Name: Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, fare deri ve tümör lenf damarlarında lökosit çıkış miktarını in vivo fotokonversiyon teknikleriyle nasıl ölçülür. Bu yöntem, immünoloji ve kanser biyolojisi araştırmalarında endojen bağışıklık hücrelerinin davranışlarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr. Marcus Bosenberg YUMM 1.1 ve YUMM 1.7 fare Melanom hatları ve Dr Deborah J. Fowell B6 sağlamak için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr fareler RIKEN BRC aracılığıyla Ulusal biyo-kaynak olduğunu MEXT, Japonya ile anlaşma.

Tüm hayvan iletişim kuralları kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. indüksiyon iltihaplanma ve fare Pinna FITC resim
<ol><li>Bir laminar akış başlık, buharlaşmış isofluorane kullanarak C57Bl/6 fare anestezi (% 3-5 isofluorane teşvik ve % 1-3 isofluorane at; korumak oksijen akış hızı 0.5-1.0'de L/dk). Pedal refleks kaybı izleyerek uygun anesthetization emin olmak istemsiz hareketler ve solunum indirimli.</li>
	<li>Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kulak ile düz bir kulak yatıyordu. Damlalıklı 20 µL % 5 FITC çözüm çözünmüş 1:1 aseton: Dibutil ftalat (DBP) kulak pinna ventral tarafına. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.</li>
	<li>24 h FITC uygulama sonra ötenazi servikal çıkığı tarafından takip karbon dioksit pozlama ile fare. Kulak pinnae makas kullanarak başından kulakları ayırarak PBS toplamak. Servikal dLNs ve kasık sigara boşaltma LNs dokuları çevreleyen LNs ayırmak için cımbız kullanarak PBS içine toplamak. Kasık sigara boşaltma LNs FITC+/Kaede kırmızı+ lökosit varlığı için negatif denetimleri olarak görev yapacak. Kurumsal iletişim kuralı başına karkas atmayın. Not: Uygun zaman yazı photoconversion analiz için hücre tipi ve bilinen göçmen davranışları üzerinde bağlıdır. Dendritik hücreler, örneğin, dLNs gibi erken 6 h mesaj DBP uygulama olarak tespit edilebilir.</li>
</ol>2. indüksiyon iltihaplanma ve fare Pinna Photoconversion
<ol><li>Bir laminar akış başlık, Kaede-Tg fare (arka plan C57Bl/6) 80 mg/kg ketamin ve salin çözünmüş 10 mg/kg xylazine mayi enjeksiyonla anestezi. Uygun anesthetization adım 1. 1'açıklandığı gibi olun.</li>
	<li>Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kulak ile düz bir kulak yatıyordu. Damlalıklı 20 µL bir 1:1 aseton: DBP kulak pinna ventral tarafına. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.</li>
	<li>DBP uygulama sonra bir yarık bir parça alüminyum folyo kesim ve kulak mor ışık kaynağına maruz slit kulağından çek. Kulak düz dorsal yüzü yukarı folyo kulağa güvenliğini sağlamak için çift taraflı bant kullanarak bakacak şekilde yatıyordu.</li>
	<li>Işık kaynağı ve photoconvert altında doğrudan kulak 3 dk 100 mW gücünde bir 405 nm ışık kaynağı kullanarak yerleştirin.</li>
	<li>24 h photoconversion sonra Kaede-Tg fareler ötenazi ve kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs adım 1. 3'açıklandığı gibi hasat. Not: Kaede kırmızı kaybı hızla hücre bölünmesi ortaya çıkar gibi ek konuları adım 1. 3'gösterdi, nükleer silahların yayılmasına karşı oranları analiz zamanlama belirler.</li>
</ol>3. vaksinia enfeksiyon fare Pinna ve FITC uygulama
<ol><li>C57Bl/6 fare buharlaşmış isofluorane ile adım 1. 1'açıklandığı gibi anestezi.</li>
	<li>Kulak ventral tarafında düz yatıyordu. Damlalıklı 5 x 106 plak oluşturan birim (PFU) PBS 10 µL üzerine kulak pinna içinde seyreltilmiş vaksinia virüs (VacV). 29-gauge iğne kullanarak, pinna 25 kez40poke.</li>
	<li>24 saat sonrası enfeksiyon, adım 1.1 ve damlalıklı 20 µL FITC çözünmüş aseton kulak teleklerinin ventral yan üzerine içinde %5 açıklandığı gibi isofluorane ile VacV-enfekte fareler anestezi. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.</li>
	<li>24 h FITC uygulama sonra fareyi ötenazi ve adım 1. 3'açıklandığı gibi kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs toplamak. Not: FITC DC çeşitli 24 h aralıklarla kaçakçılığı belirlemek için herhangi bir zaman noktası sonrası enfeksiyon, uygulanabilir. Biz daha önce dLNs DC göç gün 1-3 sonrası enfeksiyon41benzer düzeyde korunur bildirdi.</li>
</ol>4. vaksinia enfeksiyonu fare Pinna ve Photoconversion.
