Name: Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Öğrenin, yüksek içerikli görüntüleme ile retinitis pigmentosa ile ilişkili rodopsin mutantlarının taşınmasını nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem, hücre yüzeyindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için çok dalgalı skorlama analizi kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr Mark E. Schurdak teşekkür ve Pittsburgh Üniversitesi ilaç Discovery Enstitüsü için-mek şartıyla yüksek-içerik Imager ve ilk eğitimler. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve Üniversitesi) cömertçe 1 d 4 ve B630 Anti-rhodopsin antikorlar paylaştı. Fare rhodopsin-Venus yapı cDNA içeren plazmid Dr. Nevin Lambert (Augusta Üniversitesi) tarafından paylaşıldı. Bu eser Pittsburgh Üniversitesi vizyon araştırma çekirdek grant YC ve P30EY008098 sağlık hibe EY024992 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Not: Rhodopsin taşıma tahlil.
1. hazırlık ve hücre kültürü
<ol><li>Vahşi türü (WT) veya mutant fare rhodopsin-Venus füzyon protein ifade cryo korunmuş U2OS istikrarlı hücreleri canlandırmak. Sadece küçük buz kristalleri şişede terk edene kadar 37 ° C'de hücreler çözülme. Not: U2OS hücreler vitro çalışmalar için kullanılabilir hiçbir photoreceptor hücre kültürünü ve rhodopsin önceden silier biyosentezi memeli hücrelerinde benzer moleküler mekanizmaları tarafından düzenlenir çünkü bu protokol için kullanılır. Ayrıca, U2OS hücreleri sıkıca plaka altına ekleyin ve büyük hücre cisimler, var rhodopsin taşıma tahlil için idealdir. Yedi U2OS istikrarlı hücreler, ifade WT, T4R, P23H, P53R, C110Y D190N ve P267L rhodopsin mutantlar kullanılır burada tahlil güvenilirliğini ve kalitesini göstermek için örnek olarak. İstikrarlı hücreler diğer rhodopsin mutantlar veya diğer membran proteinlerinin ifade, tahlil hedef bağlı olarak kullanılabilir. İstikrarlı hücreleri insan rhodopsin ifade bu tahlil varsa kullanılabilir. Fare rhodopsin burada fare ve insan rhodopsin proteinlerin % 95 Homoloji paylaşmak ve bu tahlil tarafından tanımlanan bileşikler test in vivo rhodopsin P23H mutasyon8taşıyan bir fare adRP modeli kullanarak olacak çünkü kullanıldı. İstikrarlı hücreleri19daha önce açıklandığı gibi üretildi. WT ve mutant rhodopsin transkript q-PCR tarafından sayısal ve benzer düzeyde WT ve mutant rhodopsin transkript ifade istikrarlı Hücre klonlar bu tahlil için seçildi. Ifade rhodopsin proteinlerin immunoblot ve immunostaining tarafından doğrulandı. Bu tahlil kullanılan hücre geçirilmesi 20 düşük olmalıdır.</li>
	<li>Hücreleri her satırının (kartal'ın orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 5 µg/mL Plasmocin yüksek glikoz Dulbecco'nın değiştirilmiş) büyüme ortamının 10 mL içeren 15 mL konik tüp aktarın.</li>
	<li>200 x g 5 dk. atmak için de tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet her hücre satırı için hücre büyüme ortamının 5 mL ile resuspend. Hücre süspansiyon her satırının bir 60 mm doku kültürü kabına aktarın ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Doku kültürü çanak olarak % 90 izdiham ulaştığında hücre başvurusu12' açıklanan alt kültür.</li>
</ol>2. iyi başına 5000 hücre hücreleri tohumlama
Not: bir doku kültürü mahallede aşağıdaki yordamları gerçekleştirin.
<ol><li>Poli-lizin plakalı tedavi.<ol>
<li>Hücreleri, tohum önce bir gün siyah duvar tedavi ve alt 384-şey plaka 20 µL/iyi 30 dk için poli-lizin çözümü ile temizleyin.</li>
		<li>Sıvı Aspire edin ve bütün kuyu 1 h. geri plaka kapak koymak kurumasını sağlar ve plaka 4 ° C'de gecede hücre tohum için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre süspansiyon hazırlamak.<ol>
<li>Her hücre satır 100 mm doku kültürü tabak içinde büyüme orta, % 90 izdiham kadar kültür.</li>
		<li>Her yemeğin fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkama ve 1 mL %0,05 hücrelerle ayırmak tripsin 37 ° C'de</li>
		<li>Her satır tahlil Orta (yüksek glikoz DMEM %10 FBS, 100 adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) 10 mL hücrelerinin resuspend.</li>
		<li>Hücreleri saymak ve her satırının başına 1,25 x 105 hücre/mL tahlil orta ile hücrelere oranında seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tohum hücreleri.<ol>
<li>Elektronik bir çok kanallı pipet veya bir otomatik reaktif dağıtıcı 40 µL/iyi hücre süspansiyon hücre satır ve dolgu sütunlar 1-21 (Şekil 2) 384-şey plaka başına üç sütun için dağıtmak için kullanın.</li>
		<li>40 µL/iyi U2OS Ekle (P23H-Rhodopsin-Venüs) sütunları 22-23 ve U2OS 40 µL/kuyu (Rhodopsin-Venüs) sütuna denetimleri olarak 24.</li>
