Name: Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin, insan makrofajlarının düşük oksijen ortamındaki polarizasyon proteomik analizini. Etiketsiz kantifikasyon yöntemiyle protein ifadesi değişikliklerini karakterize edin ve immünoloji araştırmalarına katkı sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AM genç grup lideri programıyla (CD'ye atıp/Avenir INSERM-CNRS), la Ligue Nationale contre le kanser ve la Fondation ARC pour la recherche sur le kanser tarafından finanse edilmektedir. Kütle spektrometresi biyoloji platformu (UTECHS MSBIO, Pasteur Enstitüsü, Paris) için gelen Mariette Matondo teşekkür ediyoruz. Lauren Anderson el yazması onun okuma için teşekkür ederiz.

İnsan kanı örnekleri (LRSC) sağlıklı, de-tanımlanan bağışçılardan EFS (Fransız Ulusal kan servisi) protokolünün bir parçası olarak bir yetkili (CODECOH DC-2018-3114) elde edilmiştir. Bağış kan kullanım için imzalanmış izin verdi.
1. kitle iletişim araçları ve arabellek hazırlık
<ol><li>Makrofaj orta [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)] hazırlamak ve 37 ° c sıcak</li>
	<li>Hazırlamak makrofaj orta + AB plazma (SAB) üzerinden % 10 insan serumu (0,22 µm filtre) filtre sonra 37 ° C sıcak (sevk makrofaj orta + % 10 SAB bundan sonra).</li>
	<li>Sıralama arabellek [1 fosfat tamponlu tuz (PBS) + %0.5 Sığır serum albumin (BSA) + 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) x] hazırlamak, (0,22 µm filtre) filtre ve 4 ° C'de korumak</li>
</ol>2. izolasyon periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) Leukoreduction sistem odası (LRSC)
<ol><li>Yoğunluk gradient hücre ayrılık çözümü 15 mL koymak ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL aralıklarla tüp LRSC almadan önce oda sıcaklığına (RT) sıcak olabilir bu yüzden. Not: Yoğunluk sıcaklığına bağlıdır. Bu ürün 4 ° C'de saklandığı şekliyle, RT için equilibrate bu yüzden bu adımı önceden yapılmalıdır</li>
	<li>LRSC 50 mL aralıklarla tüp içine boş ilâ 50 mL 1 x PBS ekleyip karıştırın. Çok yavaş, 25 mL. yoğunluk gradient çözüm adımı sırasında 2.1 ısıtılan 15 mL üstüne adımı 2.2 hazırlanan karışımı ekleyin. Not: Bu adımı aşamalarında karıştırmak değil dikkatli olun. Kan yoğunluk gradient çözüm bu aşamada herhangi bir rahatsızlık olmadan eklenmesi gerekir.</li>
	<li>Her iki Santrifüjü tüpler için 700 x g olmadan sonları itibariyle 25 dk santrifüj kapasitesi. Not: yoğunluk gradient Santrifüjü sonunda alt katmanlardan dön vardır: eritrositler ve granülosit şekillendirme Pelet, yoğunluk gradient çözüm aşaması, PBMCs ve plazma tabakası.</li>
	<li>Bir damlalıklı ile aspirating olmadan plazma faz üzerinden geçmek ve PBMC katman yeni bir 50 mL aralıklarla tüp içine toplamak. İlâ 50 mL 1 x PBS PBMCs çamaşır adım ve 300 x g, 10 dk santrifüj olarak ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve Pelet 40 mL makrofaj orta resuspend.</li>
</ol>3. manyetik etiketleme ve CD14 yalıtım+ hücreleri (monosit)
<ol><li>Malassez odasında PBMCs saymak. PBMCs (genellikle 100 ile 300 x 106 hücreler) deney için gerekli miktarda çekmek, bir Santrifüjü tüp ve 300 x g, 10 dk santrifüj yerleştirebilirsiniz.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve içinde adım 10 1.3 sırasında hazırlanan sıralama arabelleği 80 µL Pelet resuspend7 PBMCs. Ekle 20 µL CD14 lastikteki başına 10,7 PBMCs. Mix iyi ve sürekli ajitasyon altında 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