<ol><li>Kaede-Tg fareyle buharlaşmış isofluorane adım 1. 1'açıklandığı gibi anestezi.</li>
	<li>Kulak pinna VacV ile adım 3.2 açıklandığı gibi bulaştırmak.</li>
	<li>24 saat sonrası enfeksiyon, adım 2.1 içinde açıklandığı gibi VacV enfekte Kaede fareler anestezi ve photoconversion 2.3-2.4 adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirin.</li>
	<li>24 h photoconversion sonra fareyi ötenazi ve kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs adım 1. 3'açıklandığı gibi hasat. Not: adım 3.4 yukarıda belirtildiği gibi herhangi bir zaman noktası sonrası enfeksiyon photoconversion yönetilebilir.</li>
</ol>5. kulak ve lenf nodu akış sitometresi için işleme
<ol><li>Kulak pinnae tek hücre süspansiyonlar oluşturun: 1 mg/mL collagenase D ve içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey plaka kuyu içine aşağı bakacak şekilde kulak içi ile iki çift cımbız ve yer kullanarak kulak teleklerinin tahliyeleri ve dorsal taraf ayrı soyma Hank tamponlu tuz çözüm ((Ca2 + ve Mg2 +içeren) HBSS). 30 dk. basın sindirilir doku 37 ° C'de 70 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla kuluçkaya.</li>
	<li>Tek hücre süspansiyonlar LNs oluşturun: LNs kuyu 1 mg/mL collagenase D ve HBSS içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey tabak yerleştirin. Lenf nodu iki 29-gauge iğne kullanarak kapsül ve 30 dk. 37 ° C'de lenf düğümleri kuluçkaya tease aç'a basın sindirilir doku 70 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla.</li>
</ol>6. intradermal Melanom tümör implantasyon ve Photoconversion.
<ol><li>Bir Kaede-Tg fare tıraş kullanılarak arka ortasından kürk tıraş.</li>
	<li>29-gauge iğne sol ve sağ üst scapulae arasında arka ortasına yerleştirin ve intradermally (50 µL serum içinde seyreltilmiş) 5 x 105 tümör hücreleri Kaede-Tg fareler deri içine enjekte. Tümörler (LNs tümör üst sırt ortasında yeryani, sol ve sağ brakiyal) belirtilen lenf düğümlerine lenf drenaj sağlamak için dikkatli bir şekilde konumlandırılmalıdır. Bu LNs cilt/tümör aracılığıyla doğrudan photoconversion, neden olabilir gibi tümör dLN yukarıda yerleştirmekten kaçının.</li>
	<li>Tümörler istenen boyuta (100-650 mm3) büyümeye izin.</li>
	<li>2.1 içinde açıklandığı gibi bir Kaede-Tg fare bir gün önce doku koleksiyonu, anestezi ve tümör çevresinde herhangi bir yeni regrown kürk tıraş.</li>
	<li>Alüminyum folyo bir dairesel delik ve tümör tümör ışık kaynağına maruz çek. Delik biraz tümör tümör geri delikten düşmesini önlemek için daha küçük ve bitişik, Sigara-tümörün cilt dönüşüm en aza indirmek.</li>
	<li>Tümör hemen altında ışık kaynağı ve photoconvert 5 dk 200 mW gücünde bir 405 nm ışık kaynağı kullanarak yerleştirin.</li>
	<li>24 h photoconversion sonra adım 1. 3'açıklandığı gibi farelerin ötenazi. Tümörler, brakiyal dLNs ve kasık sigara boşaltma LNs PBS toplamak. Tümör çevresindeki deri makas kullanarak uzak kesmek ve INS adım 1. 3'konusunda açıklanan şekilde kaldırın.</li>
</ol>7. tümör ve lenf nodu akış sitometresi için işleme
