Name: Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Öğrenin, fare peritoneal makrofajlarının fagositoz yeteneğini EGFP ifade eden Escherichia coli kullanarak değerlendirmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem. Bu protokol doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonlarını incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser desteklenen Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (no. 31800046) ve Liaoning Eyaleti doğal Bilim Vakfı (no. 20170540262). Bu eser, ikinci hastane Dalian Tıp Üniversitesi Bilimsel Araştırma Merkezi laboratuarlarında başarılı oldu. Yazarlar Xiao-Lin Sang akış sitometresi ile yardımını ve Bo Qu ve Dong-Chuan Yang video üretiminde onların yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm yordamları ulusal kurumları, sağlık kuralları altında bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının için yapıldı ve iletişim kurallarını hayvan bakım ve kullanım Komitesi Dalian Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aylık (vücut ağırlığı 30-35 g ile) on altı ve sekiz haftalık (20-25 g) SPF (özel-patojen-ücretsiz) erkek C57BL/6 fareler Dalian Tıp Üniversitesi SPF hayvan Merkezi'nden elde. Bütün fareler yiyecek ve su ad libitumiçin hayvan konut erişimli tutuldu. 20-24 ° C sıcaklık tutuldu, nem % 40-% 70, ve aydınlatma 12 saat ışık/12 h karanlık oldu. Hayvanlar çevreye en az 7 gün önce deney alışmana izin verildi.
1. evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid ve indüksiyon EGFP ifade inşaatı
<ol><li>EGFP gen parça sentez (özel gen sentez hizmeti tarafından sentezlenen bir 717 bp bkz: sıra Tablo malzeme ve ek dosya 1 için sıra) ve parçası ile ileri astar (yükseltmek 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') ve ters astar (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), yüksek sadakat Taq DNA polimeraz kullanarak.</li>
	<li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünleri adenin çıkıntılar tek 3' TA bir sonraki adımda klonlama için olması için son döngüsü sonra ( ek dosya 1 için PCR koşullara bakınız) 72 ° C'de 30 dk uzantısı kullanın. PCR ürünü özel jel elektroforez tarafından kontrol edin.</li>
	<li>PCR ürünü evde beslenen hayvan-SUMO vektör clone ( Tablo malzemelerigörmek) Yöntem5 T4 DNA ligaz ile klonlama TA kullanarak. Reaksiyon, oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dk için kuluçkaya. Vektör 653-654 1 bp 5't-çıkıntı her iplikçikteki ile nükleotit arasında Doğrusallaştırılmış.</li>
	<li>Tüp ligasyonu ürün kimyasal olarak yetkili BL21(DE) e.coli suşu aşağıdaki gibi dönüşümü: 5 µL ekleyin (100 ng) için BL21(DE) yetkili hücre 90 için 42 ° C'de ısı şoku üzerinden 100 µL PCR ürünün s; 3 dakika buzda karışımı tutmak ve sonra lysogeny suyu (LB) orta 1 h 37 ° C'de ve 120 rpm sallıyorum 37 ° C'de ısıtılmış 400 µL ekleyin.</li>
	<li>EGFP ifade zorlanma verimli 100 µL uyarıcı laktoz (0.5 mmol/L), bir LB-sefaloridin (100 µg/mL) plaka yüzeyine bakterilerin aşılamak. 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya. Not: Eğer EGFP başarılı bir şekilde ifade, bazı koloniler karanlıkta parlayan yeşil ışık olarak görülebilir.<ol>
<li>İsteğe bağlı olarak, koloniler DNA sıralama tarafından eklenen EGFP parçası doğrulamak için seçin. DNA sıralama için astar vardır: ileri, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; geri, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL LB orta 100 µg/mL sefaloridin ile de içine pozitif bir koloni aşılamak. 37 ° c için 2 h, 120 RPM kuluçka sallayarak kuluçkaya, uyarıcı laktoz 0.5 mmol/L son bir konsantrasyon için eklemek ve 6 h EGFP ifade inducing titremeye devam. Ampirik olarak, ne zaman 6 h, 600 optik yoğunluk için sallayarak nm (OD600) 0,7 ulaşmak veya daha yüksek.</li>
	<li>10 µL bakteri kültürü orta bir slayda eklemek, bir coverslip ile kapak ve EGFP ifade bir ters floresan mikroskop altında incelemek. EGFP ifade etmek bakteri Orta 2-8 ° C'de birkaç hafta süreyle saklanabilir.</li>
</ol>2. fare peritoneal makrofaj yalıtım ve birincil kültür
