NlsGPS1 Förster rezonans enerji kullanarak görüntülenmesi hücresel Giberellin düzeyleri (FRET) biyoalgılayıcı aktarma

Bu yöntem, bitki geliştirme alanında büyüme düzenleyici fitohormonların dağılımı ile ilgili anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Genetik olarak kodlanmış FRET biyosensörleri kullanarak, örneğin gibberellins algılar nlsGPS1 kullanarak, hücresel çözüm arabidopsis dokularda önemli bileşiklerin dinamik dağılımını ölçmek mümkündür. Fret biyosensörlerinin analizi, gürültüyü artıran oranmetrik görüntüleme ve niyet metrik görüntülemeye kıyasla ek analitik adımlar içerdiğinden, genel olarak bu konuda yeni bireyler mücadele edecektir.

1 / 2 Murashige ve Skoog veya MS agar kare plakalar yaklaşık 20 steril Arabidopsis tohumları ekim ile başlayın. Gözenek cerrahi bant ile plakaları mühür ve tabakalaşma için dört derece santigrat kuluçka bir ila üç gün boyunca alüminyum folyo ile sarın. Kök görüntüleme için, plakaları belirtilen koşullar altında üç gün boyunca dikey bir oryantasyonda bir büyüme odasına aktarın.

Koyu büyümüş Hipokotil için, çimlenme senkronize etmek için bir ila dört saatlik ışık darbesi için büyüme odasına plakaları aktarın. Sonra alüminyum folyo ile plakaları sarın ve üç gün boyunca dikey bir yönde büyüme odasına yerleştirin. Sabit durum ölçümleri için, temiz bir mikroskop slaytına 50 mikrolitre sahte çözelti ekleyin ve yavaşça üç nükleer lokalize gibberellin algı sensörü bir veya nlsGPS1 ifade fideleri slaytüzerine yerleştirin.

Sonra temiz bir kapak kayma her köşesinde bir damla vakum gres nokta ve yavaşça fideler üzerinde kayma kapsayacak şekilde yerleştirin. Gerektiğinde hava kabarcıklarını gidermek için dikkatlice ekstra sahte çözüm ekler. Gibberellin dört veya GA4 tedavi den önce, 20 mililitrelik bir şırınga vakum gres ile doldurulmuş ve bir milimetre çapında açık bir modifiye 200 mikrolitre lik pipet ucu ile temiz bir cam slayt üzerinde iki buçuk santimetre genişliğinde dikdörtgen uzunluğunda düzgün katmanlı üç buçuk santimetre uzunluğunda çizmek için donatılmıştır kullanın.

Dikdörtgenin ortasına 50 mikrolitre sahte çözelti ekleyin ve sahte çözeltiye dikkatli bir şekilde aktarılabilmek için nitonların alt tarafındaki nlsGPS1 ifade fidelerini kaldırmak için temiz forsepskullanın. Vakum gresi ile benekli bir kapak fişini vakum gres dikdörtgeninin ortasına yerleştirin ve fideleri rahatsız etmeden rezervuarı dikkatlice ekstra sahte solüsyonla doldurun. Daha sonra forster rezonans enerji transferi görüntüleme gerçekleştirmek için heyecan verici CFP ve YFP için uygun lazerler ile donatılmış bir confocal mikroskop üzerinde fide görüntüleri elde.

Tedavi için GA4 için, mikroskop aşamasından slayt çıkarın ve 20 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın. Sahte çözeltinin tamamı değiştirilene kadar kapağın sol tarafına bir mikro molar GA4 ile takviye edilmiş çeyrek MS sıvısının 17 mikrolitresini eklerken, kapak fişinin sağ tarafından hemen sahte çözeltiyi çıkarın. Daha sonra cam kaydırağı mikroskop aşamasına geri yerleştirin ve GA4 tedavi görüntüsünü almadan önce 10 dakika daha bekleyin.

İlgi çekici bir doku için bir zaman kursu kurmak için, bir ibidi yapışkan-slayt perfüzyon kanalının merkezine sahte çözelti 200 mikrolitre ekleyin ve yavaşça gösterildiği gibi sahte çözüm içine nlsGPS1 fideleri yerleştirin. Yapışkan kaydırağının çevresinde yapışkan malzeme ile güçlü bir bağ oluşturana kadar kapağın dış kenarlarına hafifçe bastırmak için forsepsin arka tarafını kullanarak fidelerin üzerine hafifçe bir kapak kayması yerleştirmek için forseps kullanın. Daha sonra, yapışkan kaydırağı sahte çözümle dolu 20 milimetrelik şırıngaya bağlamak ve çıkış çözümünü toplamak için kaydırağı bir çıkış kabına bağlamak için iki adet 0,8 milimetrelik iç çaplı dirsek Luer konektörleri ve 0,8 milimetrelik iç çaplı silikon boru parçası kullanın.

Hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için hazneye yeterli çözümü dağıtmak için pistonun üzerine hafifçe bastırın ve şırıngayı programlanabilir bir şırınga pompasına yükleyin. Sonra zaman kursu başlatmak için pompa başlatın. Zaman kursu sırasında GA4 tedavileri için, perfüzyon durdurmak için pompa duraklatın ve ga4 ile desteklenen bir çeyrek MS sıvı ile dolu bir şırınga içeren sahte tampon değiştirin.

3B görüntü analizi için dosyaları IMARIS görüntü analizi yazılım programına aktarın ve yüzeyler sihirbazını açın. Arka plan çıkarmasını üç mikrona ve eşikle varsayılan olarak ayarlayın. Çekirdeklerin bölümlemesi sırasında, yakın arka plan sinyal seviyelerine sahip nesnenin sinyal-gürültü oranı oranmetrik görüntü analizi için çok düşük olacağından, loş floresanlı birçok çekirdeği dahil etmemeye özen dinecektir.

Ardından, YFP emisyonu kullanılarak oluşturulan yüzeylere göre CFP ve FRET emisyon kanallarını maskeleyin. XT ortalama yoğunluk oranı uzantısını kullanarak donör uyarma kabul edici emisyonunun iki kanaldaki tek tek yüzeylerin ortalama yoğunluk değerleri arasında donör uyarma donör emisyonuna bölünmüş bir oranını hesaplatın. NlsGPS1 emisyon oranı ile tek tek yüzeyleri renklendirmek için, istatistiklerle renk kodlamasını seçin ve ortalama yoğunluk oranını istatistik türü olarak ayarlayın.

İstatistik simgesine göre, tablodan tek tek değerlerin oranlarını dışa aktarın ve verileri grafik gösterimi için değerleri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın. Arabidopsis kökünde, nlsGPS1 emisyon oranı gradyanı meristematik ve bölünme bölgelerinde düşük GA4 düzeyleri ve geç uzama bölgesinde yüksek GA düzeylerinin göstergesidir. Buna karşılık, bir emisyon oranı gradyanı nlsGPS1 yanıt vermeyen kökleri gözlenen değil, endojen GA4 gradyan bir artifakı olmadığını düşündürmektedir.

Bir nlsGPS1 emisyon oranı gradyanı da kotoyledondüşük düzeyleri ve tipik kanca ve hipokotil hızla uzayan bazal bölgede yüksek düzeyde koyu büyümüş hipokotiloluşur. Buna karşılık, nlsGPS1 yanıt vermeyen hipokotillerde emisyon oranı gradyanı gözlenmez. Ayrıca, dışa dönük olarak sağlanan GA4, arabidopsis kökünün bölünme bölgesine göre tercihen uzama bölgesinde birikerek nlsGPS1'in endojen ve eksojen GA desenlerini incelemek için kullanılabileceğini gösterir.

Buna ek olarak, GA4 tedavi nlsGPS1 fidezaman ders analizi, böylece bölünme bölgesine göre kök uzaması eksojen GA4 daha hızlı bir birikimi ortaya koymaktadır. Bu yordamı denerken, görüntüleme parametrelerini sabit tutmak ve numune perfüzyonu sırasında sürüklenme ve odak değiştirme sorunlarını en aza indirmek için nicel görüntüleme sırasında doymuş piksellerden kaçınmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürütaki ayrıntılı yöntemlerden sonra, kök yonga tipi kontrol profüzyon cihazlarında büyüyen görüntüleme kökleri gibi, ga gradyanlarının arabidopsis kök uçlarında farklı oranlarda veya strese yanıt olarak nasıl değiştiği ne kadar ek soruları yanıtlamak için yapılabilir, bu teknik ek Arabidopsis thaliana doku ve organlarındaki gibberellinlerin dinamik dağılımını araştırmak için bitki büyümesi alanında araştırma nın önünü açmıştır.