Name: Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Keşfedin folat reseptör beta makrofaj profillemesini dev hücreli arterit vasküler bağışıklık mikroçevresinde immunohistokimya ve histopatoloji kullanarak. Bu yöntem uzun süre saklanan temporal arter dokularında güvenilir analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Dr. Douglas merdiven, Marianne Klinger, Ann Benko, bölünme, Romatoloji/bölümü tıp ve moleküler ve histopatolojik çekirdek laboratuvar, Penn State Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hershey PA de desteğiyle mümkün yapıldı

Tüm yöntem tanımlamak Penn State kurumsal İnceleme Kurulu tarafından kabul edildi.
1. histopatolojik hazırlık ve Temporal arter biyopsi alma sonra işleme
Not: Temporal arter biyopsisi (sekmesi) lokal anestezi ve steril koşullarda sertifikalı bir cerrah tarafından gerçekleştirilir. Cerrahi olarak 3 cm arteryel kısım daha etkilenen tarafta elde ettikten sonra numune formalin 24 h için hemen sabit, 3-4 mm bölümlere ayrılmış ve parafin blok dokusunun doğru hizalaması dikkatli dikkat, gömülü olan daha sonra oda sıcaklığında depolanır. Örnek seçimi tıbbi kayıtları doğruladıktan sonra gerçekleştirilir. Tanı Amerikan konular 3 5 etki alanlarının yerine getirmek gerektiren Koleji üzerinde Romatoloji 1990 kriterlerinin dayanmaktadır: Yaş > 50 yıl, yeni baş ağrısı, temporal arter hassasiyet, eritrosit sedimentasyon hızı > 50 mm/saat Westergren yöntemi tarafından ve anormal bir sekme. Güvenliğiniz için koruyucu eldiven giymiş her zaman numuneler, kimyasallar ve antikorlar işlerken.
<ol><li>Gömülü bloklardan bir microtome kullanma 4-5 µm kalınlığında bölümlerine kesti. ve hematoksilen eozin (H & E) ile leke. Seçili normal doku denetim bölümünü kalite güvencesi için kullanın.</li>
	<li>Kırışıklıkların kaldırmak ve kaplamalı cam mikroskobik slayt ile almak için 40 ° c sıcak su banyosu bölümlerde kesmek float ısıtmalı.  Cam slaytlar kurutma ve slayt bölümünün bağlılık kolaylaştırmak 60 dakika 60 ° C fırında sıcak bir tabak yerleştirin.</li>
	<li>Cam slaytlar kurutma ve slayt bölümünün bağlılık kolaylaştırmak 60 dakika 60 ° C fırında sıcak bir tabak yerleştirin.</li>
	<li>3 bölümden mikroskop slaytlarda bağlayın.</li>
	<li>Slaytları dikey raf ve 37 ° C'de kuru gece 24 h için yerleştirin.</li>
	<li>Bir konteyner ve mağaza 4 ° C'de slaytlar yeri</li>
</ol>2. immunohistokimyasal hazırlık, mum eritme, antijen alma ve15,18,19,20 boyama
<ol><li>Slaytları bir slayt raf yükleyin. Raf yemekleri ile aşağıdaki gibi çalıştırın: % 100 ksilen nazik ajitasyon her 30 saniyede, bir kez bir kez bir kez 10 saniye ajitasyon ile % 70 etanol içinde 10 saniye ajitasyon ile % 90 etanol içinde 10 saniye ajitasyon ile % 100 etanol 10 saniye ile 5 dakika içinde iki kere , ve iki kez içinde çift distile H2O 10 saniye ajitasyon ile. Not: Ksilen ve aseton taşıma havalandırılmış davlumbaz inhalasyon ve solunum toksisite önlemek için yapılmalıdır.</li>
	<li>Bir cam kaba 10 mmol/L, pH 6,0 sitrat arabellek 95 ° C'ye prewarmed 200 mL ile raf aktararak antijen almak Su banyosunda 30 dakika çekim ayarlayın, sonra oda sıcaklığında 20 dakika sonra 5 dakika boyunca akan su ile durulama için serin.</li>
	<li>Endojen peroksidaz aktivitesi 10 dakika boyunca 200 mL %3 hidrojen peroksit kuluçka tarafından kaldırın. Slaytlar tuzlu çözüm (TBSS) Tris tamponlanmış 200 µL içinde 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Slaytlar rafa kaldırmak ve her birine aşırı arabellek hafifçe silin kurulamak. Boyama için aşağıdaki birincil antikorların 200 µL slaytlarda kapak irsaliyeleri eklemek ve nemli bir odası, oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya ekleyin: 1:800 Anti-FRB antikor seyreltilmiş Monoklonal fare anti-insan CD68, 1: 200 seyreltme Poliklonal tavşan anti-CD3 1: 100 seyreltme Not: Parafin gömülü bölümleri plasenta Formalin sabit Ayrıca adımlar 2,1 2,9 ve anti-FRB18 ile inkübe özetlenen işlenen ve pozitif kontrol olarak kullanılan. Boyama sonuçları en iyi antikor konsantrasyon bularak elde edilmiştir ve çift dilutions (1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600) antikor titrating tarafından gerçekleştirildi.</li>
	<li>Kapak notu kuluçka ve atma sonra kaldırın. TBSS ile her 1 dakika için 3 kez slaytlar durulama, drenaj ve aşırı arabellek silin.</li>
	<li>200 µL çekimsiz birincil antikor bağlı doku antijen ile tepki biotinylated Rabbit/fare ikincil antikor içeren ikincil antikor çözüm ekleyin. Coverslips slaytlar üzerine yerleştirin ve nemli bir odasında 45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Kapak notu kuluçka ve atma sonra kaldırın. TBS ile her 1 dakika için 3 kez slaytlar durulama, drenaj ve aşırı arabellek silin.</li>