<ol><li>Tek hücre kullanılamaz hale tümör oluşturun: tümör makasla 1 mg/mL collagenase D ve HBSS içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey plaka kuyu içine kıyma. 1 h. basın sindirilir doku için 37 ° C'de 70 µm naylon süzgeç aracılığıyla kuluçkaya.</li>
	<li>Tek hücre süspansiyon lenf nodlarının adım 5,2 açıklandığı gibi oluşturun.</li>
</ol>8. antikor akış sitometresi için boyama
<ol><li>Dokular tek hücre süspansiyonlar sindirerek sonra standart akış sitometresi boyama teknikleri hücreleri faiz işaretleyicilerle etiketlemek için gerçekleştirin. Kısaca, damlalıklı 2 x 106 hücrelere bir 96-şey plaka. Buz üzerinde 20 dk için Fc bloğu (1 µg/mL) ile örnekleri kuluçkaya; FACs arabellek (%1 sığır serum albümin PBS içinde) iki kez yıkayın. Canlı/ölü leke (PBS içinde seyreltilmiş) örnekleri için ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya; iki kez FACs arabellek ile yıkayın. Birincil antikorlar (Tablo reçetesi) FACs arabellek için buz üzerinde 30 dk içinde seyreltilmiş ile kuluçkaya; iki kez FACs arabellek ile yıkayın. Not: Kaede yeşil ve kırmızı floresans FITC ve PE fluorophores ile çakışıyor Kaede; Böylece, FITC ve PE-Birleşik antikorlar Kaede proteinler ile birlikte kullanılamaz.</li>
	<li>Boyama sonra örnekleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırın. Alternatif olarak, %2 ile hücreleri tamir PFA.</li>
</ol>9. Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>FITC (Kaede yeşil) ve PE (Kaede kırmızı) Kanal toplam Aralık % 70-80 Devresel_ödeme gerilimleri ayarla (Merkezi nüfus yaklaşık 104) ex vivo Kaede yeşil veya kırmızı Kaede tek renkli splenocytes ya da kan kullanarak. Not: Bu büyük sinyal yaymak yol açar gibi Kaede yeşil (FITC) ve Kaede kırmızı (PE) kanalları için telafi etmek değil.<ol>
<li>Tek renkli Kaede denetimleri oluşturmak için bir Kaede-Tg fare--dan bir dalak veya kan toplama. Kırmızı kan hücreleri ile ACK arabellek parçalayıcı, sonra hücreleri iki gruba ayırın: Kaede yeşil ve dönüştürülmüş Kaede kırmızı din.</li>
		<li>Tek renk Kaede kırmızı denetimleri, askıya PBS 1 mL hücrelerde ve photoconvert 5 dk 100 gücünde bir 405 nm ışık kaynakları kullanarak bir 24-şey plaka mW. Bu hücreler Kaede yeşil (FITC) ve Kaede ayarlamak için kullanın kırmızı Devresel_ödeme gerilimleri akış sitometresi (adım 9.1) üzerinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaede protein gerilimleri ayarladıktan sonra tek-fluorophore tazminat boncuk üretici yönergelerine başına etiketli kullanarak diğer tüm birincil antikor lekeler için telafi.</li>
	<li>Örnekleri verileri toplamak için bir akış sitometresi çalıştırın. Not: Kaede protein sürekli hücreleri tarafından üretilmektedir. Bu o 24 h anlamına gelir photoconversion sonra dönüştürülmüş hücrelerin Kaede yeşil için çift olumlu olacak ve Kaede yeni sentezlenmiş Kaede (yeşil) kırmızı protein hücre içinde birikmiş.</li>
	<li>FlowJo yazılım veya benzer bir yazılım kullanarak veri analiz.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çakışma var.

