri üretir olmasıdır. Başlıca sınırlama bazı hücre yüzeyi epitopsinizasyon immünostaining tehlikeye olabilir gibi hassas olabilir. Bu nedenle, yeni bir hücre yüzeyi antikor test ederken, karşılaştırma için hasat için bir dispase6 veya termolizin5 tabanlı yöntem kullanmak ihtiyatlı olabilir. Bu protokolün önemi, kitle kültürleri için clonogenic kök hücreler1,9,10,11, için tahliller gibi çeşitli uygulamalara titizlikle test edilmiş, sayısallaştırılmış ve çeşitli uygulamalara uygulanmış olmasıdır. biyokimya8, kök hücre analizinde FACS sıralama için3,4, moleküler biyoloji için3,12, ve devam eden RNA ve DNA dizileme için.

Memeli derisi tüm vücudu kaplar ve çok sayıda fonksiyona hizmet eder (örn. birincil fiziksel bariyer, sıcaklık regülasyonu ve nem tutma). Son 50 yılda, fare derisi üzerinde yapılan temel araştırmalar, cildin yapısı ve işlevi hakkında yeni bilgiler vermiştir. Fare derisi modeli büyük ölçüde kimyasal veya ultraviyole radyasyon kaynaklı karsinogenez karmaşık moleküler mekanizmaları arkasındaki temel biyoloji anlaşılmasına yardımcı oldu. Bu fare derisi modelleri insan cilt hastalıklarının anlaşılmasına ve hafifletilmesine önemli bir katkı sağlamıştır. Saç folikülü gelişim biyolojisi, kök hücre araştırmaları, karsinogenez ve epidermisin genetik keşfinde primer keratinositlerin daha fazla moleküler diseksiyonu araştırmak için, birincil epiteli izole etmek ve kültürü yapmak sıklıkla arzu edilir. in vivo deneylere paralel olarak kullanmak için fare derisinden keratinositler. Bu yöntemin geliştirilmesinde motive edici faktör klonojenik epidermal ve saç folikülü kök hücreleri 1 için bir in vitro tsay ihtiyacı oldu1,2. Klojen tahliller için uygun epidermal hücrelerin tek hücreli süspansiyonlar için acil bir ihtiyaç da vardı3, floresan hücre sıralama aktive, ve akış sitometri3,4. Bu yöntemin avantajları sağlam bir hasat diğer yöntemler üzerinde büyüklük bir sıra artışvardır 5,6, saç köklerinin epitel kısmının dahil, ve hasat hücrelerinin yüksek culturability. 1980'lerde, bu gereksinimleri karşılayacak bilinen bir yöntem yoktu. Sonraki yıllarda, bu yöntem hücre verimini artırmak için rafine edildi. Bu yöntemin temel sınırlama immünorreaktivite tehlikeye bazı tripsin duyarlı antikorların maskeleme olacaktır6.
Fareler özel Patojen Ücretsiz kurallara göre hayvancılık aldı. 1-5 dişi fare 54 ± 2 günlük yaş elde edildi. Yaşlı farelerde, keratinositlerin canlılığı saç döngüsünün anajen faz (büyüme) nedeniyle azalacaktır. Ayrıca, tripsinizasyon süreci genç farelere göre daha zordur. Hasat prosedürü, dişi farelerin erkekle karşılaştırıldığında daha ince derileri için başarıyla optimize edilmiştir. Erkek fareler genellikle keratinosit hasatları için kullanılmaz, çünkü barınma sırasında birbirleriyle savaşma eğilimi vardır ve bu nedenle deride çizikler veya yaralar bırakabilirler.