	<li>Diaminobenzidine (DAB) + substrat arabellek (Imidazole HCl) 200 µL eklemek-Kromojen sistem ve desen boyama görselleştirmek için 10 dakika için kuluçkaya. TBSS ile sonra 10 dakika için musluk suyu çalışan yıkayın.</li>
	<li>Hematoksilen ile 3 dakika counterstain.</li>
	<li>Slaytları Slayt yüzeye montaj orta 70 µL uygulayarak bağlayın. Yavaş yavaş coverslip üzerine montaj orta uç ve yerine düşürdükçe kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Kuru için 24 saat bekleyin.</li>
</ol>3. histopatolojik ve immunohistokimyasal (IHC) analiz
H & E ve hafif bir mikroskop kullanarak GCA olumlu ve normal konular bölümlerden lekeli IHC inceleyin.
<ol><li>
H & E için bölümler lekeli:
	<ol>
<li>Vasküler mimari değerlendirmek ve tunica intima düz kas hücrelerinde tunica medya ve fibroblast ve vasa vasorum tunica adventitia21,22endotel hücrelerine tanımlar.</li>
		<li>Lenfosit, makrofaj/histiocyte infiltrasyon, hücresel hiperplazi ve iç elastik lamina bozulması içermektedir GCA özellikleri tanımlayın.</li>
		<li>Belirlenmesi ve makrofajlar göre lenfosit sayısı miktarının lymphohistiocytic infiltrat analiz. İç elastik lamina bozulma ve yerleşik hücre hyperplastic değişiklikler değerlendirmek ve kontrolleri ile karşılaştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bölümler lekeli IHC için:
	<ol>
<li>FRB toplam bağışıklık infiltrat, toplam makrofaj marker, anti-CD68 ve pan onun ifade belirli bir tip veya hücreleri ve vasküler katmanları ve ilişki içinde dağıtım türleri tarafından not alma, boyama desen incelemek lenfosit marker CD3 anti.</li>
		<li>Ifade FRB, CD68 ve CD3 hücre 10 olumlu lekeli hücreleri sayarak birden fazla rasgele seçilen yüksek güç alanı (hpf) ölçmek ve kayıt anlamına gelir. Not: Bu normal ve patolojik hücre ve yapıları sertifikalı kardiyovasküler patolog (J.M.) tarafından gerçekleştirilen ve romatolog (S.A.A.) ve sonuçları tüm durumlar için kaydedildi.</li>
		<li>Bir dijital kamera ile temsilcisi çekim. Not: Bu adımlardan sonra aliquots kalan-80 ° C'de depolanmış olabilir</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlippel%2C+JH+%22Primer+on+the+rheumatic+diseases%22">Primer on the rheumatic diseases</a>. , Springer Science & Business Media. (2008).</li>
<li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li>
<li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis%3A+diagnostic+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li>
<li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li>
<li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis%3A+an+individual+patient+data+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li>
<li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li>
<li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li>
<li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63(2017).</li>
<li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li>
<li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+folate+receptor%3A+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li>
<li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li>
<li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory%2Fregulatory+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li>
<li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li>
<li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li>
<li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters%3A+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pteridines%22%5BJournal%5D)">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li>
<li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li>
<li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li>
<li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawlina%2C+W+%22Histology%3A+A+text+and+atlas+with+correlated+cell+and+molecular+biology%22">Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology</a>. , Walters Kluwer. (2016).</li>
<li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Robbins+and+Cotran+pathologic+basis+of+disease%22">Robbins and Cotran pathologic basis of disease</a>. , Elsevier Saunders. (2015).</li>
<li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabbs%2C+DJ+%22Diagnostic+immunohistochemistry%22">Diagnostic immunohistochemistry</a>. , Elsevier, Inc. (2019).</li>
<li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li>
<li>Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolzapfel%2C+GA+%22Collagen.+Structure+and+Mechanics%22">Collagen. Structure and Mechanics</a>. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).</li>
<li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

