Name: Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Öğrenin Ustilago maydis Truva atı suşu ile mısır dokularına protein teslimatı yöntemini. Bu teknik, salgılanan proteinlerin in situ fonksiyonlarını ve enfeksiyon sürecini detaylıca incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella ve Armin Hildebrand laboratuvar alanı ve bitki malzeme sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Truva atı yöntemi özgün çalışmalarına Leopoldina postdoc Bursu ve NSF proje IOS13-39229 tarafından desteklenmiştir. Bu makalede sunulan iş DFG (A14 ve B14 projeler) SFB924 tarafından desteklenmiştir.

1. bir U. maydis Truva atı inşaatı
Not: Bkz: Şekil 1.
<ol><li>Bir gen Mısır cDNA gene özgü astar ve proofreading bir DNA polimeraz kullanarak dan ilgi yükseltmek. Birincil PCR ürünü klon ve plazmid satıcının talimatları. E. coli inşa dönüştürmek Faiz sırası Sanger sıralama sonraki klonlama adımlar için kullanmadan önce tarafından doğru gen doğrulayın. Not: PCR özellikleri astar sıra özelliklerine ve en uygun DNA polimeraz reaksiyon koşulları nedeniyle optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Mısır gen ilgi olmadan bir sinyal peptid (SP) kodlama sırası yükseltmek için tasarım astar.</li>
	<li>RSIATA motifi ve bir Astsubayile ters astar 5´ sonunu uzat ben kesme makinası (Tablo 1).</li>
	<li>1.1 PCR şablon olarak oluşturuldu PCR yapı kullanarak okuma DNA polimeraz ile ilgi Mısır gen yükseltmek.</li>
	<li>Çift-Özet PCR ürünü ve U. maydis dönüştürme plazmid, p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha15, Xbaile ben ve Astsubay I. arındırmak sindirilir PCR ürünü ve plazmid.</li>
	<li>Sindirilir PCR ürünü T4 DNA ligaz manufacturer´s talimatları kullanarak p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha şablonu içine ligate. E. coli tüp ligasyonu ürün dönüştürmek ve faiz sırası Sanger tarafından doğru gen doğrulayın sıralama.</li>
	<li>P123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmfaiz-mCherry gen-Ha Restriksiyon enzimi Sspile linearize ben ve dönüşüm solopathogenic U. DNA'ya Maydis SG20016süzün. U. maydis transformants carboxin seçime göre ayırmak ve izole transformants Güney tarafından analiz16leke onaylayın. Not: Her protein ilgi, en az üç bağımsız U. maydis için transformants izole ve rasgele arka plan mutasyonlar herhangi bir fenotip etkilerini tahmin etmek için analiz.</li>
</ol>2. Kültür medya
<ol><li>YEPSlight sıvı orta16hazırlamak: %1.0 (w/v) maya ekstresi, (w/v) Bacto-pepton % 0,4 ve % 0,4 (w/v) sükroz. GKD2O ve basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de tüm bileşenlerinde dağıtılması; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.</li>
	<li>Patates dekstroz agar (PD-agar)20hazırlamak: (w/v) % 3.9 patates dekstroz agar ve %1.0 (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0.01 M). Tüm bileşenlerinde doğrudan şişeyi ısıyla için mix ve GKD2O artı bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.</li>
	<li>PD-kömür agar20hazırlamak: (w/v) % 3.9 patates dekstroz agar, %1 (w/v) kömür ve %1.0 (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0.01 M). Tüm bileşenlerinde doğrudan şişeyi ısıyla için mix ve GKD2O artı bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.</li>
</ol>3. bitki enfeksiyon
<ol><li>Truva atı (Örneğin, mikroskobu tabanlı hücre sayımı) protein teslim yanıt olarak Mısır hücre bölünmesi analizini gerçekleştirmek önceden. U. maydiskaynaklı Mısır hücre çoğalması ve 4-5 gün sonrası enfeksiyon sonraki tümör oluşumu başlar. Nicel hastalığı değerlendirmeler doku bağımlıdır ve 6 ila 14 gün sonrası enfeksiyon için yapılmalıdır. Not: Farklı Mısır çeşitlerin U. maydis enfeksiyona yatkınlık farklı düzeylerde gösterir. Mısır cvs W23, A188, Gaspe flint, erken Golden ufak tefek veya Va35 Bu patojen karşı duyarlılık göstermek ve böylece Truva atı çalışmaları için uygun çeşitlerin çoğu.</li>
