Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde
January 9th, 2019
Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.
Lenfomalar histolojik olarak karmaşık tümörlerdir. Bu nedenle, çok katlı floresan immünohistokimya tümör hücreleri ve mikroortamda ilgi belirteçleri çalışma için konvansiyonel kromojenik immünohistokimya üzerinde avantajlar sunuyor. Bu teknik histolojik lenfoma örneklerinde antikor bazlı boyama puanlama standartlaştırma potansiyeline sahiptir, tarihsel tümör mikroortamının karmaşıklığı nedeniyle zorlu bir süreçtir.
Özellikle, çok katlı floresan immünohistokimya ve spektral görüntüleme tek bir slayt içinde birden fazla leke kantitatif ölçüm sağlar, böylece klinik malzeme içinde antijen co ekspresyon ve aralıklı ilişkinin değerlendirilmesi sağlar. Bir mikrodalga kaydetmek cam kavanoz standart bir antijen alma tampon de-mumlu ve rehydrated slaytlar daldırma ve uygun bir mikrodalga ısı kaynaklı epitop alma gerçekleştirerek başlayın. Son multipleks dizisinde antikor konumuna göre mikrodalga sıyırma ek tur gerçekleştirin.
Örneğin, dördüncü antikor boyama önce mikrodalga sıyırma üç ek tur gerektirir. Sıyırma işlemi tamamlandıktan sonra, en az 10 dakika soğuması için oda sıcaklığında distile suya slaytlar aktarmak için forseps ve ısıya dayanıklı eldiven kullanın. Antijen alma solüsyonu soğuduğunda, ticari bir peroksidaz bloğu ile doku peroksidaz aktivitesini 10 dakika boyunca bloke edin ve ardından tris-tamponlu salin veya TBS'de beş dakikalık bir yıkama ve iyonik olmayan bir deterjan.
Tamponu bloke eden 10 dakikalık bir kuluçka ile spesifik olmayan lekeleri engelleyin ve ardından oda sıcaklığında ana ilgi antikorunu 30 dakika ve TBS-D tamponu ile üç beş dakikalık yıkar. Daha sonra, uygun bir horseradish peroksidaz ile kuluçka oda sıcaklığında 15 dakika ikincil antikor konjuge, gösterildiği gibi TBS-D tampon üç yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için slaytlara uygun bir tiramid bazlı floresan reaktif uygulayın ve ardından üç beş dakikalık TBS-D yıkayın.
Gösterildiği gibi taze antijen alma çözeltisi birincil ve ikincil antikorları kaldırmak için ek bir mikrodalga tabanlı sıyırma gerçekleştirin. Geri alma sonunda, distile suda slaytlar serin ve laboratuvar mendilleri ile doku olmadan slaytlar üzerinde alanları kuru. Oda sıcaklığında 10 dakika dappy ile inküböz slayt üç TBS-D yıkayArak takip.
Daha sonra, dokulara temas etmeden laboratuar mendilleri ile slaytları dikkatlice kurulayın ve numuneleri görüntüleme için uygun bir montaj ortamıyla monte edin. Monopleks slayt taraması için, numuneleri etiketlemek için kullanılan floroforlardan uygun filtreleri seçin ve işaretçi için en güçlü sinyale sahip olması gereken doku bileşenine odaklanarak temiz bir sinyal elde etmek için uygun bir pozlama süresini belirlemek için her belirteç ve buna karşılık gelen floresan kanalını inceleyin. Piksel yoğunluğunun çapraz örnekkarşılaştırmasına izin vermek için, canlı kamera görüntüsünde aşırı pozlanmış alanlar kalmadan her bir kanaldaki pozlama süresini ayarlamak için canlı kamera ayarını kullanın.
Tüm slaytlar tarandığında, normal immünohistokimyasal desenle görsel olarak karşılaştırmak ve boyama deseninin doğru olup olmadığını belirlemek için simüle edilmiş parlak alan görüntüleri edinin. Doku mikrodizi slaytlarını taramak için görüntüleme sistemindeki doku mikrodizi tarama modunu ve uygun bir otomatik odaklama algoritmasını kullanın. Tüm doku kesiti slaytları için, slaytlar en temsili tümör bölgelerinden optimal görüntüleri seçmek için nitelikli bir patolog tarafından gözden geçirilir.