GCA erişkinlerde en sık görülen vaskülit ve onun patolojik hallmark T helper lenfositler güçlü bir kombinasyon örneğidir ve ayrıca diğer granülomatöz hastalıkların ya da sarkoidoz gibi vasculopathies bulunabilir makrofajlar aktif ve granülomatöz polyangiitis2,3. GCA, temporal arter orta-büyük ölçekli arter iyi bir gösterimini sağlar ve böylece ortaya çıkan tanı rolleri çalışma için fırsatlar yaratmak için yıl, parafin blok içinde saklanabilir büyükçe bir örnek TA...

Dev hücreli arterit (GCA) orta büyük arter, aorta ve dalları hedefleme ve eski yetişkin etkileyen iltihabi bir hastalıktır. Hafif baş ağrısı, çene ağrısı, görme kaybı, kontur ve doku kangren gibi ağır iskemik komplikasyonlara sunar. Tanı eritrosit sedimantasyon hızı (ESR) ve farklı bir histopatolojik desen temporal arter biyopsisi (sekmesi)1gibi yüksek inflamatuar işaretleri tarafından onaylanır. GCA en yaygın yetişkin vaskülit ve tanı için elde edilen temporal arter erişilebilirliğini böylece bir daha kolay onun patogenezi okumaya etkinleştirme diğer vasculopathies üzerinde bir avantaj sunuyor. Tipik bulguları sekmesinde bir infiltrat makrofajlar/histiyosit ve normalde bunlar ayıran elastik lamina eşzamanlı imha ile tunica intima, medya ve adventitia tüm vasküler katmanları arasında bulunan T lenfosit içerir bölmeleri2. Geçerli kanıt GCA vasküler adventitia dendritik hücrelerde etkinleştirir bilinmeyen bir antijen içerdiğini gösterir, yardımcı işe alma tarafından takip T (Th) hücreleri, hangi interlökin-17 salgılar özellikle Th1 ve Th17 alt türlerini ve interferon-gamma (IFG) anılan sıraya göre. IFG sonra acemi ve makrofajlar sitokinler ve proteaz üretmek için etkinleştirir. Bunlar pro-inflamatuar sitokinlerin karşılıklı Th1 hücre böylece pozitif geribesleme sağlamak etkinleştirir IL-12 de dahil olmak üzere; tümör nekroz faktör ve interlökin-6, artrit ve ateş ve metalloproteases neden elastik lamina zarar verebilir. Standart kronik tedavi oluşturan sebepler (GC), kısmen Th17/IL-17 ama değil Th1/bag kol bağışıklık yanıtı3,4inceltiyorum sitokin yolları kontrol. Ne yazık ki, GC kesilmesi hastalığın nüks içinde sonuçlanır. Alternatif bir yöntem olarak metotreksat GCA tedavisinde repurposed ama daha duyarlı biyolojik tedavi izleme5için,6 kullanılmıştır değil, ancak istenen klinik bitiş noktaları sürekli olarak elde edildi değil . Hastalık kontrol ve steroid etkileri7,8tutumlu etkili bir şekilde gösterildiği gibi 2017 yılında, interlökin 6 kütük parçası, tocilizumab, GCA tedavisi için onaylanmıştır.
Bugüne kadar hiçbir iyi biyolojik GCA için vardır. Sonuç olarak, hastalık etkinliğini izlemek ve yan etkileri önlemek ve topluma maliyet yükü azaltmak için kullanılabilir uyuşturucu doz titre zordur. Böylece, bir aday biyomarker hastalık aktivitesi ile ilişkilendirir sağlamak yeni anlayışlar patogenez ve tedavi edici kararlar yardım aramak için zorunludur.