		<li>300 x g 30 için plaka santrifüj kapasitesi 384-şey plaka altına tüm hücreleri aşağı getirmek için s. Not: hücre tohum sonra plaka fiziksel şok kaçının. Aksi takdirde, hücreleri her şey bir köşesinde ezilmiş ve plaka yüksek içerik görüntüleme için uygun olmayabilir.</li>
		<li>384-şey plaka %5 CO2 plaka altına eklemek hücrelerin 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bileşikler hücrelerle tedavi
<ol><li>Şekil 2' de gösterildiği gibi tedavi koşulları ile bir tabak harita oluşturmak.</li>
	<li>5 çalışma çözümleri bir 96-şey plaka 15 bileşiklerin x 300 µL hazırlayın.<ol>
<li>CPS 1-15 (Şekil 2A) onların son konsantrasyonları 96-iyi Wells A1 G2 için beş kez plaka için tahlil orta ile sulandırmak. 300 µL tahlil orta iyi H2 ekleyin. Not: Her bileşik son konsantrasyonu en etkili konsantrasyon P23H rhodopsin taşımacılığının kurtardığın için HTS12,13tarafından kullanılır.</li>
		<li>100 µL % 2 dimetil sülfoksit (DMSO) kuyu başına ekleyin ve 25 µM 9 -CIS-11 ve 12, sütun için tahlil orta sırasıyla seyreltilmiş retina. 9 - eklemekCIS-Retina loş ışıkta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücrelerle (Şekil 2B) kültürlü 384-şey plaka çözümleri çalışma x 5 kuyu başına 10 µL ekleme.<ol>
<li>Elektronik bir çok kanallı pipet bileşikleri 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ve 15 satır A, C, E, G, ı, K, M ve O için 1-21 (Şekil 2) sütunları eklemek için kullanın. Bileşikler Ekle 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ve 1-21 sütunlarından satırlara B, D, F, H, J, L, N ve P M.</li>
		<li>10 µL % 2 DMSO kuyu başına 22 ve 24 sütunları ekleyin. 25 µM 9 - kuyu başına 10 µL eklemekCIS-Retina sütuna 23. Not: tüm bileşikleri başlangıçta stokları DMSO içinde çözülür çünkü DMSO araç denetimi olarak kullanılır. Sütun tedavi DMSO hücreleri içeren 22 P23H ifade rhodopsin % 0 denetimi olarak kullanılır. 9 -CIS-P23H rhodopsin ifade Retina tedavi hücreleri % 100 kontrol kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak ve plaka 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>4. membran Permeabilization Rhodopsin Protein hücre yüzeyinde leke olmadan Immunostaining.
Not: hücre zarının sağlam tutmak için tüm immunostaining sürecinde herhangi bir deterjan kaçının.
<ol><li>%4 paraformaldehyde (PFA) % 16 sulandrarak hazırlamak PFA PBS 1:4 birim oranında bir kimyasal duman Hood ile. %4 aktarım PFA reaktif Reservoir.</li>
	<li>Loş kırmızı ışık ile karanlık bir odada 384-şey plaka çıkarmak. Yavaşça orta Aspire için bir vakum koleksiyonu biberondan bağlı bir 8-kanal aspiratör kullanın. Taze hazırlanmış %4 kuyu başına 20 µL eklemek için elektronik bir çok kanallı pipet kullanın PFA tüm 384-şey plaka ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Hücre dekolmanı önlemek için her zaman aspiratör uçları her şey aynı tarafına özlemleri sırasında işaret. Her şey orta alt alan dokunmayın. Fotoğraf çekerken, aspiratör tarafından dokundu bölge önlemek için alanı seçin. 10 dakika uzun incubations için buharlaşma önlemek için kapağı ile 384-şey plaka kapak. Not: Hücreleri % 100 kontrol sonucu etkileyecek rejenere isorhodopsin photobleaching önlemek için karanlık bir odada sabitlenir. Fiksasyon sonra 384-şey plaka normal ışık altında çekilen.</li>
	<li>Bir 8-kanal aspiratör her iyi PFA Aspire edin elektronik bir çok kanallı pipet PBS kuyu başına 50 μL eklemek için kullanırsınız. PBS ile üç yıkama gerçekleştirmek için iki kez daha tekrarlayın. Dikkat: Atık sıvı içeren PFA kaplama bir şişede toplanan ve deneyden sonra tehlikeli bir kimyasal atık olarak bertaraf edilecek.</li>
	<li>Hücreleri tüm 384-şey plakasına %5 keçi serum kuyu başına 20 µL ekleyerek engellemek ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>%5 keçi serum Aspire edin ve 20 µg mL-1 B6-30 Anti-rhodopsin antikor kuyu başına 15 µL % 1 keçi serum içinde satır A O. eklemek 15 µL iyi ücret için % 1 keçi serum ikinci salt antikor kontrol grubu için satır P için ekleyin.</li>
	<li>384-şey plaka 90 dakika oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya. Fluorophores photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak.</li>
	<li>3 kez ile 50 µL plaka PBS kuyu yıkayın.</li>
	<li>PBS Aspire edin ve 5 µg mL-1 Cy3-Birleşik keçi Anti-fare IgG antikor kuyu başına 15 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak ve 1 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez ile 50 µL plaka PBS kuyu yıkayın. 1 µg mL-1 çekirdek 15 dakika oda sıcaklığında leke Höchst 33342 içeren PBS kuyu başına 50 µL ekleyin.</li>
	<li>Görüntüleme önce şeffaf bir film ile 384-şey plaka mühür. Alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak ve görüntüleri hemen alınır 4 ° C'de için bir hafta kadar saklayabilirsiniz.</li>
</ol>5. görüntüleme.