Analize başlamadan önce, analiz için ilgi hücreleri tanımlamak için bir tümör belirteci seçin. Bir patolog görüntüleri gözden ve doku segmentasyonu gerekli olup olmadığına karar verin. Gerekirse, segmentasyon için uygun denetim bölgelerini seçin ve görüntü çözümleme yazılımının bu bölgeleri doğru şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını kontrol edin.
Hücre segmentasyonundan sonra, patoloğun amaçlanan segmentasyon yaklaşımının doğrulmasını sağlamak için segmentasyon haritasını gözden geçirmesini ve hücre segmentasyonunun yeterli olup olmadığını veya tümör hücreleri, stroma veya nekroz için zenginleştirilmiş bölgeleri seçmek için ek doku segmentasyonu gerekip gerekmediğini belirlemek için tek tek görüntüleri gözden geçirmesini sağlayın. Daha sonra patolog ile birlikte her belirteç için optik yoğunluk pozitif kesme değerini belirlemek ve hücre başına marker yoğunluğu frekans dağılımıanaliz etmek için uygun bir istatistik yazılım programında histogramlar oluşturmak. Tanımlı hücreler içinde belirli ilgi işaretleri için yüzde verileri oluşturmak için, veri sayfasına bir özet tablo ekleyin ve tek bir ilgi işaretinin pozitiflik yüzdesini hesaplamak için Toplam'ı seçin.
Toplam sayıya bölünen işaretleyici pozitif hücrelerin toplam sayısı hesaplanır. Sonuç, bir çekirdek veya bir çalışma numarası ile marker pozitif hücre yüzdesidir. Sayısal veri oluşturmak için, her çekirdek veya çalışma numarasının her bir belirteci için ortanca normalleştirilmiş sayımı ayıklamak için bir örnek teki tüm hücre çalışmalarında ilginin ortalama yoğunluğunu elde edin.
Burada c-MYC ve BCL2 gen rearanyaygın büyük B hücreli lenfoma örneği için temsili multiks floresan immünhistokimyasal görüntüler gösterilmiştir. Simüle parlak alan immünohistokimyasal görüntüler benzer bir tümör belirteç boyama deseni göstermektedir. Anjiyoimmünoblastik T-hücreli lenfomalarda t-hücre paneline multiks floresan immünohistokimyasal görüntülerin uygulanması tümör örneğinin hücreheterojenliğini ortaya koymaktadır.
Burada bademcik kontrol numunesinin optimizasyonu ve elde edilen veri analizi gösterilmiştir. Tümör hücrelerinde ve tümör mikroortamında marker ekspresyonu ve lokalizasyonu niantitate için karıştırma aşamasından sonra çeşitli görüntü analizi yazılım programları kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların lenfomanın tek doku bölümlerinde belirli hücre tipleri içinde birden fazla belirteçlerin ortak ekspresyonunu incelemelerinin önünü açıyor.
Mikro dalgalı adımlar sırasında ısıya bağlı yaralanmaları önlemeye özen ve güvertede gerçekleştirilen tarama adımları sırasında düşme risklerine dikkat edin.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, lenfomadaki birden fazla kanserle ilişkili antijeni lokalize etmek için multiplex floresan immühistokimyasal boyama ve görüntüleme protokolünü sunmaktadır. Bu yöntem, doku kesitlerinde biyobelirteçlerin birlikte lokalizasyon analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- İmmünohistokimya
- Kanser Biyolojisi
Arka Plan
- Lenfomalar histolojik olarak karmaşık tümörlerdir.
- Multipleks floresan immünohistokimya, geleneksel yöntemlere göre avantajlar sağlar.
- Bu teknik, tümör belirteçlerini ve mikroçevreyi incelemede yardımcı olur.