	<li>U. maydis inoculum hazırlanması
	<ol>
<li>Enfeksiyon üzerinde yan etkileri tarafından transgenik zorlanma tahmin etmek için tüm Truva atı deneylerde bir negatif kontrol olarak yaratıcı zorlanma SG200 içerir. Burada, bir negatif kontrol olarak ilgi protein olmayan salgılanan sürümünü ifade bir U. maydis zorlanma kullanın. Ancak, pratiklik (Örneğin, daha büyük gösterimleri) nedenlerle progenitör zorlanma denetiminin daha kolay seçim olabilir.</li>
		<li>Deneme başlamadan önce enfeksiyon kültür ne miktarda ihtiyaç vardır tahmin ediyoruz. Enfeksiyon her bitkinin U. maydis süspansiyon 1-1.5 mL gerektirir Mısır doku türüne bağımlı unutmayın. Not: Bir gecede kültür yaklaşık 1 mL 0,2 20 mL YEPSışık orta bir OD600 seyreltme için yeterli ve bir U. maydis kültür 25 mL bir doz600 0.8-1.0 ile 13-16 bitkilerin enfeksiyon için yeterli.</li>
		<li>Kazı-kazan U. maydis PD agar üzerinden bir steril Pasteur pipet kullanarak plaka, 5 mL YEPShafif orta aşılamak ve 28 ° C'de sabit 16 h için 200 devirde sallayarak ile büyümek kültür izin.</li>
		<li>Enfeksiyon önce uygun büyüme ve 400 X büyütme, bakteriyel kontaminasyon için standart ışık mikroskobu tarafından U. maydis aşılama kültürünü incelemek. Not: Uygun bir kültür, sadece puro şeklinde mantar görülebilir (Şekil 2) olduğunu.</li>
		<li>Taze YEPSışık , 900 µL gecede Kültür 100 µL ile karıştırıp spektrofotometre analizde boş olarak YEPSışık orta kullanarak OD600 ölçmek.</li>
		<li>Taze YEPShafif orta 0.2 OD600 ile gecede kültür sulandırmak ve 28 ° C'de orta günlük büyüme aşaması ulaşan aşırı doz tarafından belirtilen kadar sürekli 200 devir / dakikada sallayarak ile büyümek kültür izin600 nm 0.8-1.0. Not: U. maydis hücreleri yinelenen her 2 h bu koşullar altında böylece istenen OD600 ekimi 4-5 h sonra ulaşılır.</li>
		<li>3000 x g 10 dk de iplik tarafından OD600 0.8-1.0 hücre hasat ve süpernatant atın.</li>
		<li>Hücre Pelet GKD2O. bir kez yıkamak Bu amaçla, GKD2O, spin ile 3000 x g 10 min için bir kültür hacmi ekleyin ve süpernatant atın.</li>
		<li>Hücre Pelet dikkatle GKD220 mL Cam Pipet kullanarak O böylece 3.0 (için bir Truva atı tahlil) veya 1.0 (hastalık rating için) son OD600 ayarlama resuspend.</li>
	</ol></li>
	<li>Truva atı doğrulanması: Mısır füzyon proteinin planta salgı içinde
	<ol>
<li>Bir Truva atı zorlanma17ile Mısır fidan bulaştırmak.</li>
		<li>2-3 gün sonrası enfeksiyon confocal lazer tarama mikroskop kullanarak, virüslü fidan mikroskobik görüntüleme gerçekleştirmek. Bu amaçla, yaprak enjeksiyon puanın altına 1 cm dikdörtgen bir parçasını tüketim, örnek bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin ve bir damla GKD2O. eklemek MCherry füzyon protein görselleştirmek için numune λ, heyecanlandırmak 561 nm ve kayıt emisyon, λ = 580-630 nm =.</li>
	</ol></li>
	<li>Enfeksiyon yetişkin Mısır yaprak
	<ol>
<li>Yetişkin yapraklar sahneye mısır bitkileri yetiştirmek (ne zaman en az yaprak 7 büyür içinde SAP). Not: Bu aşamada 14 h, 28 ° C gün/10 h, 22 ° C gece ritim cv. W23 kullanarak sera koşullarında Ekim üzerine dört hafta sonra ulaşılır. Süre ile Mısır çeşidinde ve sera koşulları değişebilir.</li>
		<li>U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.</li>
		<li>Sap sap meristem doku dikkatle yerelleştirmek için tuşuna basın. Meristem tabanının yumuşak doku daha zor sapı bir geçiş tarafından ayrılır.</li>
		<li>Meristem bir kalem kullanarak sap üzerinde işaretlemek.</li>
		<li>U. maydis kültür ateş meristem veya önümüzdeki meristem yukarıda 1 cm 1,5 mL enjekte.</li>
		<li>Hastalık belirtileri, 6 ve 12 gün sonrası enfeksiyon oranı.</li>
	</ol></li>
	<li>Püsküllü enfeksiyonu
	<ol>