Not: Bu yüksek-içerik görüntüleme yordam Malzeme tablodalistelenen görüntüleme sistemi adapte olacaktır. Yordamlar diğer yüksek-içerik görüntüleme sistemleri kullanıyorsanız farklı olabilir.
<ol><li>Kapağı çıkarın ve 384-şey plaka plaka sol üst köşesine yerleştirilmiş A1 ile yüksek içerikli Imager koydu.</li>
	<li>Resim alma parametrelerini ayarlamak için görüntü alma yazılımını açın.<ol>
<li>Plaka satın alma Kurulumu penceresini açın ve yeni ayarı oluşturmanız veya varolan bir kurulum dosyasını yüklemek.</li>
		<li>20 x hedefi seçin ve kalibre edilmiş piksel boyutu 0,80 x 0,80 bu yüzden 2 olarak piksel binning ayarla µm. tarama çizgileri 2.000 ve görüntü boyutu ayarla (G x Y) site başına 1000 x 1000 piksel (800,00 800.00 µm x) olarak.</li>
		<li>Yansıması için plaka türü seçin. Plaka boyutları doldurmak için 384-şey plaka üreticisi tarafından sağlanan bilgileri kullanın.</li>
		<li>Kuyu 384-şey plaka yansıması seçin.</li>
		<li>İyi yansıması için dört site seçin. Aspirasyon ipuçları ile de dokundu tarafında kaçının.</li>
		<li>405 uyarma lazerler seçin 488 ve 561 nm. Emisyon filtreler, DAPI, FITC ve Texas kırmızı kanalları için seçin. Lazer gücü optimize etmek ve kazanç görüntüleri olumlu denetim kuyulardan alınan parlaklığını emin olmak için her kanalının doygunluk eşik değerinden daha az olan.</li>
		<li>Otofokus iyi Peki odağının seçin. İyi örnekler bulmak için ilk olarak edinilen ilk şey seçin. Site Otofokus tüm sitelere ayarlayın.</li>
		<li>Her kanal için her satırda dört ortalamalar seçin. Her kanal için Z-kaydırma değeri en iyi duruma getirme.</li>
		<li>Test 2-3 kuyu çapraz köşe 384 iyi plaka görüntüleri emin olmak için tüm test wells, iyi başına tüm sitelerden görüntüler fazla % 40 izdiham ve floresan yoğunluklarda tüm kanalları içeren hücreler için odak yaklaşık yarısı % 100 doygun Kuyu kontrol.</li>
		<li>Görüntü alma yöntemi kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm plaka çalıştırın. Esir alma imge görüntü kalitesi Imager ayrılmadan önce iki kez kontrol plaka ilk sütundan bitene kadar Imager dikkat et. 384-şey plaka çıkar ve ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolayın. Not: iyi ve alınan kanal seçilen siteler sayısına bağlı olarak, bu bir 384-şey plaka Imaging bitirmek için 3 h için 40 dakika sürer.</li>
</ol>6. görüntü analizi.
<ol><li>Bir yüksek-içerik görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntü verilerini çekin. Parametreleri ayarlamak için % 100 kontrol wells (sütun 23) birini seçin.</li>
	<li>Çoklu dalga boyu hücre Puanlama analiz yöntemi olarak ve başlangıç ayarlarını yapılandırma.<ol>
<li>DAPI kanalındaki görüntüleri kullanarak çekirdekler tanımlayın. Seçili tanımlanmış çekirdek şekillerde de çekirdek görüntülerle uydu emin olmak için Önizleme.</li>
		<li>Hücre şeklinde nerede rhodopsin-Venus görüntüsü FITC kanal tanımlayın.</li>
		<li>Texas kırmızı kanal rhodopsin hücre yüzey leke alanlarını tanımlayın.</li>
		<li>Geçerli algoritması 5 kuyu ayarlarını optimize edilmiş belirlemek için sınayın. Ayarları kaydetmek ve yapılandırma penceresini kapatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bütün wells ile en iyi duruma getirilmiş analiz yöntemini çalıştırın.</li>
	<li>Nesne numarası bozulmamış hücre sayı olarak dışa aktarın. Ortalama Yoğunluk FITC kanal Rhodopsin-Venus yoğunluğu (Rhodopsin-Venus INT) dışa aktarın. Texas kırmızı kanal Ortalama yoğunluğu rhodopsin yoğunluğu hücre yüzeyinde (hücre yüzeyinde Rhodopsin INT) olarak dışa aktarın.</li>
	<li>Dışa aktarılan verileri bir elektronik tablo yazılımı açın. Hücre yüzeyinde rhodopsin yoğunluğu rhodopsin-Venüs INT tarafından MEM toplam oranı olarak bölün. Z hesaplamak '-faktörler tahlil kalitesini değerlendirmek üzere her parametre için. Z′ 1−3X = (STD+% 100 kontrolSTD% 0 kontrol) / | % 100 kontrol−Mean% 0 kontroldemek |. Not: Bir Z'-faktörü 0 orta tahlil yüksek içeriği ekran ve bir Z için yeterli gösterir daha yüksek ' faktörü 0,5 ile 1 arasında üstün bir tahlil için bir yüksek üretilen iş ekran20,21gerekli öneriyor.</li>
	<li>Her parametre için bir iki renkli ısı haritası oluşturmak için elektronik tablo yazılımı kullanın. Hücre hatları x ekseni ve y ekseni üzerinde bileşikler adını düzenleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Stenson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Gene+Mutation+Database%3A+towards+a+comprehensive+repository+of+inherited+mutation+data+for+medical+research%2C+genetic+diagnosis+and+next-generation+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies.</a> Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).</li>
<li>Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mutant+rhodopsins+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).</li>
<li>Athanasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+reveals+potential+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).</li>
<li>Chiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Endoplasmic+Reticulum-Associated+Degradation+of+Rhodopsin+Precedes+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration.</a> Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).</li>