- Antikor bazlı boyama puanlamasının standardizasyonu tarihsel olarak zorlu bir konu olmuştur.
Çalışmanın Amacı
- Kanserle ilişkili antijenlerin eşzamanlı lokalizasyonu için bir protokol geliştirmek.
- Antijen eş-ekspresyonunun değerlendirilmesini kolaylaştırmak.
- Klinik materyaldeki mekansal ilişkileri daha iyi anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Arıtılmış ve yeniden nemlendirilmiş slaytların antijen geri kazanım tamponunda daldırılması.
- Mikrodalga kullanılarak ısı ile uyarılan epitop geri kazanımı.
- Antikor konumuna göre ek mikrodalga soyma.
- Tek bir slaytta birden fazla boyanın kantitatif ölçümü.
Ana Sonuçlar
- Birden fazla kanserle ilişkili antijenin başarılı lokalizasyonu.
- Antijen eş-ekspresyonunu değerlendirme kabiliyetinin artırılması.
- Histolojik örneklerde puanlama standartlaştırmasının iyileştirilmesi.
- Tümör mikroçevresinin analizini kolaylaştırma.
Sonuçlar
- Multipleks floresan immünohistokimya, lenfoma araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Protokol çeşitli doku kesitleri için uyarlanabilir.
- Bu yöntem kanser biyolojisini daha iyi anlamaya yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multiplexed fluorescent immunohistochemistry enables quantitative assessment of multiple protein targets within complex lymphoma tissue sections, addressing a key challenge in biomarker validation. By preserving spatial context and minimizing sample consumption, the method supports mechanistic de-risking in early discovery and improves predictive confidence for target prioritization. This capability enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through co-expression analysis of lymphoma subtype markers in specific cell types.
- Operational Value: Reduces sample utilization by allowing multiplexed readouts from single tissue sections, increasing throughput in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by clarifying antigen spatial relationships within the tumor microenvironment, informing functional target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs including mean intensity and percentage positivity per marker, enabling standardized scoring across histological samples.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through optimized antibody stripping and staining cycles, improving reproducibility in biomarker assays.
- Platform Reuse: Compatible with tissue microarray (TMA) scanning and whole tissue section analysis, supporting scalable screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains spatial and quantitative fidelity from discovery samples through preclinical validation, supporting biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by quantifying marker expression in defined cellular compartments of lymphoma models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in pathway interpretation by resolving antigen co-expression patterns in complex tumor stroma.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting hypothesis testing in early biology, enabling assay-ready biomarker panels for screening, and providing quantitative analytics for translational decision-making.
- Discovery Biology: Supports target validation through multiplexed detection of lymphoma markers in tumor and microenvironment compartments.
- Screening: Enables reproducible, quantitative biomarker assessment via standardized staining and imaging protocols suitable for high-content analysis.
- Analytics: Delivers normalized intensity and positivity percentage readouts that facilitate comparative analysis across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by preserving spatial context and enabling correlation with phenotypic outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunostaining and imaging capability applicable across lymphoma subtypes and therapeutic target panels.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through spatial multiplexing.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of IHC scoring, reducing inter-operator variability in biomarker assessment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling parallel biomarker evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through quantitative, spatially resolved expression data in lymphoma models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, spectral imaging, and image analysis for multiplex fluorescent workflows.
- Dependent on microwave-based antigen retrieval and stripping infrastructure, with optimization needed per antibody sequence.
- Necessitates cross-team standardization between pathology, imaging, and data analysis for consistent segmentation and threshold setting.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to new tissue types or antibody panels beyond lymphoma models.
- Includes practical limitations such as potential signal degradation during iterative stripping and the need for careful thermal control to prevent tissue damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Monoplex Tyramide-Based Immunofluorescence
3:22
Monoplex Slide and Tissue Microarray (TMA) Scanning
4:36
Data Analysis
6:28
Results: Representative Mutiplexed Fluorescent Immunohistochemical (mf-IHC) Staining, Imaging, and Analysis
7:10
Conclusion