<table><tbody><tr><td>%0,4 Tripan mavisi 1x in 0,9% tuzlu</td><td>su Life Technologies Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES Tampon</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Pivot halkalı steril 1,5 inç manyetik karıştırma çubuğu</td><td>Bel-Art, Wayne</td><td>371101128</td><td>2 oz Nalgene kavanozunda</td></tr><tr><td>10 mL tek kullanımlık pipetler</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steril konik tüp</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>150 cm2 (T-150) kültür şişesi</td><td>Corning</td><td>430825</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Vidalı Kapaklı Mikro Tüp Konik</td><td>Sarstedt</td><td>72.608</td><td></td></tr><tr><td>2 oz Nalgene kavanoz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2118-0002</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>%2,5 Tripsin çözeltisi 10x</td><td>Yaşam Teknolojileri Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>225 cm2 (T-225) kültür şişesi</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>32 oz Nalgene Kare Saklama Şişeleri: PETG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>35 mm steril kültür kabı</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tek kullanımlık pipetler</td><td>BD Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steril konik tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>60 mm steril kültür çanak</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm çaplı Spectra Mesh filtre, 74 & m gözenek boyutu</td><td>Spektrum Laboratuvarları</td><td>145956</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler (penisilin-streptomisin)</td><td>Yaşam Teknolojileri Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sığır buzağı serumu (BCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>BD Biosciences</td><td>354331</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Ram34 FITC konjuge antikor</td><td>BD Pharmingen</td><td>553733</td><td></td></tr><tr><td>CD49f (alfa6-integrin, GOH3) PE konjuge antikor</td><td>BD Pharmingen</td><td>555736</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci, 70 & m steril</td><td>BD Discovery Labware</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen, Sığır, Tip I, 30 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 1 veya 2 mL kriyoviyaller için ekonomik hücre dondurma kabı</td><td>Biocison</td><td>BCS-136PK</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL Polipropilen Kriyojenik Şişe, Yuvarlak Tabanlı</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma ile Kendi Kendine Ayakta</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış Milli-Q su</td><td></td><td></td><td>taze yapılmış; iki kez damıtılmış ters ozmoz suyu</td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu salin 1x, Ca2 + ve Mg2 + içermez</td><td>Yaşam Teknolojileri Gibco</td><td>14190-144</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td><td>SH 300070.03</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 4 oz. Steril Numune Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-320-730</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin 50 mg/mL 10</td><td>Yaşam Teknolojileri Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>KGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3103</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene "Mr. Frosty" hücreli dondurucu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene PC Düz Kenarlı Geniş Ağızlı Kavanozlar, 16 oz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2116-0500</td><td></td></tr><tr><td>No. 22 steril paslanmaz çelik bıçaklar</td><td>BD Bard-Parker</td><td>371222</td><td></td></tr><tr><td>No. 4 neşter sapları</td><td>Biyomedikal Araştırma Aletleri</td><td>26-1200</td><td>% 70 etanol içeren bir kapta</td></tr><tr><td>Bir çift tam kıvrımlı göz pansuman forseps</td><td>Militex</td><td>18-784</td><td>% 70 etanol içeren bir</td></tr><tr><td>kapta Bir makas</td><td>Biyomedikal Araştırma Aletleri</td><td>25-1050</td><td>% 70 etanol içeren bir fincanda</td></tr><tr><td>Bir çift başparmak pansuman forseps</td><td>Militex</td><td>6-4</td><td>% 70 etanol içeren bir kapta</td></tr><tr><td>Oster Pro-Cord/Akülü Düzeltici no.40 bıçak</td><td>Jarden Tüketici Çözümleri/Oster</td><td>78997-010</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Petri kabı 100 mm x 20 mm steril</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Marka Düz Sapsız Cam Huni</td><td>Corning</td><td>6240-75</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2akappa FITC izotip kontrol antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2akappa PE izotip kontrol antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>555844</td><td></td></tr><tr><td>SFM</td><td>Yaşam Teknolojileri Gibco</td><td>10725-018</td><td></td></tr><tr><td>KOBİ</td><td>Yaşam Teknolojileri Gibco</td><td>11380-037</td><td></td></tr><tr><td>KOBİ: Ca2 + ve Mg2 + süspansiyon kültürü için ücretsiz minimal esansiyel ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri Gibco</td><td>11380-037</td><td></td></tr><tr><td>Kare steril plastik Petri kapları</td><td>BD Falcon</td><td>351112</td><td></td></tr><tr><td>İsviçre faresi 3T3 fibroblastlar</td><td>ATCC</td><td>CCL-92</td><td>10 pasajda kullanılır</td></tr><tr><td>Triadin; % 10 Povidon-İyot Hazırlama Topikal Çözelti, 16 oz</td><td>Triad Grubu</td><td>10-8216</td><td></td></tr><tr><td>VWR Plastik Petri kapları, steril Space Saver 100 x 10</td><td>VWR</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>Williams E Orta Yaşam</td><td>Teknolojileri Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Kilitli torba</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare epidermal keratinositlerin İzolasyon ve in vitro klojenik kültür