<li>Sakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+of+photoreceptor+degeneration+in+a+new+mouse+model+of+the+common+form+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+due+to+P23H+opsin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).</li>
<li>Dryja, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+rhodopsin+gene+in+patients+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).</li>
<li>Sohocki, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+mutations+causing+retinitis+pigmentosa+and+other+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies.</a> Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+chaperone+of+rod+opsin+and+its+potential+therapy+for+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration.</a> Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assays+to+identify+small+molecules+preventing+photoreceptor+degeneration+caused+by+the+rhodopsin+P23H+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation.</a> Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Drug+Screening+Strategy+for+Detecting+Rhodopsin+P23H+Mutant+Rescue+and+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).</li>
<li>Noorwez, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone-mediated+in+vivo+folding+and+stabilization+of+the+P23H-opsin+mutant+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).</li>
<li>Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+fate+of+mutant+rhodopsin%3A+quality+control%2C+degradation+and+aggresome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation.</a> Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).</li>
<li>Kaushal, S., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin.+7.+Point+mutations+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).</li>
<li>Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+NIH3T3+cell+lines+expressing+opsin+and+the+P23H+opsin+mutant+identifies+candidate+drugs+for+the+treatment+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa.</a> Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).</li>
<li>Adamus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-rhodopsin+monoclonal+antibodies+of+defined+specificity%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application.</a> Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+mutations+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.+Clustering+of+functional+classes+along+the+polypeptide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).</li>
<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, bir HTS. tespit sayısı karakterize için kullanılan bir yüksek-içerik görüntüleme tahlil ortaya Bu iletişim kuralları dahil tek Otomasyon yüksek içerikli Imager var. İmmunostaining ve floresan görüntüleme rhodopsin rhodopsin5,14,15,16lokalizasyonu karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel görüntüleme yöntemleri tarafından çekilen görüntüleri miktar koşul, d...

Protein misfolding retinitis pigmentosa (RP)1de dahil olmak üzere, kör edici hastalıklar gibi kas distrofisi, sinirsel dejenerasyonlar içinde yer almaktadır. RP devralınan ve ilerici Retina dejenerasyonu işlev ve çubuk photoreceptors veya Retina pigmentli hücreleri (RPEs)2,3homeostazı etkileyen 60 genlerdeki mutasyonlar ile ilişkili olduğunu. Etkili bir tedavi RP için şu anda mevcuttur. Rhodopsin mutasyonlar otozomal dominant (reklam) yaklaşık % 25-30 RP durumlarda hesaba. 150'den fazla rhodopsin mutasyonlar4 arasında (insan gen mutasyon veritabanı, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), sınıf II mutasyonlar çubuk photoreceptor ölümüne katkıda rhodopsin protein yapısal kararsızlığına neden ve Vizyon kaybı5,6,7,8. P23H da sınıf II rhodopsin mutasyonlar9,10tipik bir örneği ile Kuzey Amerika'da en sık rhodopsin mutasyon var. Vahşi türü rhodopsin plazma zarı5üzerinde yer alır, ancak onun doğasında yapısal istikrarsızlık nedeniyle memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum (ER) içinde misfolded rhodopsin birikmiş. Misfolded rhodopsin haploinsufficiency nedeniyle değil, ama ER harekete geçirmek için ilgili P23H mutant sergiler baskın olumsuz sitotoksisite protein yıkımı yolu ve kesilen çubuk dış segment organizasyon ilişkili. Çubuk photoreceptor hücre stresi hafifletmek için bir strateji yerel farmakolojik bir koruyucuya kullanarak mutant rhodopsin katlama stabilize etmektir.
Bu hedefe ulaşmak için biz gerçekleştirilen plazma üzerinde taşınan P23H rhodopsin mutant ölçmek için bir β-galaktozidaz parçası uluslara tahlil kullanarak bir hücre tabanlı yüksek üretilen iş ekran (HTSs)11,12,13 membran. Güçlü ve basit iletişim kuralı bu HTS testin bize her ekran için yaklaşık 79.000 küçük moleküller faaliyetlerinin keşfetmek etkin. Çünkü bu HTS tahlil ışıldama sinyalleri okur, ancak, yanlış pozitif β-gal inhibitörleri dahil olmak üzere renkli ya da sitotoksik bileşikler tarafından ikincil bir tahlil tespit edilmesi için bekleyen bulunanlar listesinde dahil.