	<li>Bir çamaşır adım ve 300 x g., 10 dk santrifüj süpernatant Aspire edin ve 108 PBMCs başına arabellek sıralama 500 µL Pelet resuspend gibi 107 PBMCs başına arabellek sıralama, 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Bir sütun ayırıcı manyetik alana yerleştirin. Sütun arabellek sıralama 3 mL ile durulama tarafından hazırlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon sütuna uygulanır. Sütun hücreleri izole olmak sayısına bağlıdır (burada, LS sütunlar için en çok 109 PBMCs kullanılır). Akışı aracılığıyla içeren etiketlenmemiş hücreleri toplamak. Not: Bu adımda itibaren tüm tüpler (negatif ve pozitif seçimleri) daha sonra farklı adımları kontrol etmek için akış sitometresi tarafından tutulur.</li>
	<li>Sütun 3 x 3 mL arabellek sıralama ile yıkayın. Etiketlenmemiş hücreleri aynı tüpten 3.12 adımından geçen toplamak. Çamaşır adımları ekleme sıralama arabellek, köşeni kuru değil dikkatli olun. Bir koleksiyon tüp sütununun altında yerleştirin ve ayırıcıyı kaldırmak.</li>
	<li>Arabellek sütuna sıralama 5 mL pipet. Hemen manyetik olarak etiketli hücreleri sıkıca sütuna pistonu iterek sifonu çek. CD14 saflığı artırmak için+ hücreleri, eluted kesir ikinci bir sütun üzerinde zenginleştirilmiş.</li>
	<li>Yeni bir sütun ile 3.4-3.7 adımları yineleyin.</li>
</ol>4. monosit kaplama
<ol><li>Monosit Malassez odasında say. CD14 saflığı kontrol+ hücreleri akış sitometresi tarafından. Monosit deney için gerekli miktarda çekmek ve Santrifüjü tüpte koyun.</li>
	<li>300 x g. aspiratı süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi ve monosit Pelet makrofaj ortamda resuspend. Hücreleri plaka ve SAB + 25 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşma ikna etmek için 50 dk 1 h. için orta Aspire edin ve eski yerine koymak o ile makrofaj orta + % 10 yerleşmek izin.</li>
</ol>5. makrofajlar gün 6 polarizasyon
<ol><li>Orta Aspire edin. Eski yerine koymak o makrofaj orta + % 10 ile SAB çeşitli uyaranlara ile. Örneğin, 10 ng/mL interferon Gama (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS M1 polarizasyon, elde etmek için) ya da 20 ng/mL interlökin 4 (IL4) + 20 ng/mL interlökin 13 (IL13) M2 polarizasyon için ekleyin. Not: 24 ve 48 s diğer testlere devam etmeden önce arasındaki uyarımı gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Ayırmayı bir çözüm ya da bir hücre kazıyıcı kullanarak hücre hasat.</li>
</ol>6. hücre kültürü düşük oksijen koşullar altında
<ol><li>Adım 4 den başlayarak, monosit ve makrofajlar hipoksik durum analizi yapmak için bir oksijen kontrollü ortamda korumak. Bir hipoksi çalışma istasyonu deneme sırasında istenen oksijen kısmi basınç altında hücreleri korumak için kullanın. Not: düşük oksijen basınç altında çalışırken, bu tüm medya ve çamaşır arabellekleri istasyonunun altındaki hazırlamak ve yeterince sıvı doğru kısmi basınç elde etmek için beklemek önemlidir. Örneğin, PBS 10 mL 60 mm Petri kabına O2 kısmi basıncı atmosferik baskılardan (Biz bir fiber optik oksijen sensör kullanarak ölçülen var gibi) başlangıç için 25 mmHg ulaşmak için yaklaşık 2 saat gerektirir. Birçok hipoksik istasyonları veya İnkübatörler, oksijen basıncı atmosferik basınç yüzdesi olarak ayarlanır. Kesin ölçüler gerekliyse, doğrudan oksijen basıncı mmHg ayarlamak için yetki veren bir istasyonu kullanmak daha iyidir.</li>
</ol>7. lizis ve jel sindirim (protokolü 1)
Not: Bu ve aşağıdaki bölümlerde, peptidler elde etmek ve LC-MS/MS çözümlemesi için kullanılan iki protokol anlatılmıştır. Protokol 1 hücre lizis ve jel ayırma ve sindirim ve çözüm hücre lizis ardından çözüm sindirim ve isoelectric bir odaklama yöntemini kullanarak Ayırma Protokolü 2 açıklar.