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Burada açıklanan protokol, fare başına yaklaşık 30 x 106 canlı hücre sağlayan yetişkin dişi farelerden (54 ± 2 günlük) birincil keratinositlerin hasat ının güvenilir bir yöntemidir. Birincil yetişkin fare keratinositler dişi farelerin dorsal deriden hasat edilir. Erkek fareler (~6 haftalık) deneyin gereksinimlerine bağlı olarak keratinosit hasadı için kullanılabilir. Ötenazili fareler povione iyot ve etanol çözeltilerinde seri yıkAmalarla (%70 alkol) tıraş edilir ve sterilize edilir. Fareler dezenfekte edildikten sonra, sırt derisi çıkarılır ve deri altı yağ ve kas bir neşter ile kaldırılır ve atılır. Derileri küçük parçalar halinde kesilir ve epidermis alt dermis ayırmak için hafif, düşük sıcaklık trypsinization ile tedavi edilir. Kazınmış epidermises düşük hızda karıştırılır, tüyleri çıkarmak için filtre, sayılır, ve kültür ortamda yeniden askıya alınır. Bu yöntem birçok downstream uygulamaları için son derece culturable hücrelerin mükemmel bir tek hücreli süspansiyon sağlar.

Tipik olarak, 20 x 106 ila 30 x 106 Trypan mavisi hariç olmak üzere fare başına epidermal keratinosit verimleri8,9<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig3large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Bu protokolün amacı, moleküler biyoloji, biyokimya, floresan aktif hücre ayrıştırma ve primer in vitro kullanımlar (örneğin, klojenojenik) gibi çeşitli downstream uygulamaları için yetişkin farelerin dorsal deriden epidermal keratinositleri izole etmektir. keratinositler).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Yetişkin farelerden epidermal hücreleri toplama yöntemimiz keratinosit kök hücreleri gibi downstream uygulamalar için yararlıdır. Tekniğimiz son derece tekrarlanabilir ve deri karsinogenez modeli bağlamında farelerde in vivo prosedürleri ile birlikte kullanılabilir. Ötenazi yetişkin farelerden dorsal deri örnekleri hasat sonra, ince bir Petri çanak içine bir anda kıllı tarafında bir dorsal deri yerleştirmek için otoklavlı forceps ve bir neşter kullanın ve doku yarı yarı saydam olana kadar ventral deri dokusundan yağ da dahil olmak üzere deri altı doku hurda.Diğer tüm kalan deriler işlenene kadar kazınmış deriPBS yerleştirin. Daha sonra deri örneklerini 0,5'e bir ila 1,5 santimetre şeritler halinde dilimlemek için neşter kullanın. 20 mililitrelik PBS artı iki x gentamicin çözeltisinin yüzeyinde tüylü tarafı yüzdürmeden önce şeritleri tüylü bir petri kabına yerleştirin, plastik 100'de %0.25 tripsin ile takviye edin 100 x 20 milimetre petri kabında 32 santigrat derecede iki saat boyunca.Kuluçka sonunda, 30 derece eğimli hasat ortamı 15 mililitre içeren steril, plastik, kare Petri çanak yerleştirin ve dikkatle çanak içine yüzen bir deri şerit aktarmak için kavisli forceps kullanın. Cilde dik bir açıyla yeni bir neşter bıçak tutarak ve yeterli ama aşırı güç kullanarak, epidermis ve orta içine örnek gelen kıllar hurda. Tüm şeritler kazındığında, dikkatle steril bir 60 mililitrelik kavanoz içeren bir 1.5 inç manyetik karıştırma çubuğu içeren içine supernatant içeren epidermal hücre decant ve kalan epidermal hücreleri toplamak için ek hasat orta ile Petri çanak durulayın.Kavanozdaki son hacmi taze orta ile 30 mililitreye getirin ve epidermal hücre çözeltisini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca dakikada 100 dönüşle karıştırın. Bir biyogüvenlik kabininde karıştırma kuluçka sonunda karıştırma çubuğu kaldırmak ve 50 mililitrekonik tüp içine 70 mikrometre süzgeç ile hücre çözeltisi filtre. Piştiler ve daha sonra tuzağa kalmış saç hücrelerini tüp içine serbest bırakmak için hasat orta doku işlemek için süzgeç aracılığıyla saç ve stratum korneum malzemeleri basın için bir pipet kullanın.Epidermal hücrelerin ve kılların, kıl foliküllerinden hücreleri serbest bırakmak için manipüle edilmesi çok önemlidir. Tüpteki toplam hacmi taze orta ile 50 mililitreye kadar getirin ve hücre filtrasyonunu santrifüj le toplayın. 5 mililitrelik pipet le yaklaşık 20 triturasyonda 5 mililitre taze hasat ortamıiçinde peleti yeniden askıya alın.Bir ila 20 seyreltme 0,5 mililitre alın ve 2 mililitrelik mikrofuge tüp aktarın. Numuneyi dikkatlice karıştırdıktan sonra, mikrofuge tüpünden 200 mikrolitre alın ve %0,4 trypan mavi çözeltisi ile hafifçe karıştırın. Yavaşça bu çözeltiyi üç kez karıştırın ve çekirdekli keratinositleri saymak için hücreleri bir hemositometreye aktarın.Tüm koyu mavi hücreleri cansız hücreler olarak puanve canlı hücreler olarak küçük altın ve pembemsi hücreler puan. Canlılık ortalamaları yaklaşık% 80 ve fare başına son keratinosit verimi yaklaşık 30 milyon canlı hücreleri olmalıdır. Sayma sonra, başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve kitle kültürü için hücre kültürü orta 2 mililitre 35 milimetre Petri çanak başına altıncı uygun keratinositler için 2 ila dört kez 10 resuspend.Bir klojen koloni oluşumu tahdin için, bir kez hücreleri yeniden 10 üçüncü keratinositler dört mililitre de kollajen kaplı başına serum konsantrasyonu takviyeleri ile üçüncü keratinositler için x-Ray ışınlanmış İsviçre fare sildi 60 milimetre Petri çanak ışınlanmış İsviçre fare 3T3 besleyici katmanları. Kitle kültürü için, uygun hücre kültürü dönemi için% 5 karbondioksit 32 santigrat derece kültürleri büyümek. Kitle kültürü için ilk tohumlama dan sonra 24 saat ve daha sonra haftada üç kez orta değiştirme.Klonal kültürün sonunda orta aspire ve oda sıcaklığında gece boyunca% 10 tamponlu formalin kolonileri düzeltmek. Ertesi sabah, otoklavlı suda %0.5 rhodamine B ile kolonileri lekeleyin, su temizleyene kadar bulaşıkları soğuk otoklavlı suda durulayın. Daha sonra kolonileri saymadan önce bulaşıkları kurutun.Burada çeşitli topikal tedaviler sonrası keratinosit kolonisi oluşumu tahlillerinden tipik sonuçlar gösterilmiştir. Saç folikülü kök hücreleri genellikle fare saç folikülü kök hücre belirteçleri için akış sitometrik boyama tarafından değerlendirildiği gibi yetişkin C57BL/6 fare dorsal deriden izole hücrelerin yaklaşık% 9'u oluşturur. Bu şekilde dört farklı orta koşullarda kültürden sonra keratinosit kök hücre kolonilerinin büyüme özellikleri gözlemlenebilir.Bu prosedürü takiben, hücreler akış sitometrisi, floresan aktive hücre sıralama, hücre kültürü ve moleküler biyolojik analizler için kullanılabilir. Bu teknik, epidermal kök hücre sayısının yeni bir kök hücre düzenleyici geninin tanımlanmasına yol açan nicel ve karmaşık bir özellik olduğunu belirlememizi sağlamıştır.