Geleneksel immunostaining ve floresan görüntüleme yöntemleri yıllardır memeli hücreleri5,14,15,16rhodopsin taşımada eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel yöntemlerin güvenilir bir görüntüleme analizi çok sayıda olduğunu son derece tutarlı bir koşul altında çekilen görüntüler gerektirdiğinden rhodopsin taşıma doğru 10'dan fazla bileşiklerin farmakolojik etkileri ölçmek için kullanılamaz konvansiyonel görüntüleme yöntemleri tarafından değil iyileştirilebilir. Burada, bir immunostaining göre yüksek içerik görüntüleme Protokolü hücre yüzey taşıma misfolded rhodopsin mutantlar11,13,17ölçmek için ikincil bir tahlil olarak geliştirdi. Plazma zarı üzerinde rhodopsin etiketlemek için hücre zarının permeabilization ve immunostained adımında rhodopsin mutantlar rhodopsin hücre hücre dışı kenarındaki N-terminal epitope tanıma monoklonal (B6-30) Anti-rhodopsin tarafından atladık membran18. Tüm cep telefonu mutant rhodopsin görselleştirmek için rhodopsin Venüs floresans protein ile erimiş. Tarafından miktar farklı floresan kanalları floresans yoğunluklarını, biz bir tek deneme her hücresinde, hücre yüzeyine ve oranı toplam rhodopsin yoğunluğu da dahil olmak üzere birden çok parametre elde edebiliyoruz Tüm cep telefonu için bu hücre yüzeyinde rhodopsin floresan. Toplam altı misfolded rhodopsin mutantlar ifade hücreleri kararlı için bu yöntemi uygulayarak, biz bu mutant doğru birden çok küçük molekül chaperones farmakolojik bir profil oluşturabilirsiniz. Bu iletişim kuralı, tüm hücreleri immunostained 384-şey plaka vardır ve son derece tutarlı bir görüntüleme koşulu altında otomatik görüntüleme sistemi kullanarak yansıma. Bir görüntü analizi görüntüleri heterojenite nedeniyle değişim hücre şekil ve protein ifade düzey değişen hücre azaltmak için 600'den fazla hücre içeren her şey yapılır. İş akışını bu iletişim kuralı, Şekil 1' de özetlenmiştir. Bu yöntemin avantajı biz yansıma tabanlı analiz çok parametreli quantifications yanı sıra yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde var. Genel olarak, bu iletişim kuralı değiştirilmiş ve herhangi bir misfolded membran protein ilgi taşımacılığının ölçmek için uygulanır.

<table><tbody><tr><td>U2OS (rodopsin-Venüs) hücreleri</td><td>NA</td><td></td><td>U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler</td></tr><tr><td>U2OS (T4R-rodopsin-Venüs) hücreleri</td><td>NA</td><td></td><td>NA U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler</td></tr><tr><td>U2OS (P23H-rodopsin-Venüs) hücreleri</td><td>NA</td><td></td><td>NA U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler</td></tr><tr><td>U2OS (P53R-rodopsin-Venüs) hücreleri</td><td>NA</td><td></td><td>U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler NA U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler NA U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler</td></tr><tr><td>U2OS (C110Y-rodopsin-Venüs) hücreleri</td><td>NA</td><td></td><td>NA U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler</td></tr><tr><td>U2OS (D190N-rodopsin-Venüs) hücreleri</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler</td></tr><tr><td>U2OS (P267L-rodopsin-Venüs) hücreleri</td><td>NA</td><td></td><td>NA U2OS hücrelerinden üretilen stabil hücreler</td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>L-Glutamin, sodyum ile piruvat</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Isı ile inaktive</td></tr><tr><td>edilmiş Plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>Mikoplazma eliminasyon reaktifi</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X hücre kültürlerinin bakteri kontaminasyonunu önlemek için konsantre antibiyotik solüsyonları</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>%0,25, kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'de 1mM EDTA</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol ağırlık 70.000-150.000, %0.01, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Mikroplakalar</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>Yüksek içerik analizinde hücreleri görüntülemek için siyah kuyu duvarlı ve optik olarak berrak siklik olefin tabanlı 384 oyuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş mikroplakalar</td></tr><tr><td>Steril 96 oyuklu plaka</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>Kapak düz dipli, steril, saptanabilir pirojen, Rnase, DNaz ve DNA içermeyen doku kültürü. Sitotoksik</td></tr><tr><td>Olmayan Fosfat Tamponlu Sailine (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x PBS Tamponu, pH 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99.5%, hücre kültürü test edildi</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>Bileşikleri test edildi</td><td>Selleckchem / Life Chemicals / Özel sentezlenmiş</td><td>NA</td><td>Bileşikleri satın alındı farklı satıcılar veya özel sentezlenmiş</td></tr><tr><td>B6-30 anti-rodopsin antikoru</td><td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>Dr. Krzysztof Palczewski'den hediye</td></tr><tr><td>Cy3 konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>%16 paraformaldehit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Metanol içermeyen</td></tr><tr><td>%10 Normal Keçi