Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

Yetişkin farelerden epidermal hücreleri toplama yöntemimiz keratinosit kök hücreleri gibi downstream uygulamalar için yararlıdır. Tekniğimiz son derece tekrarlanabilir ve deri karsinogenez modeli bağlamında farelerde in vivo prosedürleri ile birlikte kullanılabilir. Ötenazi yetişkin farelerden dorsal deri örnekleri hasat sonra, ince bir Petri çanak içine bir anda kıllı tarafında bir dorsal deri yerleştirmek için otoklavlı forceps ve bir neşter kullanın ve doku yarı yarı saydam olana kadar ventral deri dokusundan yağ da dahil olmak üzere deri altı doku hurda.

Diğer tüm kalan deriler işlenene kadar kazınmış deriPBS yerleştirin. Daha sonra deri örneklerini 0,5'e bir ila 1,5 santimetre şeritler halinde dilimlemek için neşter kullanın. 20 mililitrelik PBS artı iki x gentamicin çözeltisinin yüzeyinde tüylü tarafı yüzdürmeden önce şeritleri tüylü bir petri kabına yerleştirin, plastik 100'de %0.25 tripsin ile takviye edin 100 x 20 milimetre petri kabında 32 santigrat derecede iki saat boyunca.

Kuluçka sonunda, 30 derece eğimli hasat ortamı 15 mililitre içeren steril, plastik, kare Petri çanak yerleştirin ve dikkatle çanak içine yüzen bir deri şerit aktarmak için kavisli forceps kullanın. Cilde dik bir açıyla yeni bir neşter bıçak tutarak ve yeterli ama aşırı güç kullanarak, epidermis ve orta içine örnek gelen kıllar hurda. Tüm şeritler kazındığında, dikkatle steril bir 60 mililitrelik kavanoz içeren bir 1.5 inç manyetik karıştırma çubuğu içeren içine supernatant içeren epidermal hücre decant ve kalan epidermal hücreleri toplamak için ek hasat orta ile Petri çanak durulayın.

Kavanozdaki son hacmi taze orta ile 30 mililitreye getirin ve epidermal hücre çözeltisini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca dakikada 100 dönüşle karıştırın. Bir biyogüvenlik kabininde karıştırma kuluçka sonunda karıştırma çubuğu kaldırmak ve 50 mililitrekonik tüp içine 70 mikrometre süzgeç ile hücre çözeltisi filtre. Piştiler ve daha sonra tuzağa kalmış saç hücrelerini tüp içine serbest bırakmak için hasat orta doku işlemek için süzgeç aracılığıyla saç ve stratum korneum malzemeleri basın için bir pipet kullanın.

Epidermal hücrelerin ve kılların, kıl foliküllerinden hücreleri serbest bırakmak için manipüle edilmesi çok önemlidir. Tüpteki toplam hacmi taze orta ile 50 mililitreye kadar getirin ve hücre filtrasyonunu santrifüj le toplayın. 5 mililitrelik pipet le yaklaşık 20 triturasyonda 5 mililitre taze hasat ortamıiçinde peleti yeniden askıya alın.

Bir ila 20 seyreltme 0,5 mililitre alın ve 2 mililitrelik mikrofuge tüp aktarın. Numuneyi dikkatlice karıştırdıktan sonra, mikrofuge tüpünden 200 mikrolitre alın ve %0,4 trypan mavi çözeltisi ile hafifçe karıştırın. Yavaşça bu çözeltiyi üç kez karıştırın ve çekirdekli keratinositleri saymak için hücreleri bir hemositometreye aktarın.

Tüm koyu mavi hücreleri cansız hücreler olarak puanve canlı hücreler olarak küçük altın ve pembemsi hücreler puan. Canlılık ortalamaları yaklaşık% 80 ve fare başına son keratinosit verimi yaklaşık 30 milyon canlı hücreleri olmalıdır. Sayma sonra, başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve kitle kültürü için hücre kültürü orta 2 mililitre 35 milimetre Petri çanak başına altıncı uygun keratinositler için 2 ila dört kez 10 resuspend.

Bir klojen koloni oluşumu tahdin için, bir kez hücreleri yeniden 10 üçüncü keratinositler dört mililitre de kollajen kaplı başına serum konsantrasyonu takviyeleri ile üçüncü keratinositler için x-Ray ışınlanmış İsviçre fare sildi 60 milimetre Petri çanak ışınlanmış İsviçre fare 3T3 besleyici katmanları. Kitle kültürü için, uygun hücre kültürü dönemi için% 5 karbondioksit 32 santigrat derece kültürleri büyümek. Kitle kültürü için ilk tohumlama dan sonra 24 saat ve daha sonra haftada üç kez orta değiştirme.

Klonal kültürün sonunda orta aspire ve oda sıcaklığında gece boyunca% 10 tamponlu formalin kolonileri düzeltmek. Ertesi sabah, otoklavlı suda %0.5 rhodamine B ile kolonileri lekeleyin, su temizleyene kadar bulaşıkları soğuk otoklavlı suda durulayın. Daha sonra kolonileri saymadan önce bulaşıkları kurutun.

Burada çeşitli topikal tedaviler sonrası keratinosit kolonisi oluşumu tahlillerinden tipik sonuçlar gösterilmiştir. Saç folikülü kök hücreleri genellikle fare saç folikülü kök hücre belirteçleri için akış sitometrik boyama tarafından değerlendirildiği gibi yetişkin C57BL/6 fare dorsal deriden izole hücrelerin yaklaşık% 9'u oluşturur. Bu şekilde dört farklı orta koşullarda kültürden sonra keratinosit kök hücre kolonilerinin büyüme özellikleri gözlemlenebilir.

Bu prosedürü takiben, hücreler akış sitometrisi, floresan aktive hücre sıralama, hücre kültürü ve moleküler biyolojik analizler için kullanılabilir. Bu teknik, epidermal kök hücre sayısının yeni bir kök hücre düzenleyici geninin tanımlanmasına yol açan nicel ve karmaşık bir özellik olduğunu belirlememizi sağlamıştır.