Lökosit çıkış periferik, Sigara-lenfoid doku üzerinden kritik başlatma ve bağışıklık yanıtı çözümlenmesi için olsa da, çıkış düzenleyen moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır. Bilgi serisindeki bu boşluğun miktar içinde vivoiçin araçları hazır kullanılabilirliğini büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Burada, photoconvertible fareler (Kaede-Tg) endojen lökosit çıkış deri ve tümör ölçmek ve inflamatuar FITC boya ile doğrudan kafa kafaya karşılaştırma sağlamak için ve enfeksiyon modelleri nasıl kullanılacağını açıklar. B...

Periferik doku bağışıklık yanıtı sadece sitelerine lökosit alımı iltihap tarafından aynı zamanda onların sonraki bekletme düzenleyen mekanizmalar tarafından şekillenir. Böylece, koruyucu bağışıklık kalır içinde ister bir lökosit girer, ya da daha doğrusu geçirir lenf damarları ile periferik doku dışında belirlemek toplu hücresel ve moleküler mekanizmaları tarafından dikte edilir. Önemlisi, doku (çıkış olarak adlandırdığı) lenf damarları ile çıkmak lökosit için eğilimi onların özel işlevlere bağlıdır. Dendritik hücreler (DC) yanıt olarak olgunlaşma sinyalleri antijen taşıma ve edinilmiş bağışıklığın1için gerekli olan bir işlemi lenf düğümleri (dLN), drenaj içinde tanıtımı için önde gelen göçmen davranış elde etmek. Makrofajlar ve nötrofiller, gibi atma myeloid hücrelerin apoptotik enkaz fagositoz ile temizlemek için hizmet vermektedir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında nötrofil doku çıkış ve sonuçta apoptosis dLNs2 ve kolit DSS kaynaklı bir model geçmesi, veri makrofaj çıkış yerel iltihap3gidermek için gerekli olan hipotezi destekler. Olup tüm inflamatuar bağlamlarda, nötrofil ve makrofaj çıkış oluşur ancak bilinmemektedir. Kanıt için T lenfosit çıkış kararlı duruma4,5,6,7, virüslü8ve iltihaplı4,9,10, 11,12 periferik, Sigara-lenfoid doku gösterir T hücreleri aktif olarak recirculate, bu çıkış sürücü doku tabanlı sinyalleri kötü anlaşılır kalır rağmen. Çeşitli çalışmalarda belirledik sinyalleri lenfatik kapiller boşaltma doğru yönlü geçiş için gerekli ve sonraki çıkış kemokin (C-C motifi) ligand de dahil olmak üzere 21 (CCL21) ve onun reseptör CCR74,11, 13, kemokin (C-X-C motifi) ligand 12 (CXCL12) ve reseptör CXCR42,14ve sphingosine-1-fosfat (S1P)10,15,16. Bu mekanizmalar tüm bağlamlarda etkin değildir ve olup tüm hücre tiplerinin çıkış belirlemek bir açık soru kalır. Önemlisi, daha fazla çıkış ve fonksiyonel önemini hastalığında yöneten mekanizmaları içgörü nicel vivo içinde analiz yöntemleri gerektirir.
Doğrudan cannulation lenf damarlarının, lökosit, etiketli ex vivo transdermal uygulama floresan izleyiciler, evlat edinen transferi dahil olmak üzere birden fazla hayvan modelleri vivo içinde çıkış ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır, Enjeksiyon etiketli parçacıklar ve in vivo photoconversion17,18. Afferent fare lenf damarları doğrudan cannulation zor ve küçük hayvanlarda sıvı toplanabilir birimler tarafından sınırlı. Böylece, cannulation büyük ölçüde büyük hayvanlarda yapılmıştır (Örn., koyun) gibi cerrahi işlemler nerede pratik. Bu çalışmalar lenf10,19,20lenfoid ve myeloid hücrelerin varlığı için doğrudan kanıt sağlar. Ayrıca, ovine modelleri akut ve kronik inflamasyon lenf lenfosit varlığı neredeyse 100-fold10,21tarafından artış ortaya koyuyor.