<li>Püskül sahne erişene dek Mısır bitkiler büyümek. Not: Mısır cv. W23 anter ve Püskül kalkınma üzerinde ayrıntılı zaman çizelgesi yukarıda açıklanan1819oldu. Önceden segregasyonun jwiles içeren püsküllü U. maydis enfeksiyon için son derece açıktır; Mısır cv. W23 püsküllü 4-7 cm büyüklügündedir.</li>
		<li>SAP dikkatle kök Püskül yerelleştirmek için tuşuna basın.</li>
		<li>Mark ucu ve bir kalem kullanarak kök üzerinde Püskül Bankası.</li>
		<li>U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.</li>
		<li>Püskül çevresinde inoculum 1,5 mL enjekte. İnoculum eşit dağılımını sağlamak için yavaş yavaş 0.5 mL ucu, orta bölümü ve kalemle işaretlenmiş Püskül baz yerleştirin.</li>
		<li>Hastalık belirtileri 10 gün sonrası enfeksiyon oranı.</li>
	</ol></li>
	<li>Kulak enfeksiyonu Not: kulak doku geliştirme ayrı Mısır çeşitlerin ve sera şartlarında farklıdır ve aşı önce dikkatle uyulmalıdır. İpek büyümek yaramaya kulakları U. maydis enfeksiyon için son derece açıktır.<ol>
<li>U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20 G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.</li>
		<li>Aşı iğne kabuğu yapraklar arasındaki boşluğa gibi derin kulak ağır yaralı olmadan enjekte et.</li>
		<li>Sürüm 1.5 mL inoculum kulak çevresinde.</li>
		<li>Şırınga ve iğne kaldırmak ve dikkatle U. maydis çözüm eşit olarak dağıtmak için cob masaj.</li>
		<li>Hastalık belirtileri 14 gün sonrası enfeksiyon oranı.</li>
	</ol></li>
	<li>U. maydis inoculum canlılığı onaylamak
	<ol>
<li>İnoculum 10 µL PD kömür agar tabakta bırakın ve oda sıcaklığında 2 gün kuluçkaya. Not: Eğer ilgili U. maydis kültür formu filamentler için mümkün, kabarık, beyaz miselyum olur görülebilir (Şekil 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+tumour%3A+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+a+maize+plant%3A+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep1%2C+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.%2C+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).</li>
<li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li>
<li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355(2014).</li>
<li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).</li>
<li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li>
<li>Juárez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut+%28%27Huitlacoche%27%29+as+a+new+platform+for+oral+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535(2015).</li>
<li>Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarkari%2C+P+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).</li>
<li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+%28Zea+mays%29+anther+cell+behavior+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li>
<li>Bösch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li>
<li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li>
<li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Maydica%22%5BJournal%5D)">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34(2015).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Bacteria%2C+Bacteriophages%2C+and+Fungi%3A+Volume+1%22">Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1</a>. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).</li>
<li>Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li>
<li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li>
<li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Modern ürün araştırma genetik moleküler analiz ve protein düzeyleri için protokoller talep ediyor. Genetik erişilebilirlik ile dönüşüm kullanılabilir veya verimsiz ve Mısır gibi birçok bitki türünün zaman alıcı değil. Ayrıca, güvenilir genetik organizatörü muhabir sistemleri gibi farklı doku siteleri kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlükte yerinde protein işleviyle çalışmaya zor kılan kıt, araçlardır. Apoplastic protein heterologously ifade ve saf protein infiltrasyon doku içine tarafından incelenecektir. A...