<ol><li>Hücre lizis Laemmli arabellek [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), %7.5 SDS, % 37 gliserol, %33,3 (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol mavi % 0,2 w/v] gerçekleştirin. 4-%12 BIS-Tris akrilamid jeller her örnek için 300.000 hücrelerin protein eşdeğer yükleyin.</li>
	<li>Şekil 3' te olarak 6 jel bantları bölünecek Her protein örnek izin vermek için elektroforetik geçiş süresini kontrol eder.</li>
	<li>Jel tespit bir çözüm (% 30 etanol + 20 dk için % 7,5 asetik asit) ile düzeltmek, sonra boyama çözüm (R-250 Coomassie 45 dk için mavi) ekleyin. Destaining çözüm (% 30 etanol + % 7.5 bant görününceye kadar asetik) ekleyin temiz bir neşter ile protein bantları bilincin önce.</li>
	<li>Giriş önce çıkarılan her grup 500 µL tüplerde zar. Temiz cam yüzey (%5 SDS Çözüm deiyonize su yüzeyleri temizlemek için kullanılabilir) keratins ile kirlenmesini önlemek için garanti kapsamındadır.</li>
	<li>Jel dilimler 3 kez 25 mM Amonyum Bikarbonat 25 mM Amonyum Bikarbonat ve Asetonitril (% 50 v/v) bir yıkama ardından 37 ° C'de 20 dk için 200 µL yıkayın. % 100 Asetonitril 10 min için jel adet 200 µL ile kurutmak.</li>
	<li>10 mM 35 dk. RT., karanlıkta için 25 mM Amonyum Bikarbonat (200 µL) 55 mM iodoacetamide ardından DTT (dithiothreitol) 25 mM Amonyum Bikarbonat 56 ° c (200 µL), 45 dk içinde her jel parçasıyla kuluçkaya</li>
	<li>Alkillenme durdurmak için 10 mM DTT 25 mM Amonyum Bikarbonat 10 dakika dik yıkama her jel parçası 200 µL ile 200 µL jel parçaları 25 mM Amonyum Bikarbonat kuluçkaya sonra 200 µL % 100 Asetonitril 10 dk ile kurutmak.</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de üretici yönergelerine göre tripsin/Lys-C karışımı ile protein sindirimi.</li>
	<li>Jel parçalardan % 50 Asetonitril 15 dk sonra 50 μL %5 formik asit 15 dakika için 50 μL ve son olarak, 50 μL % 100 Asetonitril 15 dk. havuzu ekleyerek elde edilen peptidler ayıklamak ve her kesir peptidler adsorpsiyon sınırlamak için düşük-emme tüpler kuru ve örnek kaybı. -80 ° C'de örnekleri daha fazla analiz kadar saklayın.</li>
</ol>8. protein çıkarma ve çözüm sindirim (2 iletişim kuralı)
<ol><li>Hücre lizis (2 x 106 hücreler) aşağıdaki lizis arabellek 150 µL ile gerçekleştirin:<ol>
<li>7 M üre, 2 M Tioüre, 40 mM Tris ve % 4 çocuklar, proteaz inhibitörleri (tam mini, proteaz inhibitörü kokteyl EDTA içermeyen) ile desteklenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT 30 min bir thermoshaker ile için çözümler lunaparkçı. 13,800 x g 20 dk RT için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant tutun.</li>
	<li>2D bir temizlik kiti ile kirleticiler kaldırın:<ol>
<li>Kit precipitant çözüm, eş precipitant çözüm, yıkama arabellek ve yıkama katkı sağlar.</li>
		<li>Precipitant çözümün 300 µL ekleyin ve iyice karıştırın. 15 dk. eklemek 300 µL Co precipitant çözüm için buz üzerinde kuluçkaya. Borular 12,000 x g 5 min için de (en az) santrifüj kapasitesi. Küçük bir Pelet görünür olmalıdır. Hızla resuspension veya pelet dağılım önlemek için sonraki adıma geçin. Süpernatant Pelet bozmadan kaldırın.</li>
		<li>Tüplerini tekrar cap-menteşe ve Pelet dışa tüpün dibinde kalan herhangi bir sıvı getirmek için karşı karşıya santrifüj kapasitesi. Kısa darbe yeterli olur. Görünür hiçbir sıvı tüplerde kalan olmalıdır.</li>
		<li>Pelet bozmadan, 40 µL Co precipitant çözüm ekleyin. Tüp buz 5 dakika santrifüj 5 dakika süreyle oturup sonra kaldırmak ve yıkama atmak izin. 25 µL de-iyonize su ekleyin. Girdap her 5-10 s için tüp. Pelet dağıtmak ama suda çözülür değil.</li>
		<li>1 mL (en az 1 h-20 ° c için önceden soğutulmuş) yıkama arabelleği ve yıkama katkı 5 µL ekleyin. Pelet tümüyle dağıldı kadar girdap. Tüpler-20 ° c en az 30 dk. girdap 20-30 s her 10 min için kuluçkaya Not: Tüpler-20 ° C ilâ 1 hafta en az protein yıkımı veya değişiklik ile saklanır.</li>
		<li>5 dk. dikkatle kaldırmak ve süpernatant için tüpler (en az) de 12.000 × g santrifüj kapasitesi. Beyaz bir Pelet görünür olmalıdır. (Pelet çok kuru, resuspend zor olacak ise) Pelet en fazla 5 min için airdry için izin verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein Pelet 8 M üre ve 0.1 M Amonyum Bikarbonat 300 µL içinde resuspend. 1 dk. için güçlü girdap kolorimetrik bir tahlil kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek.</li>
</ol>9.-çözüm sindirim (2 iletişim kuralı)