<ol><li>Thioglycolate 3.5 g 100 ml distile su ve basınçlı kap kısırlık kullanmadan önce karışıma ekleyin. Thioglycolate orta fare peritoneal enjeksiyon için başlıklı 1 mL steril enjektör içine pompa. Şırınga başına bir fare bulaşmasını önlemek için kullanın. Thioglycolate kullanımı makrofajlar sayısını artırabilirsiniz. İkamet periton makrofajlar ayrılmış olabilir olmadan thioglycolate ama alt ile makrofaj verir.</li>
	<li>Yerel hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanarak fare anestezi. 1 mL % 3,5 thioglycolate orta fare periton boşluğuna 23 G iğne kullanarak 1 mL şırınga ile enjekte et. Not: Anestezi inducing, periton enjeksiyon kolayca gerçekleştirilebilir ve iğne ile neden iç organlarına yaralanma riskini azaltır.</li>
	<li>Fare ile su ve yiyecek ad libitum 3 gün boyunca korumak. Hayvan vücut ağırlığı ve gıda alımı her gün izlemek. Vücut kilo kaybı 3 gün içinde 10 %'den büyük ise, hayvan deneyden hariç.</li>
	<li>3 gün sonra hızla sevoflurane kapalı bir kutu içinde tarafından anestezi inducing sonra servikal çıkığı tarafından fare ötenazi. Alternatif olarak, fare ötenazi yapmak yerel hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanın.</li>
	<li>Sterilize etmek için % 75 etanol ile fare (10 cm çaplı) bir çanak içine koymak ve hızlı bir şekilde başlık için transfer. Fareyi bir tabağa yerleştirin ve farenin konumunu düzeltmek için yönetim kurulu için ön pençe pin.</li>
	<li>Bir 20 G bağlı 5 mL şırınga kullanarak iğne iğne eğimi 30 ° - 40 ° açıyla yerleştirilmesi, 5 mL soğuk (4-10 ° C) fosfat tamponlu tuz (PBS) alt karın fare periton boşluğuna, bağırsak delinme kaçınarak enjekte et. Bağırsak (veya herhangi bir diğer organ) delinmiş, bu birincil hücre kültürü için uygun olmayan hücreler etkinleştirmek gibi fare ile hücreler artık deneyler için kullanılabilir.</li>
	<li>Hafif bir masaj fare karın iki kenarı da gerçekleştirin. Sonra yavaşça ve yavaş yavaş sıvı Aspire edin. Peritoneal sıvı bir 50 mL santrifüj tüpüne dağıtmak. Bunlar 2 x veya 3 x adımları yineleyin.</li>
	<li>Askıya alınan hücreler için Soğutmalı Santrifüj (4-8 ° C) 400 x g , 10 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet RPMI 1640 orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile resuspend. Hücreleri saymak. Hücreleri 10 mL orta resuspended zaman ampirik olarak, hücre yoğunluğu yaklaşık 5 x 106 hücre/mL için eşittir.</li>
	<li>6-şey plaka akış sitometresi tahlil ve floresan mikroskop için 24-şey plaka kuyuya başına 5 x 105 hücre için her kuyuya 5 x 106 hücreler ekleyebilirsiniz. %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler gecede kültür. Kültür orta çünkü en-in bunlar lenfositleri nonadherent hücre kaldırmak için 3 saat sonra yenilenmesi. Esas olarak makrofajlar yapisan hücrelerdir ve de doku kültürü tedavi edilen plastik için uygun.</li>
</ol>3. makrofaj fagositoz tahlil floresan mikroskop kullanarak
<ol><li>Hücreleri hücre canlılık ve hücre yoğunluğu değerlendirmek için bir alan parlak mikroskop altında gözlemlemek.</li>
	<li>Kültür orta 24-şey plaka kaldırın. Tablo 1' de açıklandığı gibi her kuyuya 100 µL taze kültür ortamının ve bakteriyel süspansiyon (yaklaşık 2 x 107 hücreleri), 10 µL ekleyin. Bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Yavaşça noninternalized bakterileri yıkamak için iyi başına 3 x-5 x 500 µL soğuk PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS içinde % 4 formaldehit, oda sıcaklığında 30 dk için hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>Sabit hücreleri 3 yıkama x PBS ile (500 µL/de).</li>
	<li>Phalloidin 633 floresans 200 µL boya konjuge çalışma çözüm ekleyin (F-aktin leke Malzemeler tablobkz:). Bir yerde saklayın karanlık, nemli (% 60-%80) 60 dakika süreyle oda sıcaklığında durulama hücreleri 3 x PBS ile (500 µL/herhangi bir aşırı phalloidin kaldırmak için de). F-aktin boyama tarafından sitoplazma özetlenen ve içselleştirilmiş bakteri ayırt etmek için yardımcı olur.</li>
	<li>Hücre çekirdeği leke ve oda sıcaklığında karanlık, nemli bir yerde 5 min için kuluçkaya için DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) çalışma çözüm (1 µg/mL) 200 µL ekleyin. 1 x PBS ile yıkayın (500 µL/de) ve aynı birimin distile su ile 1 x. Sonra hücreleri bir ters floresan mikroskop altında gözlem için hazır olacak.</li>