Biotrophic patojen Ustilago maydis Mısır kurum hastalığı1hastalığının olduğunu. Mısır melanized, siyah sporları içeren büyük tümör içinde kaynaklanan tüm hava parçaları bozar. Küresel düzeyde, U. maydis tümörü Meksika'da lezzetin bir incelik olarak takdir edilmektedir iken Mısır verimi, yaklaşık % 2 yıllık bir kaybına neden tahmin edilmektedir. Bitki enfeksiyon Mısır epidermal hücrelerin ilk tabakası nüfuz hücre duvarı lysing enzimler salgılar bir appressorium tarafından başlatılır. Bir birincil enfeksiyon sitesinden bir-iki hücreyi istila katmanlar her gün1,2, intracellularly ve intercellularly U. maydis yetişir. Beş gün üzerine görünür tümör dönüşüyor bitki hipertrofisi sonuçlarında başarılı enfeksiyon enfeksiyon1,3,4posta. Bütün enfeksiyon aşamaları sırasında mantar hif bitki sitoplazma membran ana makine sitoplazma1,2için doğrudan herhangi bir temas olmadan invaginate. Bitki plazma zarı arasındaki bulaşmasını hif sıkı apoplasmic alanı biotrophic etkileşim bölgesi adı verilen ana bilgisayar/patojen interaktif sitesi olarak kabul edilir. Bitki doğuştan gelen bağışıklık sistemi üstesinden gelmek için U. maydis bir dizi efektör proteinlerin biotrophic etkileşim bölgesi1salgılar. Diğerleri biotrophic etkileşim bölgesi5,6,7,8' kalır bazı effectors bitki hücreleri tarafından alınır. Bir apoplastic efektör UmPit2, sinyal peptid ZmZIP1 apoplastic proteaz aktivitesi9,tarafından ZmPROZIP üzerinden10sürümü önlemek için apoplastic Mısır proteaz ile etkileşim olduğunu.
Son on yıl boyunca U. maydis mantar genetik bitki patojeni etkileşim içinde aynı zamanda iyi anlaşılmış bir yaşam döngüsü, kolay genetik erişilebilirlik nedeniyle biyoteknoloji değerli bir araç için sadece bir model oldu değil ve kapaklı ifade salgılanan proteinler11,12,13. Her iki geleneksel ve sıradışı protein salgılanması için sinyalleri ardından değişiklikler14kontrol sağlayan tespit edilmiştir. Son zamanlarda, küçük, çalışmaya bir Truva atı araç salgılanan gibi Mısır proteinler in situ15 U. maydis istihdam edildi. Truva atı yaklaşım şekilde küçük, salgılanan protein anter geliştirmede söz konusu ZmMAC1 işlev analiz etmek için kullanıldı. ZmMAC1 pluripotent hücreler ve yeni kurulan hücreleri15hücre kader tayini periclinal bölümü neden olmaktadır. Aynı yöntemle Mısır hasar ilişkili peptid ZmZIP1 biyolojik fonksiyonu ortaya çıktı. ZmZIP1 sonuçlandı Mısır salgılayan U. maydis tümör oluşumu10Engelli. Böylece, Truva atı yaklaşım temsil in situ çalışmalar ne yapar kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüklü protein için değerli bir alternatif yol istemek istikrarlı Mısır dönüştürme satırları ne de doku infiltrasyonu ile nesil heterologously ifade ve saf protein. Özellikle, Truva atı strateji Mısır apoplast kapaklı herhangi bir protein salgılanması ve aynı doku içindeki sigara enfekte bitki hücreleri enfekte karşı doğrudan karşılaştırma sağlar.
Bu iletişim kuralı bir protein ilgi çalışmaya bir U. maydis Truva atı gerginlik getirici için başlıca adımları göstermektedir. Hangi kronolojik zamanmekansal enfeksiyon ilerleme ve protein işlevi eğitim için bir önkoşuldur U. maydisile daha fazla üç farklı Mısır doku türü (yetişkin yapraklar, püsküllü ve kulakları) enfeksiyon yordamları hakkında kesin bilgiler içerir Bu hedef dokulara. Daha fazla hiçbir belirtim Mısır gene amplifikasyon üzerinde verilen ve mikroskobik adımları hedef özgü ve enstrüman bağımlı olduğundan teknikleri, görüntüleme. Böylece, bu iletişim kuralı standart moleküler biyoloji teknikleri deneyimli kullanıcılara yöneliktir.