<ol><li>700 mM DTT sulu çözüm 5.1 µL ekleyerek disülfür köprü azaltmak (son konsantrasyonu 12.5 mM) 8.4 resuspended proteinler adım ve bir thermoshaker ile 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Sistein kalıntıları 700 mM iodoacetamide sulu çözüm 20,3 µL ekleyerek alkylate (son konsantrasyonu 40 mM) ve 25 ° c 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık ile bir thermoshaker için kuluçka.</li>
	<li>0.1 M Amonyum Bikarbonat 990 µL örnek için ekleyin. Tripsin/Lys-C Mix (enzim: substrat oranı 1: 100 w/w) karşılık gelen bir birim eklemek. Gecede bir thermoshaker ile 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>10. temizlik kartuş (2 iletişim kuralı)
<ol><li>Bir kartuşu 1 sütun-hacmi (1 mL) metanol ile ıslak. Kartuş ile 1 sütun-hacmi (1 mL) % 80 Asetonitril/HPLC-grade su temiz ve akışı aracılığıyla atın. Kartuş 4 sütun-cilt (4 mL) %0.1 formik asit/HPLC-grade su ile equilibrate ve akışı aracılığıyla atın.</li>
	<li>Örnekleri 90 µL % 10 formik asit veya pH 2-3 (pH pH göstergesi ile kontrol edin) su ile acidify. Acidified örnekleri yüklemek ve akışı aracılığıyla toplamak. (Değil muhafaza peptidler içeren) aracılığıyla akış-yeniden yükleyin. Kartuş 6 sütun-hacmi (6 mL) %0.1 formik asit/HPLC-grade su ile yıkayın.</li>
	<li>1 sütun-birimleri (1 mL) kartuşla üzerinden peptidler %0,1 formik acid/50% Asetonitril/HPLC-grade su elute. 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Vakum yoğunlaştırıcı (150 x g, vakum 160 mBar) kullanarak örnek konsantre.</li>
</ol>11. ayırma (protokol 2) Isoelectric odaklanarak
Not: Peptidler 10 3 pH aralığı kapsayan bir 13 cm şerit üzerinde bir jel fractionator kullanarak kendi isoelectric noktalarına göre ayrılır. Biz (aşağıda özetlenmiştir) Tedarikçi tarafından sağlanan aşağıdaki iletişim kuralı kullanılır:
<ol><li>Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: çözüm (600 µL) gliserol çözüm, 60 µL OFFGEL arabelleği, 4.34 mL Ultrasaf Su ve çözüm B (çözüm a 1.776 mL) ve 444 µL Ultrasaf Su.</li>
	<li>IPG şeritler, çerçeve ve elektrotlar üreticinin talimatlarına göre bir araya getirin.</li>
	<li>Örnek çözüm d. 40 eklemek µL çözüm B her kuyuya 1,8 mL ile resuspend. Örneğin 150 µL her kuyunun içine yükleyin.</li>
	<li>Peptidler için varsayılan yöntemi seçin: OG12PE00 (peptidler 3100 OFFGEL düşük Res Kit, pH 3-10, 12-şey çerçeveler ile kullanılmak için varsayılan yöntemi OFFGEL. Bu yöntem tamamlanan (~ 20 h) olmuştur kadar bekleyin. Düzgün etiketli tüpler kesirleri toplamak.</li>
</ol>12. temizlik Harvard aparatı sütun ters C18 Post-IEF (2 iletişim kuralı)
<ol><li>Kademeli %1 bir seferde birkaç μL ekleyin TFA her kesir için de-iyonize su örnek acidify. PH yaklaşık 3 veya daha düşük pH kağıt kullanarak onay.</li>
	<li>Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: çözüm 1 (5 mL Asetonitril de, 10 µL formik asit, 4,99 mL Ultrasaf Su) ve çözüm 2 (Asetonitril 0.5 mL, formik asit, 9,49 mL Ultrasaf Su 10 µL).</li>
	<li>Çözüm 1 150 µL spin sütunla önceden ıslak. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla. Çözüm 2 150 μL spin sütunla yıkayın. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla.</li>
	<li>Kesir sütunu boyunca geçmek. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla. Çözüm 2 150 μL ile yıkayın. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla.</li>
	<li>Kesir çözüm 1 50 μL ile elute. Santrifüj için 90 s 750 x g., bir kez daha bu adımları yineleyin.</li>
	<li>Kuru-kesir vakum yoğunlaştırıcı (150 x g, vakum 160 mBar) kullanarak ve-80 ° C'de</li>
</ol>13. analiz proteomik veri ve Biyoinformatik18
<ol><li>Bir nano-LC MS tarafından elde edilen verileri analiz/MS kütle spektrometre miktar yazılım MaxQuant (sürüm 1.5.2.8) gibi ve Andromeda arama motoru kullanarak.</li>
	<li>Yanlış bulma oranı (FDR) %1 proteinler ve peptidler ve 7 amino asitler en az uzunluğunu ayarlayın. C-terminal ayarla enzim özgüllük Arg ve Lys için. 2 cevapsız nefrette prolin tahvil izin. Sistein carbamidomethylation bir sabit değişiklik ve N-terminal protein asetilasyon ve metionin oksidasyon olarak değişken değişiklikler seçin.</li>
	<li>Daha fazla veri istatistiksel analiz yazılımı ile analiz. FunRich yazılımı (www.funrich.org/) kullanarak bir işlevsel zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin. DAVID yazılım (https://david.ncifcrf.gov/) kullanarak bir gen Ontoloji zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biology+perspective+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders%3A+functions+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li>