isolation-mouse-epidermal-keratinocytes-their-vitro-clonogenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Kazanç ya da kayıp fonksiyon-arabuluculuk lentivirüs kullanarak bir saç kökü yenilenme modeli Doku özgü analizi.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Bu videoda, insan derisinin epidermal tabakasının en belirgin hücreleri olan keratinositlerin, enzimatik sindirim ve mekanik bozma yöntemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak izolasyonu anlatılmaktadır. Bu yöntem, seçici bir büyüme ortamı kullanarak keratinositlerin diğer cilt hücresi tiplerine göre tercihli büyümesine yardımcı olur.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Bu videoda, tek tek hücrelerin çoğalma ve koloniler oluşturma yeteneğini belirlemek için yetişkin farelerden toplanan keratinositlerin klonojenik bir tahlilini gerçekleştiriyoruz. Bu keratinosit toplama tekniği, kutanöz kimyasal karsinogenez ve tümör tanıtımının diğer alt yönlerini incelemek için yararlıdır.

Keratinosit Koloni Oluşum Deneyi: Keratinositlerin Kolonilere Dönüşme Yeteneğini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Öğrenin, fare epidermal keratinosit izolasyonu ve in vitro klojenik kültür yöntemini. C57BL/6 sıçanlarından yaklaşık 30 milyon canlı hücre elde edilir. Bu teknik, epidermal kök hücre araştırmaları ve cilt karsinojenezi modelleri için yüksek verimlilik sağlar.

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

Daha fazla video keşfet