Etiketli ve genetik olarak işlenmiş lenfositlerin evlat edinen transfer, CCR7 CD4 çıkış için gerekli olduğunu da önemlisi koymuştur+ T hücreleri Akut iltihaplı cilt5,11, lenfositler ön süre S1P reseptör agonist küçük molekül ile FTY720, yalnızca kısmen onların çıkış10engeller. İlginçtir, kronik iltihaplı deri üzerinden transfer edilen lenfositlerin çıkış CCR7 bağımsız10, ama kısmen CXCR49gerektirebilir. Evlat edinen transfer deneyler, ancak, aktif ve etiketli lenfositler doku doku ve yükseltilmiş interstisyel sıvı basıncı biyomekanik ortamı değiştirir enjeksiyon ile içine ex vivo fizyolojik olmayan sayıda teslim Bu ilk lenfatik kapiller açın ve onların taşıma özellikleri22alter. Floresein isothiocyanate (FITC) varlığı veya yokluğu dermal tahriş edici bir alternatif, transdermal uygulama olarak (Örn., Dibutil ftalat, DBP) veya enfeksiyon23,24 için izleme sağlar İzleyici biriken ve dLNs için göç fagositik hücreler. Benzer şekilde, fluorescently etiketli tümör tümör malzeme25yuttu fagositik hücreleri izlemek için bir yol sağlar. Bu yöntemler DC çıkış13,14,17,26,27 yöneten ancak olmayan fagositik takip edemiyoruz mekanizmalarının içine önemli fikir vermiş lenfositler ve yorumu çözünür FITC LN ikamet DCs böylece göçmen olmayan-etiketleme ücretsiz lenfatik drenaj tarafından karmaşık.
Alternatif olarak, intravital mikroskobu vivo içinde izleme gerçek zamanlı28,29fizyolojik ilgili lökosit nüfusun sağlayan güçlü bir araçtır. Mikroskopi kompleks kayma ortaya koymuştur ile birlikte muhabir fareler ve antikor tabanlı vivo içinde immünfloresan etiketleme, intravital kullanılan ve ticareti, dahil interstisyel geçiş30 bağışıklık zamansal dinamiği hücre , hicret arasında lenfatik endotel, geçit lenfatik lümen ve geçiş sonucunda LN giriş28,31içinde. İntravital görüntüleme teknikleri geniş kabulü gider, kurmak, için gerekli uzmanlık ile sınırlıdır ve birden çok hücre tipleri miktarının için çıkışını sınırlı. Yine de, nüfus dinamikleri analiz nicel metodlar kaplin intravital görüntüleme kurcalayarak geçiş doğru ve lenfatik kapiller içinde ve hareket mekanizmaları ile ilgili olarak ek ve önemli mekanik kavrama sağlayacak 18 , 31 , 32.
Sonuç olarak, in vivo photoconversion in situ etiketleme için izin veren bir yöntem olarak fagositik aktivite ve (akış sitometresi ile birleştiğinde) fizyolojik lökosit çıkış miktar için bağımsız ortaya çıkmıştır Devamsızlık veya meydan okuma varlığı. Kaede-Tg fareler yapısal mor ışık, sonra geri dönüşümsüz kırmızı floresans (Kaede kırmızı)33' e dönüştürür maruz kadar yeşil floresan (Kaede yeşil) sergiler taşlı mercan dan izole bir protein hızlı. Photoconverted hücrelerin periferik doku sitelerden çıkış olarak izleniyor ve dLNs içinde birikir. Bu ve diğer benzer photoconvertible fare modelleri34,35 önemli biyoloji bünye çıkış düzenleyici T hücreleri cilt36, CXCR4 bağımlı B hücre çıkış Peyer's yamalar37 üzerinden de dahil olmak üzere indirdik , peptid yeniden meydan38ve geniş lökosit çıkış tümör microenvironments39üzerine sakin bellek T hücrelerinin seferberlik. Burada, kutanöz inflamasyon ve enfeksiyon varolan verileri doğrudan karşılaştırma için photoconvertible yöntemi ile izin bağlamında photoconversion transdermal FITC uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, implante tümörler photoconversion göstermek ve dönüşüm verimliliği ve tümör microenvironments üzerinden seçici çıkış açıklayın. Bu nedenle, biz daha fazla uygulama bu yöntemlerin lökosit çıkış intratumoral lökosit karmaşıklığı, anti-tümör dokunulmazlık, yorumlamak için önemli etkileri olacaktır tümörler üzerinden kritik biyoloji aydınlatmak için gerekli olduğunu iddia ve tedaviye yanıt.