Serumu</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Engelleme tamponu</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Nükleer boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Yüksek içerikli görüntüleyici</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg; Mikro Konfokal Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi</td></tr><tr><td>MetaXpress yüksek içerikli görüntü elde etme ve analiz yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>MetaXpress</td><td>Yüksek içerikli görüntü elde etme ve analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet (0,5-10 & mikro; L)</td><td>Rainin</td><td>17013802</td><td>Manuel 8 kanallı pipet, 0,5-10 & L</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet (0,5-10c</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>Manuel 8 kanallı pipet, 20-200 & mikro; L</td></tr><tr><td>Elektronik çok kanallı pipet (10-200 &mu; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>96 ve 384 kuyulu mikroplaka pipetleme görevleri için elektronik multichanenel pipet</td></tr><tr><td>50ml Reaktif Rezervuarı</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>Çok kanallı pippte dağıtımı için reaktif rezervuarı</td></tr><tr><td>8 Kanallı aspiratör</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>96 veya 384 oyuklu plakalardan sıvıları aspire etmek için 8 Kanallı paslanmaz çelik adaptör</td></tr><tr><td>Excel elektronik tablo yazılımı</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>Veri analizi ve ısı haritası oluşturma için elektronik tablo yazılımı</td></tr><tr><td>Origin2018 bilimsel veri analizi ve grafik yazılımı</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>Doz yanıt eğrilerini oluşturmak için veri analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding mutasyonlar otozomal dominant retinitis pigmentosa (RP), etkili tedavi yoksun hastalığı kör bir ilerici kendini gösteren çubuk photoreceptor ölüme yol açar. Misfolded rhodopsin mutant sitotoksisite farmakolojik mutant rhodopsin protein sabitleme ile hafifletti öngörmekteyiz. Vahşi türü rhodopsin memeli plazma zarı için taşınır, ancak diğer sınıf II rhodopsin mutasyonlar arasında P23H mutasyon endoplazmik retikulum (ER), birikmiş bir yapısal olarak kararsız rhodopsin mutant protein kodlar hücreleri. Biz daha önce bir ışıldama tabanlı yüksek üretilen iş ekran (HTS) gerçekleştirilen ve ER üzerinden P23H rhodopsin plazma zarı için taşıma kurtarıldı farmakolojik chaperones bir grup tespit. Burada, bir yüksek-içerik görüntüleme analizi tarafından takip bir immunostaining yöntemini kullanarak, biz mutant rhodopsin protein miktarı tüm cep telefonu ve plazma zarı sayılabilir. Bu bilgilendirici ve yanlış pozitif HTS. takip üzerinden gerçek sayısı tanımlamak etkili bir yöntemdir Ayrıca, yüksek-içerik görüntü analizi bize birden çok parametre her bileşik farmakolojik özellikleri değerlendirmek için tek bir deneme ölçmek etkinleştirilmiş. Bu tahlil kullanılarak, biz bu rhodopsin mutantların yapısal kararlılık ilgili nicel ve nitel bir anlayış için bir 2-B farmakolojik profil alma altı ilişkili RP rhodopsin mutantlar doğru 11 farklı bileşiklerin etkisi analiz ve bu mutant doğru farklı bileşiklerin etkinliği.

Biz rhodopsin taşıma üç parametre ile karakterize: tüm cep telefonu (Rhodopsin-Venus INT), rhodopsin plazma zarı (hücre yüzeyinde Rhodopsin INT) üzerinde immunostaining yoğunluğu ve oranı rhodopsin-Venus yoğunluğu Tüm cep telefonu (MEM-toplam oranı) rhodopsin-Venus yoğunluğu için hücre yüzeyinde rhodopsin leke. Temsilcisi rhodopsin taşıma tahlil sonucunda Şekil 3 ve Şekil 4gösterilir. DMSO ve 9 - kullanarakCIS-Retina ted...

Buraya, taşıma retinitis pigmentosa ile ilişkili rhodopsin mutantların ölçmek için bir yüksek-içerik görüntüleme yöntemi nitelendirdi. Bir çoklu dalga boyu Puanlama analiz rhodopsin protein hücre yüzeyine veya tüm cep telefonu ölçmek için kullanıldı.

Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Rodopsin yanlış katlama retinitis pigmentosa denilen ilerleyici retina dejenerasyonuna neden olur. Geleneksel görüntüleme yöntemi rodopsin taşımaölçmek için sınırlı kapasiteye sahip olsa da, bu yeni geliştirilen görüntü tabanlı test yanlış pozitif ortadan kaldırarak, yüksek iş elde tarama sağlar. Bu teknik ilaç farmakodinamik hızlı bir değerlendirme sağlar.Hastalığa neden olan rodopsin katlama kurtarma gözünde, böylece sessizce tedavi edilemez ve kör edici hastalık için bir tedavi potansiyelini hızlandıran, retinitis pigmentosa. Bir membran proteininin hücresel lokalizasyonu işlevi için çok önemlidir. Bu yöntem kolayca değiştirilebilir ve ilgi başka bir membran protein taşıma ölçmek için uygulanır.Bir plaka haritası hazırladığınızdan ve hücre numarasını ve immüno durum koşullarını hücreler arasında tutarlı tutmak için plakanın her kuyusundan sıvıyı hafifçe ekleyip aspire ettiğinizden emin olun. Bu yüksek bir Z faktörü ve güvenilir sonuçlar verecektir. Başlamak için, tohum 5000 hücreleri iyi siyah duvarlı içine, net alt, poli lizin 384-iyi plaka tedavi.Plakayı 37 derecede yüzde beş CO2 ile üç saat boyunca hücrelerin plakanın dibine bağlanması için kuluçkaya yatırın. Daha sonra, burada gösterildiği gibi önceden belirlenmiş bir plaka haritasına göre, 5X çalışma çözümleri