Makrofaj harekete geçirmek bozukluk GCA patogenezinde önemli bir faktördür. Böylece, GCA tedavi için etkili bir yol aktif makrofajlar seçici hedefleme olabilir. Folat reseptör beta (FRB) hücre membran üzerinde bağlantılı bir glikosil-phosphatidylinositol glikoprotein ifade normal myelomonocytic hücrelerde, myeloid lösemi hücreleri ve makrofajlar harekete geçirmek olduğunu. Onun ligand, folik asit, hücresel DNA sentezi, metilasyonu ve onarım9sağlar onun azaltılmış formundaki gerekli bir vitamindir. FRB ifade otoimmün hastalığı ve karsinojenezis sırasında indüklenen. İfadesini solid organ ve myeloid maligniteler10,11,12 monosit veya pro-inflamatuar M1 makrofajlar Romatoid Artritte yüzeyine veya anti-inflamatuar M2 makrofajlar sınırlıdır , 13. bir biyomarker aktif makrofajlar gibi potansiyel rolüne ek olarak, FRB seçici uyuşturucu taşıma başlatmak için folik asit, antifolates veya folat Birleşik ilaçlar hücre reseptör bağlama ile bir çok adımlı işlem aracılığıyla etkinleştirebilirsiniz yüzey, ardından içselleştirilmesi, yayın ve istenen uyuşturucu nihai teslimat iç hücre makine12,14,15,16. Aksine FRB kanser hücrelerinde ifade ve makrofajlar aktif, normal hematopoetik hücrelerin içinde ifade FRB böylece FRB/folat-aracılı ilaç dağıtım FRB pozitif enflamatuar veya kanser hücrelerinin sınırlıdır sağlanması folates bağlamak yapamaz.
Bizim önceki çalışmada FRB GCA makrofajlar içinde ifade edilir ilk kez gösterdi ve ifadesini CD68 + ve endotelin reseptör beta makrofajlar, GCA Patogenez17' ye katkıda korelasyon. Bu raporda, tarif biz histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri FRB makrofaj değerlendirmek için kullanılan ve toplam lenfosit analiz ve makrofaj GCA vasküler manzara FRB'ın bulunduğu bir anlayış kazanmak için sayar.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Reichert-Jung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>düz ve buzlu mikroskop lamları ve lamel</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dikey raf</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Olympus BX60&nbsp; mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aseton damıtılmış su</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonlarında %100, %90, %70</td></tr> <tr><td>Tris tamponlu tuzlu su çözeltisi (TBS)&nbsp;</td><td>Dako Yıkama Tamponu S3006</td><td></td><td></td></tr> TBS <tr><td></td><td></td> Diaminobenzidin (DAB) Sigma Hızlı Tablet setinde <td></td><td></td></tr><tr><td>%3 hidrojen peroksit</td> Kimyasal Montaj&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SP-15-100</td><td></td></tr><tr><td>Harleco Gill's III Hematoksilen</td><td>Fiisher Scientific 23-750-019</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harleco Eosin Y% 1 Alkollü Stok Çözeltisi</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>23-749-977</td><td></td></tr><tr><td>10 mM sitrik asit monohidrat (pH 6.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal tavşan anti-folat reseptörü beta&nbsp;</td><td>Manohar Ratnam</td><td></td><td>1:800'de optimize edildi</td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-insan CD68</td><td>Dako&nbsp;</td><td>M071801</td><td>1:200'de optimize edilmiştir</td></tr><tr><td>Poliklonal tavşan anti-CD3</td><td>Agilent Dako</td><td>A0452</td>, <td>1:100'de optimize edilmiştir</td></tr><tr><td>Polimer keçi anti-tavşan/fare ikincil antikoru</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasental doku</td><td></td><td></td><td>&nbsp; FRB pozitif kontrol için</td></tr></tbody></table>