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Fiberglas ve kolimtörlü Gümüş-LED-405B ışık kaynağı</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat izomeri I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>dibutil ftalat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>aseton</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>29 guage şırıngalar</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>70 um hücre süzgeçleri</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Keson</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>CANLI / ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Anti-fare CD16 / CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (klon N418)</td> <td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (klon M5 / 114.15.2)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (klon 145-2C11)</td> <td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (klon 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (klon HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (klon BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (klon 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (klon M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (klon RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (Fraksiyon V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Anit-Rat ve Anti-Hamster Igk / Negatif Kontrol Kompanzasyonu Parçacık Seti</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Yazılımı</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Periferik dokulara gelen lökosit çıkış drenaj lenf düğümleri için sadece immün gözetim ve başlatma için kritik değil ama ayrıca periferik doku yanıt olarak çözümlenmesini katkıda bulunur. Çeşitli yöntemler kullanılır lökosit çıkış lenfoid sigara, periferik dokulara üzerinden ölçmek için içerik bağımlı çıkış yöneten hücresel ve moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. Burada, biz Nicel analiz lökosit çıkış fare deri ve tümörleri, in situ photoconversion nasıl kullanılacağını açıklar. Photoconversion doğrudan lökosit kutanöz doku içinde ikamet etiketleme için sağlar. Cilt ışığa maruz kalma menekşe yerel indükler rağmen inflamatuar yanıt lökosit infiltratlar ve floresan izleyiciler, transdermal uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması vasküler leakiness photoconversion özellikle ile karakterize göçmen dendritik hücre popülasyonlarının etiketli ve kutanöz microenvironments ve tümör myeloid ve lenfoid çıkış miktar aynı anda etkin. Lökosit çıkış mekanizmaları anlayışımız intratumoral lökosit karmaşıklık içinde eksik bir bileşeni olarak kalır ve böylece uygulama burada açıklanan araçları bağışıklık microenvironments tümör dinamikleri benzersiz bir anlayış sağlayacak Devlet ve tedaviye yanıt yükseliyor.

Biz ilk etkinliğini değerlendirmek ve fare cilt ilişkili iltihap belirlemek için literatürde yayınlandı photoconversion sonuçları çoğaltmak aranan. Kulak pinna 100 mW menekşe ışığa maruz (405 nm) 3 dk. daha önce33açıklandığı gibi için. Tek poz takip tüm CD45 x dönüşüm verimliliğini ortaya hemen kulak cilt veya servikal dLNs oluşturulan hücre süspansiyonlar+ lökosit cilt dönüştürülmüş hiçbir hücre ile gözlenen dLNs (Şekil 1A)...

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Photoconversion lökosit ikamet ve hastalıklı durumlarda birden fazla doku sitelerinden çıkış dinamikleri içine mekanistik bir anlayış için lökosit çıkış kantitatif analizi için izlenebilir in vivo yöntemi sağlar. Burada kutanöz tümörlerden gelen lökosit takibinin faydasını gösteriyoruz. Bu titrenin diğer doku ve hastalıklara uygulanması sadece ışığı uygulama yeteneği ile sınırlıdır.Bu tekniğin en büyük avantajı endojen in vivo iltihaplı dokulardan bir çıkış olarak bağışıklık hücre popülasyonları transfer yerine, nicelik sağlar. Iltihabı tetiklemek için, ayak ucutu yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, bir anestezi Kaede transgenik fare kulak pinna ventral tarafına, dibutil ftalat veya DBP 20 mikrolitre yönetmek için bir mikropipet kullanın. DBP'nin kurumasını sağladıktan sonra, kulağı alüminyum folyo parçasının yarıklarından geçirin ve dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde kulağı folyoya düz sabitlemek için çift taraflı bant kullanın.Daha sonra, doğrudan 405 nanometre ışık kaynağının altında olduğunuzu konumlandırın ve 100 miliwatt güçte üç dakika boyunca fotodönüştür. Vaccinia enfeksiyonu için, bir anestezi Kaede transgenik fare nin kulak pinna üzerine PBS 10 mikrolitre vaccinia virüsü n için 6 plak oluşturan birimleri 5 kez 10 yönetmek ve pinna 25 kez dürtmek için bir mikropipet kullanın. 