kuyubaşına 10 mikrolitre eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Şimdi, 22 ve 24 sütunlarına %2 DMSO kuyusu başına 10 mikrolitre ekleyin.Ayrıca, loş kırmızı ışık altında karanlık bir odada 23 sütun 23 25 mikromolar 9-cis-retinal kuyu başına 10 mikrolitre ekleyin. Tüm çeşitli test bileşiklerinin yüklenmesi bittiğinde, plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Loş kırmızı ışıkta olan karanlık bir odada 384 plakayı çıkar.Burada, 8 kanallı aspiratör kullanarak, bir vakum toplama şişesine bağlı, nazik plaka kuyularından orta aspire etmek. Daha sonra, tüm 384-iyi plaka için taze hazırlanmış% 4 Paraformaldehit kuyu başına 20 mikrolitre eklemek ve oda sıcaklığında 20 dakika hücreleri düzeltmek için çok kanallı pipet kullanın. Fiksasyondan sonra plakayı normal ışığa yerleştirin.Orada, her kuyuda Paraformaldehit aspire etmek için 8 kanallı aspiratör kullanın ve PBS kuyubaşına 50 mikrolitre eklemek için çok kanallı pipet kullanın. PBS'yi toplam üç yıkama döngüsü için aspire edin ve değiştirin. Daha sonra, her kuyuya %5 keçi serumu başına 20 mikrolitre ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, kuyuları aspire ve mililitre B630 anti-rodpsin antikor başına 20 mikrogram 15 mikrolitre ekleyin, 1% keçi serumu sıralı kuyulara A to O.Next, ikincil antikor sadece kontrol grubu için satır P için% 1 keçi serum kuyubaşına 15 mikrolitre ekleyin. 90 dakika veya gece boyunca dört derece santigrat oda sıcaklığında plaka kuluçka. Daha sonra, floroforların fotobeyazmasını önlemek için plakayı alüminyum folyo ile kapatın.Daha sonra, pbs kuyu başına 50 mikrolitre ile plaka üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, PBS aspire, ve Cy3-konjuge keçi anti-fare IgG antikor mililitre başına beş mikrogram iyi başına 15 mikrolitre ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra tabağı üç kez yıkayın. Daha sonra, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında Hoechst leke mililitre başına bir mikrogram içeren PBS kuyu başına 50 mikrolitre ekleyin. Son olarak, şeffaf bir film ile kuyu plakası mühür, alüminyum folyo ile kaplayın ve bir hafta kadar dört derece santigrat saklayın.Folyoyu çıkarın ve örnek plakayı plakanın sol üst köşesine A1 yerleştirerek yüksek içerikli bir görüntüleyiciye yerleştirin. Ardından, görüntü edinme parametrelerini ayarlamak için görüntü edinme yazılımını açın. Plaka edinme kurulum penceresini açın ve yeni ayar oluşturun veya varolan bir kurulum dosyasını yükleyin.20X hedefini seçin ve piksel binning'i iki olarak ayarlayın, böylece kalibre edilmiş piksel boyutu 0,80 x 0,80 mikron olacak. Ardından, tbmktör çizgilerini 2000, görüntü boyutunu site başına 1000 piksel olarak ayarlayın. Ardından, görüntülenecek plaka türünü seçin.Plaka boyutlarını doldurmak için üretici tarafından sağlanan bilgileri kullanın. Şimdi, kuyu başına görüntülenecek dört site ile birlikte görüntülenecek kuyuları seçin. Aspirasyon ipuçları tarafından dokundu kuyu, yan kaçının.Görüntüleme için uyarma lazerlerini 405, 488 ve 461 nanometre olarak seçin. Ardından, DAPI, FITC ve Texas Red kanalları için emisyon filtrelerini seçin. Her kanalın lazer gücünü ve kazanımlarını optimize edin, pozitif kontrol kuyularının doygun olmamasını sağlayın.Otomatik odaklama için iyi odaklamak için iyi seçin. Ardından, edinilecek ilk kuyuyu seçin ve sitenin tüm siteler için otomatik odaklamasını ayarlayın. Ayrıca, her kanal için satır başına dört ortalama seçin ve her kanal için Z-ofset değerini optimize edin.Doğrulayın, her şey düzgün ayarlanır, ilk plaka köşelerinde iki ila üç kuyu test ederek, görüntüleri tüm test kuyuları için odak olduğundan emin olmak için. Ardından, her sitedeki tüm görüntülerde %40'tan fazla biraraya gelen hücreler olduğunu kontrol edin. Son olarak, tüm kanallardaki floresan yoğunluklarının %100 kontrol kuyularında yaklaşık yarısı doymuş olduğunu kontrol edin.Ardından, görüntü edinme yöntemini kaydedin ve tüm plakayı çalıştırın. Görüntüleyiciden ayrılmadan önce görüntü kalitesini iki kez kontrol etmek için plakanın ilk sütunundaki görüntüleri yakalamayı bitirene kadar görüntüleyiciyi izleyin. Bittiğinde, plakayı çıkarın ve ileride kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın.Yüksek içerikli görüntü analizi yazılımı kullanarak görüntü verilerini çekin. Parametreleri ayarlamak için 23 numaralı sütundaki %100 kontrol kuyularından birini seçin. İlk olarak, çözümleme yöntemi olarak çok dalga boyu hücre puanlama seçin ve ek ayarları yapılandırmaya başlayın.DAPI kanalındaki görüntüleri kullanarak çekirdekleri tanımlayın. Seçilen kuyudaki tanımlı çekirdek şekillerinin çekirdek görüntülerine uygun olduğundan emin olmak için önizleme yapın. Ardından, Rodopsin Venüs'ün görüntülendiği FITC kanalındaki hücre şeklini tanımlayın.Bunu başarmak için, her hücrenin minimum ve maksimum çaplarını, arka plan üzerinde minimum floresan yoğunluğunu ve her hücrenin minimum alanını ayarlayın. Şimdi, Texas Red kanalındaki rodopsin hücre yüzeyi leke alanlarını, hücre şeklinin minimum ve maksimum çaplarını, arka planın üzerindeki minium floresan yoğunluğunu ve her lekeli hücrenin minimum alanını ayarlayarak tanımlayın. Ayarların en iyi duruma getirilip optimize edilemesini belirlemek için geçerli