folat reseptör beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık microenvironment profil için bir immunohistopathologic çalışma

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Dev hücreli arterit (GCA) büyük yetişkin etkileyen kronik immün aracılı orta-büyük ölçekli arterlerin bir hastalıktır. GCA bildirimleri artrit ve tıkayıcı belirtiler baş ağrısı, kontur veya vizyon kaybı. Makrofajlar ve T-helper lenfositler vasküler duvar sızmak ve gemi hasar ve iskemi neden bir pro-inflamatuar yanıt üretmek. Bugüne kadar hastalık aktivite ve Kılavuzu terapötik yanıt izleyebilirsiniz hiçbir GCA biyomarker olduğunu.
Folat reseptör beta (FRB) hücre zarı üzerinde bağlantılı ve normalde myelomonocytic soy ve myeloid lösemi hücreleri de tümör ve romatoid sinovyal makrofajlar gibi çoğunluğu ifade bir glycosylphosphatidylinositol proteindir, nerede ifadesini hastalık şiddeti ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. FRB folat bileşikleri, folik asit conjugates ve antifolate ilaçlar bağlama yeteneği o kanser ve inflamatuar hastalıkları araştırma druggable bir hedef yaptı. Bu rapor ifade ve GCAimmunopathology ile ilgili olarak FRB dağılımı değerlendirmek için kullanılan histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri açıklar.
Formalin sabit ve parafin gömülü temporal arter biyopsisi GCA ve normal denetimlerin Hematoksilen ve eozin ile doku histolojisi gözden geçirin ve patognomonik olan özellikleri bulmak için lekeli. İmmünhistokimya FRB, CD68 ve CD3 ifade algılamak için kullanıldı. Mikroskopik analiz 10 seçilen yüksek power alanlı bölümler ve ilgili konumlarını arteryel duvardaki olumlu lekeli hücre sayısı ölçmek için gerçekleştirildi.
İntimal hiperplazi tarafından Lymphohistiocytic (LH) inflamasyon eşlik ve kesintiye elastik lamina GCA içinde yok denetimlerde bulunamadı ile görüldü. LH infiltrat yaklaşık % 60 lenfositler ve % 40 makrofajlar oluşmaktadır. FRB ifade toplam CD68 + makrofaj nüfusunun % 31'i oluşan ve medya ve adventitia için yerelleştirilmiş makrofajlar, sınırlı. Hiçbir FRB denetimlerde görüldü.
Bu iletişim kuralı FRB makrofaj vasküler bağışıklık microenvironment GCA içinde göre farklı sayısal ve kayma örnek gösterdi.

Histopatolojik bulgular
H &amp; E normal örnekler gösterdi normal damar anatomi içinde tunica intima, düz kas hücreleri tunica ortamda, endotel hücreleri ile lekeleri ve fibroblast ve besleyici damarları içeren bir hànzú kollajen matris vasa vasorum denilen tunica adventitia. Tanımlanan hiçbir enflamatuar infiltrat vardır. GCA olumlu temporal arter orta şiddetli inflamasyon Toplamları makrofajlar/histiyosit, len...

Protokol histopatolojik tetkik ve folat reseptör beta makrofaj ve toplam bağışıklık hücre ilişki içinde dev hücreli arterit temporal arter biyopsisi sızmak profiline immünhistokimya kullanımını göstermektedir.

Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Bu immünohistokimyasal ve histopatolojik protokol dev hücreli arteritvasküler mikroortama potansiyel prognostik ve terapötik değeri olan bir aday protein olan folat reseptör betasını incelemek için kullanılabilir. Bu protokol zaman test edilmiş ve yaygın olarak kullanılmaktadır ve uzun süreli depolama sonra bile, temporal arter dokularında folat reseptör beta özelliklerini keşfetmek için kullanılabilir. Doku kesitleri elde etmek için, parafin gömülü temporal arterlerin dört ila beş mikrometre kalınlığında bölümleri dilim lemek için bir mikrotom kullanın, onlar elde edilir gibi 40 derece santigrat su banyosu her bölümü yüzen, kırışıklıkları kaldırmak için.Slayt başına üç bölüm yakalamak için cam mikroskop slaytları kullanın ve 60 derecelik bir fırında 60 derece lik bir fırında, Bir ısınma plaka üzerinde slaytlar ısıtın. Bölümler slaytlara yapıştığında, slaytları 24 saat boyunca 37 derecede kurutmak için dikey bir rafa yerleştirin. Ertesi gün, slaytları en az 12 saat boyunca dört santigrat derecede depolamak üzere bir slayt kapsayıcısına aktarın.Daha sonra, slaytları bir slayt rafına yükleyin ve dokuları her 30 saniyede bir 10 saniyeajla iki beş dakika, %100 ksilen daldırma ve konsantrasyon başına beş dakika, konsantrasyon başına beş dakika ile nemlendirin. %70 etanol daldırma sonra, beş dakika boyunca çift distile suda iki kez slaytlar durulayın, ajitasyon her 30 saniyede 10 saniye. Antijen alımı için, 30 dakika boyunca litre sitrat tampon başına 10 milimolar 95 santigrat derece 200 mikrolitre ile bir cam konteyner içine raf aktarın.Kuluçka sonunda, beş dakika boyunca akan su ile durulama önce slaytlar oda sıcaklığına 20 dakika soğumasını bekleyin. Endojen peroksidaz aktivitesini ortadan kaldırmak için, ilk olarak her doku örneğinin etrafına bir daire çizmek için hidrofobik bir belirteç kullanın, numuneleri 10 dakika boyunca %3 hidrojen peroksitin 200 mikrolitresinde kuluçkaya yatırmadan önce, ardından 200 micolitre tris-tamponlu salin çözeltisinde 3 yıkama veya yıkama başına TBSS. Son yıkamadan sonra, herhangi bir fazla tampon kaldırmak için hafifçe her slayt dab ve ilgi birincil antikor kokteyl 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında nemli bir odada bir saatlik kuluçka için her slayt için bir kapak kayma.Kuluçka sonunda, kapak fişleri atın ve taze TBSS üç iki dakikalık yıkayArak slaytlar durulayın. Fazla arabelleği çıkardıktan sonra, uygun bir biyotinylated ikincil antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında nemli odada 45 dakikalık bir kuluçka için her slayt için bir kapak kayma. Kapak fişlerini attıktan sonra, slaytları gösterildiği gibi TBSS ile durulayın.Fazla arabellek kaldırın. Ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAB substrat tampon 200 mikrolitre ile bölümleri etiketleyin. Kuluçka sonunda, üç dakika hematoksilin ile karşı boyama önce, TBSS ve 10 dakika boyunca musluk suyu çalışan slaytlar yıkayın.Daha sonra, her slayt için uygun bir montaj ortamı 70 mikrolitre ekleyin ve kapak kayma yerine indirilir gibi kabarcıklar oluşturmayı önlemek için montaj ortamı üzerine yavaş yavaş bir cam kapak şerit ucu. Histopatolojik analiz için, bir ışık mikroskobun sahne üzerine slayt yerleştirin ve ilk doku bölümünün vasküler mimarisini değerlendirmek. Daha sonra, bölüm başına lenfosit sayısına göre makrofaj ların sayısını ölçün.İmmünohistokimyasal analiz için, her doku bölümündefolat reseptör beta boyama deseni inceleyin ve folat reseptör beta pozitif, CD68 pozitif ve CD3 pozitif hücrelerin sayısını ölçmek 10 rasgele seçilen yüksek güç alanları bölüm başına. Normal örneklerde hematoksilin ve eozin boyama normal arterantomiortaya koymaktadır, tunica intima endotel hücreleri ile, tunica ortamda düz kas hücreleri, ve heterojen kollajen matris, fibroblastlar ve besleyici damarları içeren tunica adventitia vasa vasorum denir. Dev hücreli arterit pozitif temporal arterler şiddetli inflamasyon orta göstermek, agregalar ve makrofajlar ile, veya histiyositler, lenfositler, ara sıra plazma hücreleri, ve çok çekirdekli dev hücreler.Luminal daralma da belirtilir, ve intimal kalınlaşma ve iç elastik lamina% 90 bozulma eşlik. CD3 pozitif lenfositler ve CD68 pozitif makrofajlar da tüm dev hücreli arterit pozitif örneklerde mevcut olup, tüm biyopsilerde benzer boyama desenleri gözlenmektedir. Folat reseptör beta için boyama makrofajlar ve tercihen adventitve medya lokalize çok çekirdekli dev hücreler ile sınırlıdır.Özellikle folat reseptör betası toplam makrofajların yaklaşık %30'undan oluşuyordu. Temporal arter biyopsiişleme, kesme ve dewaxing sonraki adımları gerçekleştirmek için dikkatli el becerisi gerektirir. Slayt yorumu deneyimli bir kardiyovasküler patolog uzmanlık gerektirir.İzleyicilere, numuneleri ve reaktifleri kullanırken eldiven ler ve havalandırmalı başlıklar gibi temas ve solunum önlemleri kullanmalarını hatırlatın.

