Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma

Bu immünohistokimyasal ve histopatolojik protokol dev hücreli arteritvasküler mikroortama potansiyel prognostik ve terapötik değeri olan bir aday protein olan folat reseptör betasını incelemek için kullanılabilir. Bu protokol zaman test edilmiş ve yaygın olarak kullanılmaktadır ve uzun süreli depolama sonra bile, temporal arter dokularında folat reseptör beta özelliklerini keşfetmek için kullanılabilir. Doku kesitleri elde etmek için, parafin gömülü temporal arterlerin dört ila beş mikrometre kalınlığında bölümleri dilim lemek için bir mikrotom kullanın, onlar elde edilir gibi 40 derece santigrat su banyosu her bölümü yüzen, kırışıklıkları kaldırmak için.

Slayt başına üç bölüm yakalamak için cam mikroskop slaytları kullanın ve 60 derecelik bir fırında 60 derece lik bir fırında, Bir ısınma plaka üzerinde slaytlar ısıtın. Bölümler slaytlara yapıştığında, slaytları 24 saat boyunca 37 derecede kurutmak için dikey bir rafa yerleştirin. Ertesi gün, slaytları en az 12 saat boyunca dört santigrat derecede depolamak üzere bir slayt kapsayıcısına aktarın.

Daha sonra, slaytları bir slayt rafına yükleyin ve dokuları her 30 saniyede bir 10 saniyeajla iki beş dakika, %100 ksilen daldırma ve konsantrasyon başına beş dakika, konsantrasyon başına beş dakika ile nemlendirin. %70 etanol daldırma sonra, beş dakika boyunca çift distile suda iki kez slaytlar durulayın, ajitasyon her 30 saniyede 10 saniye. Antijen alımı için, 30 dakika boyunca litre sitrat tampon başına 10 milimolar 95 santigrat derece 200 mikrolitre ile bir cam konteyner içine raf aktarın.

Kuluçka sonunda, beş dakika boyunca akan su ile durulama önce slaytlar oda sıcaklığına 20 dakika soğumasını bekleyin. Endojen peroksidaz aktivitesini ortadan kaldırmak için, ilk olarak her doku örneğinin etrafına bir daire çizmek için hidrofobik bir belirteç kullanın, numuneleri 10 dakika boyunca %3 hidrojen peroksitin 200 mikrolitresinde kuluçkaya yatırmadan önce, ardından 200 micolitre tris-tamponlu salin çözeltisinde 3 yıkama veya yıkama başına TBSS. Son yıkamadan sonra, herhangi bir fazla tampon kaldırmak için hafifçe her slayt dab ve ilgi birincil antikor kokteyl 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında nemli bir odada bir saatlik kuluçka için her slayt için bir kapak kayma.

Kuluçka sonunda, kapak fişleri atın ve taze TBSS üç iki dakikalık yıkayArak slaytlar durulayın. Fazla arabelleği çıkardıktan sonra, uygun bir biyotinylated ikincil antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında nemli odada 45 dakikalık bir kuluçka için her slayt için bir kapak kayma. Kapak fişlerini attıktan sonra, slaytları gösterildiği gibi TBSS ile durulayın.

Fazla arabellek kaldırın. Ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAB substrat tampon 200 mikrolitre ile bölümleri etiketleyin. Kuluçka sonunda, üç dakika hematoksilin ile karşı boyama önce, TBSS ve 10 dakika boyunca musluk suyu çalışan slaytlar yıkayın.

Daha sonra, her slayt için uygun bir montaj ortamı 70 mikrolitre ekleyin ve kapak kayma yerine indirilir gibi kabarcıklar oluşturmayı önlemek için montaj ortamı üzerine yavaş yavaş bir cam kapak şerit ucu. Histopatolojik analiz için, bir ışık mikroskobun sahne üzerine slayt yerleştirin ve ilk doku bölümünün vasküler mimarisini değerlendirmek. Daha sonra, bölüm başına lenfosit sayısına göre makrofaj ların sayısını ölçün.

İmmünohistokimyasal analiz için, her doku bölümündefolat reseptör beta boyama deseni inceleyin ve folat reseptör beta pozitif, CD68 pozitif ve CD3 pozitif hücrelerin sayısını ölçmek 10 rasgele seçilen yüksek güç alanları bölüm başına. Normal örneklerde hematoksilin ve eozin boyama normal arterantomiortaya koymaktadır, tunica intima endotel hücreleri ile, tunica ortamda düz kas hücreleri, ve heterojen kollajen matris, fibroblastlar ve besleyici damarları içeren tunica adventitia vasa vasorum denir. Dev hücreli arterit pozitif temporal arterler şiddetli inflamasyon orta göstermek, agregalar ve makrofajlar ile, veya histiyositler, lenfositler, ara sıra plazma hücreleri, ve çok çekirdekli dev hücreler.

Luminal daralma da belirtilir, ve intimal kalınlaşma ve iç elastik lamina% 90 bozulma eşlik. CD3 pozitif lenfositler ve CD68 pozitif makrofajlar da tüm dev hücreli arterit pozitif örneklerde mevcut olup, tüm biyopsilerde benzer boyama desenleri gözlenmektedir. Folat reseptör beta için boyama makrofajlar ve tercihen adventitve medya lokalize çok çekirdekli dev hücreler ile sınırlıdır.

Özellikle folat reseptör betası toplam makrofajların yaklaşık %30'undan oluşuyordu. Temporal arter biyopsiişleme, kesme ve dewaxing sonraki adımları gerçekleştirmek için dikkatli el becerisi gerektirir. Slayt yorumu deneyimli bir kardiyovasküler patolog uzmanlık gerektirir.

İzleyicilere, numuneleri ve reaktifleri kullanırken eldiven ler ve havalandırmalı başlıklar gibi temas ve solunum önlemleri kullanmalarını hatırlatın.