<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li>
<li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li>
<li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+morphological%2C+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li>
<li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li>
<li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926(2013).</li>
<li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction%2C+termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li>
<li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
<li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li>
<li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Proteomik ifade bütün bir hücre veya hücre altı bölmeleri farklı proteinlerin eğitim için güçlü bir araç olduğundan, hücre lizis Protokolü duruma getirilmesi ve proteinlerin sindirim çalışmalar bir dizi tarafından ele alınmıştır. Jel sindirim (polyacrylamide jel matris proteinlerin sindirim)17, çözüm18 ve filtre destekli örnek hazırlama19sindirim dahil yöntemleri üç ana sınıf vardır. Bu son yöntem, evrensel olarak, açıklanan ilk başta düşük tekrarlan...

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri apoptotik hücreler kaldırılması da dahil olmak üzere ve hücre dışı matriks1/ remodeling doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücreler kutuplaşmalar olarak da adlandırılan bir birçok olası etkinleştirme devlet çevirir güçlü fenotipik plastisite2 ile karakterizedir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji3alanında bir önceliktir. Sözde M1/M2 ikilemi M1 pro-inflamatuar temsil eder ve anti-inflamatuar makrofajlar M2 temsil eder kullanarak bu kutuplaşmalar sınıflandırmak için önerilmiştir. Bu model de akut enfeksiyonlar, alerji ve obezite4gibi çeşitli patolojik durumlar sığar. Ancak, kronik iltihaplı doku ve kanser, o bu sınıflandırma makrofajlar belirli hücresel ortamlar5,6', mevcut geniş fenotipik repertuar kavramak değiştiremiyor gösterilmiştir 7. makrofaj kutuplaşma daha iyi belirli microenvironmental sinyalleri8entegre etmek için bir çok boyutlu modeli kullanarak açıklanan geçerli fikir birliği olduğunu. Bu sonuç insan makrofajlar M1/M2 model elde edilen kutuplaşmalar9tanımlamada yetersiz olduğunu gösteren transcriptomic analizi ile doğrulanmıştır.
Çalışma insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imzalarını edinmek için bir protokol sağlar amaçlamaktadır sundu. Biz çeşitli oksijen düzeyleri ortamlarda insan makrofajlar ayırt etmek ve peptidler etiket içermeyen bir miktar gerçekleştirmek için tüm makrofaj Proteom elde etmek nasıl açıklar. Bu miktar çeşitli proteinlerin ifade düzeylerinin karşılaştırılması sağlar. Kök hücre araştırma bir çevre anahtar parametreyi10olarak oksijen önemini ortaya koyduğu gibi bu doku parametre insanlarda makrofaj polarizasyon etkisi nasıl anlamak arıyoruz. Oksijen kısmi basınç aralığı %3 20 (Toplam atmosferik basınç) % 20 kabaca ne genellikle (tam değer %18,6 su varlığı çekerken civarındadır bir hücre kültür kuluçka kullanılır için kaynakçalara insan vücudunda bulundu hesap).
Önceki çalışma alveoler fonksiyonel üzerinden interstisyel makrofajlar farklıdır ve morfolojik nokta sayısı11 ve bu farklılıkların muhtemelen kısmen maruz kalan12oldukları farklı oksijen seviyesi nedeniyle vardır göstermiştir. Ayrıca, kemik iliği türevi makrofajlar bir düşük oksijen çevre12' ye maruz kaldığında bakteri işbirliği için artan bir yetenek göstermek. Tam tersi bir etki için insan makrofajlar THP1 Ayrıştırılan13buldum, ama bu sonuçlar oksijen regülatörü makrofaj biyoloji olduğunu ve insan makrofajlar moleküler düzeyde bu rolü açıklamak için gerekli fikir destek. Bir önceki çalışmada, bu sorunlara yönelik olarak proteomik yaklaşım başvurdum. Aynı anda binlerce proteinler için ifade düzeylerini ölçme tarafından oksijen polarizasyon etkisi vurgulanır ve yeni moleküler işaretleyicilerin görünümünü bir liste sunuyoruz. Ayrıca bu bulgular bazı makrofajlar işlevlerine ilişkilendirmek başardık. Özellikle, fagositoz apoptotik hücre oranı ALOX15 upregulation için proteomik analizi14tarafından ortaya bağlı IL4/IL13-polarize makrofajlar içinde artış olmuştur bulduk. Bu da çalışmanın, biz böyle bir analiz gerçekleştirmek açıklar.