<table><tbody><tr><td>2 mL şırınga&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 hipodermik iğne</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>mısırdan</td><td></td><td></td> elde edilen cDNA, <td>mısır dokusundan elde edilen ve interrest genini ifade eden</td></tr><tr><td>cDNA</td><td>Kömür Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td></td><td></td><td>yerel olarak mevcut ekipmanı kullanın</td></tr><tr><td>Küvet (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör-çalkalayıcı 28 dereceye ayarlanmış; C, 200 rpm</td><td></td><td></td><td>yerel olarak mevcut ekipmanı kullanır</td></tr><tr><td>400 kat büyütmeli</td><td></td><td></td> ışık mikroskobu <td>yerel olarak mevcut ekipmanı kullanır</td></tr><tr><td>Nco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>lütfen ilgili yazarla iletişime geçin&nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur pipeti (cam, uzun uç)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td>, <td>pENTR veya pJET gibi diğer temel klonlama vektörleri ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Patates Dekstroz Agar&nbsp;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie kalemi</td><td></td><td></td><td>yerel olarak mevcut ekipmanı kullanır</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td>yerel olarak mevcut ekipmanı kullanır</td></tr><tr><td>Ssp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>Maya özütü&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

ustilago maydis bir truva atı olarak in situ teslim, mısır proteinler için kullanma.

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Homer´s Truva atı mit esinlenerek, Mısır patojen Ustilago maydis salgılanan proteinler içinde vivo fenotipik analiz izin Mısır apoplast sunmak için tasarlanmış. Bu yöntem Mısır dönüşüm üzerinde dayanmaz Ancak mikrobiyal genetik ve patojenlerin salgı yetenekleri olağanüstü başarı. Burada, içinde vivo incelenmesi salgılanan proteinler kronolojik zamanmekansal çözünürlükte yüksek enfeksiyon siteleri ve doku çeşitleri ile teslim sağlar. Truva atı strateji-ebilmek var olmak kullanmak geçici işlevsel olarak protein etki alanları, hedef protein etkilerini incelemek veya ofsayt protein overdosage, güçlü bir araç yapmak için çalışmaya karakterize etmek için Mısır işlev kaybı fenotipleri tamamlayacak protein çalışmaları Mısır ürün sistem. Bu eser üç farklı Mısır doku türü için bu yöntemi uygulamak için standart enfeksiyon protokolleri takip bir Truva atı yük oluşturmak nasıl kesin bir iletişim kuralını içerir.

U. maydis Truva atı deneyler için yapıları plazmid p123-PUmpit2-SpUmpit2-faiz-mCherry gene-Haklonlanır. Mısır gen ilgi mCherry floresan muhabir ve bir epitope HAerimiş-etiket. Özellikle enfeksiyon21sırasında aktif U. maydis Umpit2 Düzenleyicinin kontrolü altında füzyon protein ifadesidir. Biotrophic etkileşim bölgesi haline için doğr...

Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Genetik ve protein düzeyleri ile ilgili süreçlerin araştırılması mahsul araştırmalarında çok önemlidir. Yaklaşımımız, farklı enfeksiyon yan larında ve dokularda en yüksek mekansal zamansal çözünürlüğe sahip salgılanan labirent proteinlerinin incelenmesini sağlar. Truva Atı Yöntemi yararlı automatous salgı yetenekleri araştırıyor.Zaman alıcı ve zorlu labirent dönüşümlerini atlatır ve labirent appelplatz içinde salgılanan proteinler üzerinde ayrıntılı çalışmalar kolaylaştırır. Eklenen labirent yapraklar, püsküller ve kulak uygun enfeksiyon hakkında ayrıntılı bilgi. Ve hedef dokuda enfeksiyon ilerlemesi ve protein fonksiyonu başarılı çalışma gösterir.Prosedürü gösteren Isabell Fiedler, laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olacak. Deneye başlamak için, steril bir pasteur pipetkullanarak bir pediatr plakaeumadous çizik. Eumadous ile YEPS Hafif Orta 5 mililitre aşılamak.16 saat boyunca 200 rpm sürekli sallayarak, 28 santigrat derece kültür büyümek. Ertesi gün 900 mikrolitre taze YEPS Işığı ile 100 mikrolitrelik bir gecede karıştırın. OD-600'ü YEPS Light Medium kullanarak spektrofotometre analizinde boş olarak ölçün.Taze YEPS Light Medium ile gece kültürünü 2 od-600'e seyreltin. Kültür 200 rpm sürekli sallayarak 28 derece santigrat büyümeye izin, orta günlük büyüme aşamasına ulaşana kadar, 8-1.0 bir OD-600 ile gösterilir. Kuluçkadan sonra hücreleri 3000 kez 10 dakika döndürerek hasat edin.Supernatant atın. Daha sonra hücre piletini 1 kültür hacmi dDH2O ile bir kez yıkayın. Hücreleri 3000 zaman chi'de 10 dakika döndürün ve süpernatant'ı atın.Daha sonra, 20 mililitrelik cam pipet kullanarak Hücre lisi DDH2O'da dikkatlice askıya alın. Böylelikle son OD-600 TO 3.0 bir Truva Atı tahlil veya hastalık derecelendirme için 1.0 ayarlama. En az yaprak 7 sap içinde yetişir yetişkin yapraklar, bir aşamaya labirent bitkileri yetiştirmek.Sonra, 20 gauge bi bir hipodermik iğne ile 3 mililitrelik şırınga içine Eumadous kültürü aktarın. Ayna Kök Dokusunu yerelleştirmek için sapı dikkatlice bastırın. Ayna Sapı tabanı daha sert saptan daha yumuşak dokuya geçişle ayırt edilebilir.Ayna Sapını kalem kullanarak sapına işaretleyin. Shoot Mirror Stem veya Çiçeklenme Ayna Sapı üzerinde 1,5 mililitre Eumadous kültürü enjekte edin. Labirent bitkileri püskül aşamasına ulaştıktan sonra, sapı sapı lokalize etmek için dikkatle tuşuna basın.Ucunu ve püskültabanını bir kalem kullanarak sapına işaretleyin. Püskül etrafında inokül toplam 1.5 mililitre enjekte etmek için 20 gauge bi bir hipodermik iğne ile 3 mililitreşlik şırınga içine Eumadous kültürü aktarın. Inoküleşit dağılımını sağlamak için, yavaş yavaş ucu, orta ve püskül tabanı kalem ile işaretlenmiş 5 mililitre yerleştirin.Eumadous kültürünü 20 gauge bi one hipodermik iğneile 3 mililitrelik şırıngaya aktarın. Kulak yaralanması olmadan mümkün olduğunca derin kabuk yaprakları arasındaki boşluğa aşılama iğne enjekte, sonra kulak etrafında inokül 1.5 mililitre bırakın. Daha sonra, şırınga ve iğne çıkarın ve dikkatle eşit Eumadous çözüm dağıtmak için cob masaj.PD kömür burgu plaka üzerinde inoculum 10 mikrolitre bırakın. Daha sonra 2 gün oda sıcaklığında kuluçkaya yat. ZM Mach1 salgılayan hyphae floresan ve kiraz sinyali ile çevrilidir.Buna karşılık, nonsecreting hyphae sadece mantar sitoplazmasında floresan sinyal gösterir. Inokülün yanlış püskül lokalizasyonu veya eşit olmayan dağılımı, püskülün eşit dağılıma göre enfekte olmayan püskül veya sadece kısmi enfeksiyonuna neden olabilir. Pd kömür burgu kültürlü solo patojenik Truva Atı Progenester suşu SG-200, gösterildiği gibi plaka üzerinde beyaz kabarık filamentler oluşturur.Eumadous suşu FB1 bulaşıcı filament oluşumundan önce miyon gerektirir iken. Enfeksiyon dan sonra, Truva Atı karaciğer proteini olası yanıt hastalık derecelendirme veya mikroskobik görüntüleme de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Birçok patojen için dönüşüm ve salgı iyi anlaşılmıştır ve benzer bir şekilde araştırılabilir.Bu nedenle, dönüşüme açık olmayan ev sahibinin çalışmasını sağlarlar.