24 saat sonra, sadece gösterildiği gibi pinna photoconvert.Uygun deneysel zaman noktasında, pinnae ve servikal ve inguinal lenf düğümleri hasat ve her pinna ventral ve dorsal tarafı soymak için cımbız iki çift kullanın. Daha sonra lenf düğümleri ve pinna parçaları yerleştirin, kulak içi aşağı bakacak şekilde, kollajenaz D mililitre başına 1 miligram ve kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS seyreltilmiş Dnase mililitre başına 80 birim içeren 24 kuyulu bir plaka bireysel kuyular içine. Her lenf nodu kapsülü açmak ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka yerleştirmek için iki 29 gauge iğne kullanın.Kuluçka sonunda, her dokunun tek hücre süspansiyonları elde etmek için ayrı 70 Mikron naylon hücre süzgeçleri ile sindirilmiş pinna ve lenf düğümü dokularına basın. Tümörler uygun deneysel boyuta büyüdü, tümör siteetrafında herhangi bir yeni büyümüş kürk tıraş ve alüminyum folyo bir parça kesilmiş dairesel bir delik ile tümör çekin. Tümörü 405 nanometre ışık kaynağının hemen altına yerleştirin ve 200 miliwatt güçte 5 dakika boyunca fotodönüştürün.Fotodönüşümden 24 saat sonra, her hayvandan tümörleri ve brakiyal ve inguinal lenf düğümlerini hasat edin ve HBSS'de Kollajenaz D ve DNase içeren 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularında tümörleri kıymak için makas kullanın. Ayrı kuyular içine lenf düğümleri yerleştirin ve sadece gösterildiği gibi kapsül açık alay. 37 santigrat derece bir saat tümörler ve lenf düğümleri için yarım saat kuluçka sonra, her doku tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için ayrı 70 Mikron süzgeçler aracılığıyla sindirilmiş dokulara basın.Akış sitometri sitometri ile tek hücre süspansiyonları analiz etmek için, ilk bir Kaede transgenik fare dan dalak veya kan toplamak ve amonyum klorür potasyum tampon ile kırmızı kan hücreleri lyse. Bir dönüştürülmemiş Kaede FITC ve bir dönüştürülmüş Kaede PE nüfus ve 24-iyi plaka bir kuyuda PBS bir mililitre tek renkli Kaede PE hücreleri resuspend hücreleri bölmek, sonra güç 100 miliwatt güç 405 nanometre ışık kaynağı altında 5 dakika için hücreleri fotodönüştür. Daha sonra fotoconverted Kaede PE hücreleri ve dönüştürülmemiş Kaede FITC hücreleri her floresan kanalın toplam aralığının% 70-80 fotoçarpan voltajayarlamak için kullanın.Kaede proteinleri için gerilimler ayarlandıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre, tek florofor etiketli tazminat boncukları kullanarak diğer tüm primer antikor lekelerinin telafisi. Daha sonra, standart akış sitometrik analiz protokollerine göre akış sitometresi üzerindeki örnekleri çalıştırın. Fotodönüşüm maruziyetinden hemen sonra kulak derisinden veya servikal drenaj lenf düğümlerinden oluşan tek hücreli süspansiyonlar, ciltteki tüm CD45 pozitif lökositlerin %78 dönüşüm verimliliğini ortaya çıkarır ve drenaj lı lenf düğümlerinde dönüştürülmüş hücreler gözlenmez.Fotodönüşümlü kulaklarda CD45 pozitif lökositlerin infiltrasyon sayısının sayısallaştırılması, menekşe ışık maruziyetinin lökosit infiltrasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden olduğunu ortaya koymaktadır. ANCAK CD45 pozitif lökosit infiltrasyonundaki bu artış, vaccinia virüsü gibi güçlü bir inflamatuar uyarıcının indüklediği infiltrasyona göre küçüktür. Photoconversion da Miles tsay ile ölçülen kulak pinnae vasküler geçirgenliği artırır, birlikte doku iltihabı üzerinde menekşe ışık etkileri doz optimize ederken