<table><tbody><tr><td>Hipoksi Çalışma İstasyonu</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 Akış sitometresi</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit (FA)</td> <td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie mavisi</td><td>Biorad</td><td>1,610,436</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit, E.Coli (LPS)</td><td>Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td>2D temizleme kiti</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta, glutamax takviyesi</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) Çözeltisi 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Aparat sütunu Ters C18 mikro döndürme sütunu</td><td>Harvard Aparatı</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 BOX</td> CD14 Mikroboncuk <td></td></tr><tr><td>insan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS ayırma sütunu LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>İnterlökin 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>İnterlökin 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>İnterferon gama (INF&gamma;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (klon T&Uuml; K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tüp Döndürücü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik Asit (TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/Lys-C Karışımı</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Komple Mini, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk Gradyan Çözeltisi ( Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Serumu insan erkek AB plazmasından (SAB)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin (BSA) çözeltisi% 30</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma bazlı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)% 20</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoüre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Mikro BCA Test Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL steril plastik pipet</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C Eppendorf</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 ters faz kartuşları, 100 mg</td><td>Sular</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücrelerin çeşitli işlevlerini etkinleştirme durumlarına hangi da polarizasyon denir ilişkilidir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji alanında bir önceliktir. Şu anda çok boyutlu bir yaklaşım nasıl polarizasyon çevre sinyalleri tarafından kontrol edilir açıklamak gerekli olduğunu kabul edilmektedir. Bu raporda, biz insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imza elde etmek için tasarlanmış bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı etiket içermeyen bir miktar jel-şeker ve Lys C/tripsin-sindirmek hücresel lizis içerik elde makrofaj protein ifade temel alır. Biz de bağlı olarak çözüm sindirim ve isoelectric alternatif olarak kullanmak için ayırma odaklanan bir protokol sağlar. Oksijen konsantrasyonu dokularda ilgili bir çevre parametresi olduğundan, biz nasıl atmosferik kompozisyon keşfetmek için bu iletişim kuralını kullanmanız veya düşük oksijen ortamı makrofaj polarizasyon sınıflandırılması etkiler.

Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) tarafından fark Santrifüjü elde başlayarak, protokol CD14 nüfusu izni alması+ monosit akış sitometresi (Şekil 1) fazla % 98 oranında biçilen bir saflığı ile. Bu monosit ikincil olarak çeşitli kutuplaşmalar doğru (Şekil 2) farklı. Ne zaman bir ayırma jel üzerinde seçilir, SDS-sayfa jeller üzerinde geçiş istenen bant sayısı elde etmek için adapte ve bantları çıkardım (<strong cl...

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Yani bu yöntem makrofaj biyoloji salanındaki temel soruların cevaplandırılmaya yardımcı olabilir, örneğin protein düzeyinde çeşitli ortamlar altında aktivasyon durumunun nasıl karakterize edilebildiği gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, etiketsiz niceleme yöntemi kullanılarak insan makrofajlarında birçok proteinin farklı bir ifade elde edilmesi ne kadar fırsat sağlamaktadır. Prosedürü gösteren benim laboratuvarımdan Marie Malier ve Magali Court olacak.Başlamak için, çözeltiLRSC almadan önce oda sıcaklığına ısınabilir, böylece iki 50 mililitresantrik santrifüj tüpleri her içine yoğunluk gradyan hücre ayırma çözeltisi 15 mililitre ekleyin. Yoğunluk sıcaklığa bağlı olduğundan bu esastır. LRSC'yi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne boşaltın.50 