using-ustilago-maydis-as-trojan-horse-for-situ-delivery-maize

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Kaynak: Beernink, B. M. ve diğerleri. Mısır fidanlarının doğrudan agroinaşılanması, rekombinant foxtail mozaik virüsü ve şekerkamışı mozaik virüsü bulaşıcı klonlarla enjeksiyon yapılmasıdır. J. Vis. Exp. (2021)Bu video, gen susturma için rekombinant viral klonların Agrobacterium aracılı olarak mısır fidanlarına aktarılmasını gösteriyor.  Agrobakteriyel enfeksiyon, sistemik viral yayılım ve RNA girişimiyle ilgili fenotipik değişiklikler sürecini özetlemektedir.

Gen Susturması için Rekombinant Viral Klonlarının Mısır Fidanlarına Agrobakteri Aracılı Teslimatı

Biyotrofik patojen Ustilago maydis ile mısır ve teozinte bitkileri aşılamak için iğne enjeksiyon yönteminin kullanımı açıklanmıştır.  İğne enjeksiyonu aşılama yöntemi, mantar patojeninin, patojenin eksrezi oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında kontrollü bir şekilde teslimini kolaylaştırır. Bu yöntem son derece verimlidir, U. maydisile tekrarlanabilir aşılar sağlar.

Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Bitki morfojenik genler inatçı genotiplerin genetik dönüşümlerini iyileştirmek için kullanılabilir. Burada açıklanan bir Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm (QuickCorn) üç önemli kamu mısır inbred hatları için protokoldür.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Tilki kuyruğu mozaik virüsünün ve şeker kamışı mozaik virüslerinin mısır fidelerine aşılanması için Agrobacterium bazlı enjeksiyon (agroinjection) protokolü sunulmaktadır. Bu şekilde aşılama viral enfeksiyona, belirteç genlerinin virüs kaynaklı gen susturmalarına ve GFP'nin viral aşırı ekspresyonuna yol açar.

Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu

Burada, mısır mezofil hücrelerinde büyük plazmid kütüphanelerini test etmek için milyonlarca mısır protoplastını geçici olarak transfekte etmek için yüksek verimli bir protokol sunuyoruz.

Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Saccharomyces cerevisiae'deki endojen konumlarında histon genlerinde mutasyon oluşturmak için bir strateji sunulmuştur.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

Burada bir rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 9 nöromuskuler hastalık bir fare model kullanma mikroRNA teslimini açıklayın. Sürekli miRNA overexpression kas ve motor nöronlar, bir fırsat çalışma miRNA işlevi ve tedavi edici potansiyel içinde vivosağlayan bir tek çevresel yönetim farelerde sonuçlandı.

Kemirgen nöromusküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant Adeno ilişkili virüs serotip 9 kullanarak mikroRNA sistemik teslim

Öğrenin Ustilago maydis Truva atı suşu ile mısır dokularına protein teslimatı yöntemini. Bu teknik, salgılanan proteinlerin in situ fonksiyonlarını ve enfeksiyon sürecini detaylıca incelemeyi kolaylaştırır.

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Daha fazla video keşfet