dikkate alınması gerektiğini belirten, maruz kalma süresi ve veri yorumu.Fotokondisyonlu hayvanlardan ayrıştırılmış tümör hücrelerinin akış sitometrik analizi, kaede FITC pozitif ten Kaede PE pozitif intratümöral CD45 pozitif hücrelerin önemli bir dönüşüm ortaya koymaktadır, lenf düğümü hücreleri drenaj ise dönüştürülmemiş kalır. CD45 pozitif lökositlerin fotodönüşüm etkinliği tümör tipleri ve boyutları arasında anlamlı olarak farklılık gösterirken, küçük melanom tümörlerinde CD45 pozitif lökositler en etkili fotodönüşümü gösterdi. Tümör hacimleri arttıkça, dönüşüm verimi yaklaşık% 50'ye düşer, melanin küçük tümörlerde sadece yaklaşık% 30 melanin üreten tümörler içinde gözlenen CD45 pozitif hücrelerin maksimum fotodönüşüm ile fotodönüşüm verimliliği üzerinde çarpıcı bir etkisi vardır, tümör hacimleri yaklaştıkça 10% düşer 400 milimetreküp.Fotodönüşümden 24 saat sonra tümör drenaj lenf nodlarının incelenmesi, çeşitli fenotiplerin Kaede kırmızı pozitif immün hücrelerinin varlığını ortaya çıkararak fotokonjenden lökosit göçünün ortaya çıkar. Bu teknik, gelişiminden sonra, İmmünoloji alanında araştırmacıların sabit hal inkinetiğini ortaya çıkarmasını ve periferik dokuda iltihaplı lökosit cirosunu ortaya çıkarmasını istedi. Bu yordamı denerken, sadece ilgi doku fotodönüştürülerek olduğundan emin olmak önemlidir, çevreleyen doku yanlışlıkla fotodönüşüm sonuçlarınızı tehlikeye atacaktır gibi.Bu yönteme yeni yeni bireyler, doku larının dönüştürülmesi için maruz kalma süresini ve lekositin dinamiğine bağlı olarak doku toplamadan önceki süreleri optimize etmelidirler.

quantifying-leukocyte-egress-via-lymphatic-vessels-from-murine-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

Bu video, farelerde Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG ile ayak tabanı enfeksiyonunu takiben dendritik hücre göçünü izlemek için bir testi göstermektedir. Bakteriyel enfeksiyon üzerine, aktive edilmiş cilt DC hücreleri, hücre geçirgen bir karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) boyası ile etiketlenir. Popliteal drenaj lenf noduna DC migrasyonu için uygun bir aralıktan sonra, nod hücreleri izole edilir ve DC'ye özgü yüzey belirteçleri için immün boyamaya tabi tutulur.

Enfekte farelerde drenaj lenf düğümlerine cilt dendritik hücre göçünü izlemek için CFSE tabanlı bir test

Bu protokol, bir fare tümör modelinde tümör mikroçevresi içindeki lökosit alt kümelerinin ayrıntılı değerlendirmesi için bir yöntemi açıklar. Chemerin eksprese eden B16 melanom hücreleri, sinjeneik farelere deri altından implante edildi. Tümör mikroçevresinden alınan hücreler daha sonra boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi, bu da ayrıntılı lökosit alt küme analizlerine izin verdi.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Farelerde, deriden boşaltılan lenf noduna hücre göçünü izlemek için yapılan ve Bacille Calmette-Guérin ile ayak pedi enfeksiyonundan sonra lenf noduna mobilize edilen cilt Dendritik hücrelerinin karakterizasyonunu sağlayan bir test tanımlanmıştır.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Melanom, hızla diğer organlara yayılan çok agresif bir hastalıktır. Bu protokol, metastatik melanomun Braf / Pten fare modelindeki inguinal lenf düğümlerinin hacmini izlemek için 3D render ile birlikte ultra yüksek frekanslı ultrason görüntülemenin uygulanmasını açıklamaktadır.

Braf/Pten Genetiği Mühendisliğiyle Tasarlanmış Melanom Fare Modelinde Ultra Yüksek Frekanslı Ultrason Görüntüleme ile Lenf Düğümü Hacminin Analizi

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Öğrenin, fare deri ve tümör lenf damarlarında lökosit çıkış miktarını in vivo fotokonversiyon teknikleriyle nasıl ölçülür. Bu yöntem, immünoloji ve kanser biyolojisi araştırmalarında endojen bağışıklık hücrelerinin davranışlarını anlamaya yardımcı olur.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Daha fazla video keşfet