mililitreye kadar 1x PBS ekleyin ve karıştırın. Sonra, çok yavaş, dengelenmiş yoğunluk gradyan çözeltisi 15 mililitre üstüne karışımı 25 mililitre ekleyin. Bu adımsırasında aşamaları karıştırmamaya dikkat edin.Kan bu aşamada herhangi bir rahatsızlık olmadan yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine eklenmelidir. Her iki santrifüj tüpünü de 700 G'de 25 dakika boyunca santrifüjsüz olarak ayırın. Yoğunluk gradyan santrifüjünün sonunda, alttan yukarıya doğru katmanlar, pelet, yoğunluk gradyan çözelti fazı, PBMC tabakası ve seyreltilmiş plazmayı oluşturan eritrositler ve granülositlerdir.Bir pipetle, plazma fazını aspire etmeden geçirin. Sonra, yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpü içine PBMC tabakası toplamak. 300 G.Aspirate supernatant ve makrofaj orta 40 mililitre pelet yeniden askıya 10 dakika boyunca bir yıkama kurulum ve santrifüj olarak PBMCs için 1x PBS 50 mililitre kadar ekleyin.Bir Malassez odasında PBMCs kanepede sonra, bir santrifüj tüpü için deneme yapmak için gerekli PBMCs miktarını aktarın. Hücreleri 300 G.Aspirate'da 10 dakika santrifüj edin ve 10 milyon PBMC'de sıralama tamponunun 80 mikrolitresinde peleti yeniden askıya alın. Daha sonra, 10 milyon PBMC'ye 20 mikrolitre CD14 mikroboncuk ekleyin.İyi bir şekilde karıştırın ve sürekli ajitasyon altında 4 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, bir yıkama adımı olarak 10 milyon PBMC'ye bir mililitre sıralama tamponu ekleyin ve daha önce olduğu gibi santrifüj edin. Daha sonra, supernatant aspire ve 100 milyon PBMCs başına sıralama tampon 500 mikrolitre pelet yeniden askıya.Şimdi, ayırıcının manyetik alanına bir sütun yerleştirin. Üç mililitre sıralama arabelleğiyle durulayarak sütunu hazırlayın. Hücre süspansiyonu sütunüzerine uygulayın.Daha sonra gerekirse, sonraki boyama için etiketlenmemiş hücreleri içeren yoluyla akışı toplamak. Sütunu üç mililitre sıralama arabelleğiyle üç kez yıkayın. Sütununuzu kurutmamaya dikkat edin.Ardından, sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirin ve ayırıcıdan çıkarın. Yıkamadan sonra, pipet sütuna tampon sıralama beş mililitre. Hemen sıkıca sütuniçine piston iterek manyetik etiketli hücreleri dışarı floş.Son olarak, monositleri kaplamadan ve metin protokolünde açıklandığı gibi makrofaj polarizasyongerçekleştirmeden önce bu adımları yeni bir sütunla tekrarlayın. Hipoksik durum analizi yapmak için monositleri ve makrofajları oksijen kontrollü bir ortamda koruyun. Deney sırasında istenilen oksijen kısmi basınç altında hücreleri korumak için bir hipoksi çalışma istasyonu kullanın.Düşük oksijen basıncı altında çalışırken, tüm ortam ve yıkama tamponları istasyonu altında hazırlamak ve sıvı doğru kısmi basınç elde etmek için yeterli beklemek önemlidir. Uyarlanmış bir başlık altında bir tampon hücre lisis gerçekleştirin. Her örnek için 300, 000 hücrenin protein eşdeğerini 4-12%bis-tris akrilamid jellerine yükleyin.Elektroforetik göçün süresini kontrol ederek her protein örneğinin burada gösterildiği gibi altı jel bandına bölünmesini sağlayın. Sabitleme ve metin protokolünde açıklandığı gibi boyama sonra, temiz bir neşter ile protein bantları çıkarmak. 500 mikrolitrelik tüpler içine yerleştirmeden önce her excised bant zar.Şimdi, jel dilimlerini 200 mikrolitrede 25 milimolar amonyum bikarbonatta 37 derecede 20 dakika yıkayın ve her adım arasında amonyum bikarbonat atın. 25 milimolar amonyum bikarbonat ve asetonitril bir yıkama ile bu izleyin. Daha sonra jel parçalarını %100 asetonitile 200 mikrolitre ile 10 dakika dehydrate.56 santigrat derece 45 dakika boyunca 10 milimolar DTT ve 25 milimolar amonyum bikarbonat ile her jel parçası kuluçka. Daha sonra, DTT atın ve oda sıcaklığında karanlıkta 35 dakika boyunca 25 milimolar amonyum bikarbonat 55 milimolar iodoacetamide ile jel parçası inkübün. Alkiliyasyonu durdurmak için, kullanılan çözeltiyi atın ve her jel parçasını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 25 milimolar amonyum bikarbonatta 10 milimolar DTT'lik 200 mikrolitre ile kuluçkaya yatırın.Jel parçalarını 25 milimolar amonyum bikarbonat 200 mikrolitre yıkayın. Daha sonra, 10 dakika boyunca% 100 asetonitil 200 mikrolitre ile dehydrate. Üreticinin talimatlarına göre Tripsin/Lys-C Karışımı ile proteinleri bir gecede 37 santigrat derecede sindirin.Düşük emilim tüpleri 15 dakika boyunca% 50 asetonitil 50 mikrolitre ekleyerek jel parçalarından elde edilen peptidler ayıklayın. 