an-immunohistopathologic-study-to-profile-folate-receptor-beta

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, temporal arter biyopsisinde toplam sızmış bağışıklık hücresi popülasyonları arasındaki makrofajların nispi oranını ölçmek için bir tekniği göstermektedir. Otoimmün hastalıktan etkilenen bir doku bölümünün immünohistokimyasal boyanması, bağışıklık hücrelerini diğer hücrelerden görsel olarak ayırt etmek için spesifik reseptörlerle seçici olarak boyar.

Makrofajlar ve sızmış bağışıklık hücreleri arasındaki ilişkiyi incelemek için immünohistokimya

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir...

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Hedef özgü probları protein ifade çeşitli hastalık (Örneğin, iltihap, enfeksiyon ve tumorigenesis) gibi moleküler mekanizmaları analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Bu çalışmada, bağırsak makrofaj infiltrasyonu F4/80 özel tomografi Floresans aracılı kullanarak kolit, fare modeli üç boyutlu bir nicel tomografik değerlendirilmesi açıklar.

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Bu makalede, makrofajlar çekmek için tümör hücrelerinden şartlık orta yeteneğini değerlendirmek için yararlı bir in vitro tahlil temsil eder.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Bu çalışma, sinovyal makrofajları ve fibroblastları murin inflamatuar artrit dokusundan izole etmek için modifiye edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

İnsan CART ve miyeloid hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için mevcut olan sınırlı ksenogreft modelleri göz önüne alındığında, insan makrofajlarının CART hücreleri üzerindeki etkilerini anlamak için in vitro ve in vivo modeller oluşturduk. Bulgular, tümör mikroçevresindeki makrofaj rollerini değerlendirmek ve makrofaj hedefli immünoterapileri test etmek için potansiyel olarak genelleştirilebilir.

Miyeloid Hücreler ve CAR T Hücreleri Arasındaki Etkileşimlerin İn Vitro ve İn Vivo Olarak İncelenmesi

Keşfedin folat reseptör beta makrofaj profillemesini dev hücreli arterit vasküler bağışıklık mikroçevresinde immunohistokimya ve histopatoloji kullanarak. Bu yöntem uzun süre saklanan temporal arter dokularında güvenilir analiz sağlar.

Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma (Video) | JoVE Journal

Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma

Daha fazla video keşfet