algoritmayı beş kuyuda test edin.Ardından, ayarları kaydedin ve yapılandırma penceresini kapatın. Optimize edilmiş analiz yöntemi yle tüm kuyuları çalıştırın. Tamamlandığında, nesne numarasını bozulmamış hücre numarası olarak dışa aktarın.Rodopsin Venüs yoğunluğu olarak FITC kanalının ortalama yoğunluğunu dışa aktarın ve hücre yüzeyindeRodopin yoğunluğu olarak Teksas Kırmızı Kanalı'nın ortalama yoğunluğunu dışa aktarın. Her parametre için iki renkli ısı eşlemi oluşturmak için elektronik tablo yazılımını kullanın. X ekseninde hücre çizgilerinin adını ve y eksenindeki bileşikleri düzenleyin.Burada, P23H rodopsin Venüs görüntüleri, yeşil Venüs floresan ifade U2OS hücreleri tedavi ve hücre yüzeyi immün-kırmızı boyama. Hücreler ya DMSO veya beş mikromolar 9-cis-retinal ile tedavi edildi. Rodopsin taşıma tsur, çeşitli koşullar altında tüm hücrede rodopsin miktarı karşılaştırarak, P23H mutant hücre hattında önemli bir iyileşme gösterir, 9-cis-retinal ile tedavi edildiğinde.Buna ek olarak, hücre yüzeyinde rodopsin yoğunluğu, ve hücre yüzeyinde rodopsin leke oranı tüm hücrede rodopsin Venüs yoğunluğu, P23H mutant için önemli ölçüde daha düşük değildir, DMSO ile tedavi wildtype rodopsin ile karşılaştırıldığında. Isı haritası, birden fazla mutant arasında ortalama rodopsin miktarını ve hücre başına lokalizasyonu karşılaştırmanın etkili bir yoludur. Burada, wildtype kontrolleri ve altı rodopsin mutantları yatay olarak listelenir ve bileşik tedavilerin etkileri dikey olarak karşılaştırılır.Daha önceki çalışmalara göre hücre yüzeyindeki rodopsin yoğunluğu ve hücre yüzeyindeki rodopsin lekesinin rodopsin Venüs yoğunluğuna oranı, DMSO ile tedavi edilen yabani tipe göre altı mutant için daha düşüktür. Bileşikler bir, iki, altı ve dokuz önemli ölçüde T4R, P23H, D190N ve P267L rodopsin mutantları rodopsin Venüs yoğunluğu için hücre yüzeyinde rodopsin leke oranını artırdı, bu bileşikler plazma membran bu rodopsin mutantların taşınması kurtarma düşündürmektedir. Unutmayın, bu durum görüntü analizi için kritik olduğundan, sabitlemeden önce hücrelerin %50 ile %70 arasında etkili olması gerekir.Ayrıca, tüm tabak boyunca bir kuyu görüntüleri gösterdi. Odaktaki görüntülerin ve çıkmayan floresan görüntülerin herhangi bir kanal için tüm eşik değerine sahip olduğundan emin olun. Yanlış katlanmış rodopsin naklini kurtaran seçici bileşiklere kadar, bu süreci doğrulayabilir, sonra bu bileşiklerin etkinliğini vivo olarak geçirebiliriz, rodopsin P23H mutantını ifade eden bir fare modeli kullanarak.Bu yöntem membran protein miktarını ve lokalizasyonunu ölçmemizi sağlar. Bu nedenle, mikro hata için büyük bir araçtır membran protein başına yardımcı kaydetmek ve bozulması başladı. Paraformaldehit, bu deneyde olduğu gibi, bu reaktifin işlenmesini içeren prosedürlere sahiptir.Kaputun altında yapılacak. Bu reaktifi içeren atıklar tehlikeli bir kimyasal olarak düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.

a-rhodopsin-transport-assay-by-high-content-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Biz yüksek içerik görüntüleme ile otomatik hücre kültür birleştirerek yüksek verimli bir şekilde, çoklu hücresel süreçleri ve yapıları görselleştirmek ve ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu yöntemler daha fonksiyonel ek açıklama genomların yardım yanı sıra hastalık gen ağları ve potansiyel ilaç hedefleri belirleyebilir.

Nörodejeneratif Hastalıklar Yüksek İçerik Tarama

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Ökaryotik ekspresyon için tasarlanan karboksi-terminalinde bir GFP etiketli bir konstrukt şifreleyen TMEM184A, vasküler hücrelerde heparin reseptör olarak TMEM184A varlığını teyit etmek için tasarlanan deneylerde kullanılmıştır.

Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 ', 7'-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Nöronal uyarılabilirlik endo-dinamik bir süreçtir ve ekzositozu eksitatör ionotropic glutamat reseptörlerinin modülasyonlu. Burada açıklanan yüzey ve iç reseptör nüfus havuzları miktarının için erişilebilir, yüksek içerikli bir tahlil olduğunu.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Bu rapor, görsel GPCR, rodopsin ve mini-Goile karmaşık hazırlamak için farklı deterjanların tarama açıklar. Arınma sırasında kompleksin farklı aşamalarında kalitesini karakterize eden biyokimyasal yöntemler gösterilmiştir. Bu protokol gelecekteki yapısal çalışmaları için diğer membran protein komplekslerine genelleştirilebilir.

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Burada, A vitamini membran reseptörlerinin ve fotoreseptör opsin'in ilgili fizyolojik ligandları ile protein-ligand etkileşimlerini incelemek için iki kantitatif yöntem tanımlanmıştır.

Retinylidene Proteininin Üretilmesinde A Vitamini Membran Reseptörleri ve Opsin Proteininin Ligandları ile Etkileşimlerinin İncelenmesi için Metodoloji

Öğrenin, yüksek içerikli görüntüleme ile retinitis pigmentosa ile ilişkili rodopsin mutantlarının taşınmasını nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem, hücre yüzeyindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için çok dalgalı skorlama analizi kullanır.

Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

Daha fazla video keşfet