15 dakika boyunca %5 formik asit 50 mikrolitre ekledikten sonra, 15 dakika boyunca% 100 asetonitril 50 mikrolitre ekleyin. Peptidlerin emilimini ve numune kaybını sınırlamak için düşük emilim tüplerinde her bir fraksiyonu çekin ve kurulayın.Örnekleri metin protokolünde ayrıntılı olarak daha fazla analiz edinceye kadar 80 santigrat derecede saklayın. Burada gösterilen cd14 pozitif monositlerin manyetik boncuk seçimi nden sonra akış sitometrisi tarafından değerlendirilen temsili saflıktır. Farklılaştırılmış insan makrofajlarının faz kontrast görüntülemesi, dokuz günlük kültürden sonra elde edilen iki farklı kutuplaşma için elde edilen morfolojilerin heterojenliğini göstermektedir.Gümüş lekeli SDS sayfa jelleri kullanılarak off-jel sindirim bir örnek gösterilir. Hücre lysis ve çözelti içi sindirim sonrası proteinin değerlendirilmesi, lysis sırasında bozulma nın olmadığını ve sindirimin verimliliğini gösterir. Burada gösterilen pozitif iki bir elektrik yükü ile MS spektrumu üzerinde 597,29 kütle-şarj oranı bulunan bir peptid bir çarpışma kaynaklı dissosilasyon spektrumu bir örnektir.Bu spektrumdan, ilgili sıra belirlendi. Analizden sonraki nihai sonuç, farklı ifade edilmiş proteinler kullanılarak tüm polarizasyon durumlarının hiyerarşik kümelenmelerini temsil eden bir ısı haritasıdır. Analiz, %3 oksijen durumundaki tüm polarizasyonlarda aşırı ifade edilen bir protein kümesini ortaya koymaktadır.Bu yordamı denerken, protokolünüzü buna göre uyarlamak için yeni örneklerde ne tür bir kesirleme gerçekleştireceğinize öncelikle karar vermeniz gerektiğini unutmamanız önemlidir. Bu çalışmayı kullanan proteomik yaklaşım, makrofaj biyolojipolarizasyon çalışmaları alanında son yıllarda kullanılan genomik yaklaşımların tamamlayıcısidir. Gelişiminden sonra, bu teknik immünoloji alanında araştırmacı insanlarda ve diğer memelilerde bağışıklık hücrelerinin aktivasyon çeşitli durumları keşfetmek için önünü açar.DTT ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu işlemi yapmak için uyarlanmış bir başlık altında çalışmanız gerekir.

proteomic-analysis-human-macrophage-polarization-under-low-oxygen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir...

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Makrofajlar, konak patojenitesinde rol oynayan anahtar hücrelerdir. Makrofajlar, proteomik analiz ile analiz edilebilen ve tespit edilebilen fenotipik ve fonksiyonel çeşitlilik gösterir. Bu makale, M1 veya M2 fenotipine farklılaşmış insan makrofajlarının birincil kültürlerinin 2D elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı ayırmak ve karakterize bir araştırmacı doku yerleşik sağlar makrofajlar içinde çeşitli metabolik bozuklukların diyet kaynaklı modellerinden çıkarılan iltihaplı dokulara hallmark.

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Bu protokol, insan M1 veya M2 polarize makrofajlardaki Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunu, periferik-kan monositlerinin GFP etiketli virülan strain H37Rv ile enfekte olan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşmasına dayanan ve seçilen M1/M2 belirteçlerinin ifadesini içeren 10 renkli bir panel kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilen bir yöntem sağlar.

M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Hücrelerin Polarizasyonu ve Mikobakteri Tüberküloz Enfeksiyonu Üzerine Akış Sitometrisi ile Analiz

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

makrofaj Farklılaşması ve Polarizasyonu, İnsan Monosit Benzeri THP-1 Lösemi Hücre Hattı Kullanarak M2 Benzeri Bir Fenotipe Dönüştür

Burada, mevcut protokollerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmeyi ve daha fazla araştırmayı teşvik etmeyi amaçlayan, in vitro implant yüzeylerinin immünomodülatör potansiyelini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Salgı sitokin profilleri, mRNA ekspresyonu ve hücre yüzey belirteçleri, titanyum üzerinde yetiştirilen makrofaj polarizasyonunu araştırmak için kan monositinden türetilmiş makrofajlar kullanılarak izlendi.

İmplant Yüzeylerinde M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Makrofajların Polarizasyonu ve Karakterizasyonu 

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Öğrenin, insan makrofajlarının düşük oksijen ortamındaki polarizasyon proteomik analizini. Etiketsiz kantifikasyon yöntemiyle protein ifadesi değişikliklerini karakterize edin ve immünoloji araştırmalarına katkı sağlayın.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Daha fazla video keşfet