</ol>4. makrofaj fagositoz tahlil akış sitometresi kullanarak
<ol><li>Deneysel hatalarını en aza indirmek ve sonuçları doğru biçimde yorumlayabilmek yapmak, gruplarını ayarlamak ve tüpler deneme için Tablo 2' de listelenen denetlemek için.<ol>
<li>Kontrol grubu için hangi buz ( Tablo 2Grup 4) üzerinde yer alacak, orta 6-şey plaka çıkarın ve temizleyin PBS ile 1 x. Daha sonra 1 mL soğuk 70 mM EDTA hücreleri ayırmak ve akış sitometresi tüp aktarmak için kuyunun içine ekleyin. Bakteriyel süspansiyon 50 µL tüpün içine ekleyin ve buz 1 h için yerleştirin.</li>
		<li>Diğer grupları için kültür orta kaldırın. 1 mL taze orta her kuyunun içine ekleyin. Bakteriyel süspansiyon 50 µL içine kuyu grubu ayarına göre Tablo 2' de açıklandığı gibi ekleyin. O zaman, 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka 1 h için 6-şey plaka yer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan noninternalized E. coligidermek için 200 µL % 0.8 kristal violet (CV) su çözüm kuyunun içine ekleyin ve kısa bir süre, böylece bir yanlış pozitif sonuç yüzeyine EGFP ifade E. coli bağlama tarafından kaçınarak sway makrofajlar ama değil içselleştirilmiş. 3 hücreleri yıkama x herhangi bir kalıntı CV kaldırmak için PBS ile.</li>
	<li>Daha sonra 1 mL soğuk 70 mM EDTA hücreleri ayırmak ve akış sitometresi tüp aktarmak için kuyunun içine ekleyin.</li>
	<li>400 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>PBS hücreleri resuspend 100 µL ekleyin. F4/80-PE-Birleşik antikor (fare makrofajlar ifade bir yüzey antijeni) 5 µL grubu ayarına göre tüpler veya kullanım Igg2a-PE izotip, ekleyin. Kısaca girdap ve 5-10dk karanlıkta buz üzerinde örnekleri kuluçkaya.</li>
	<li>PBS 1 mL her tüpün içine ekleyin ve 5 dakika süreyle 400 x g , santrifüj süpernatant atın. Hücre topakları PBS Akış Sitometresi Analizi için 200-300 µL ile resuspend. Her tüpün çalıştırın ve en az 10,000 olayları F4/80+ hücre için veri elde etmek.</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı adımda oldukça basit ve anlaşılır. Bir kritik adım E. coliEGFP ifade teşvik etmektir. Genellikle, bir gen Ökaryotlar, EGFP gibi gelen prokaryot E.coli olarak ifade etmek için planlanan tarihte protein'ın doğal yapısı ve faaliyet değişiklikleri protein etkin olmayan toplamları (dahil organları), oluşturacak bir risk olduğunu. Evde beslenen hayvan-SUMO vektör kullanarak ve evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid oluşturmak yoluyla, EGFP-SUMO füzyon protein başarıyla ifade ve ışık sinyali...

Makrofaj fagositoz deneyleri genellikle doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu incelemek için kullanılır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı enfeksiyon duyarlılık gösterebilir. Makrofaj hücre satırları İmmünoloji çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Ancak, genişletilmiş geçit gen kaybına neden olabilir ve bu hücre satırları bağışıklık fonksiyonlarında tehlikeye. Böylece, birincil periton makrofaj hücre işlevi1eğitim ideal nesneyi vardır.
Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı yaşlı gövdesine sağlam olduğu düşünülüyordu rağmen fagositik yeteneği ile karşılaştırıldığında daha genç içinde2,3vücut düşebilir. Burada, biz genç (sekiz-hafta-yaşlı) ve uygun, hızlı ve ekonomik olarak mümkün olan EGFP ifade E. coli, kullanarak (16-ay-yaşlı) yaşlı fare peritoneal makrofajlar fagositoz değerlendirmek için bir yöntem gösterecektir.
Çünkü bu bakterilerin stabildir ve sonra bile makrofajlar %4 (w/v) paraformaldehyde tarafından giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntülemek bir EGFP ifade e.coli suşu kullanımı bu tahlil avantajlarından biridir. Ayrıca, E. coliEGFP ifade kullanarak, araştırmacılar gerek yok daha fazla zaman kazandırır fagositoz sonra boyama. Ayrıca, makrofajlar immunoresponsive E. coli yüzey antijeni, E. coli EGFP ifade mantarlar veya floresein etiketli boncuk kullanarak daha fagositoz tahlil için daha uygun yapmak için vardır.
EGFP ifade E. coliile fagositoz tahlil kolayca 2 h başarılı ve her iki akış sitometresi ve floresan mikroskopisi, araştırmacı amaca bağlı olarak tarafından ölçülür. Bu yöntem, doğrudan fagositik yeteneğini ölçer beri daha dolaylı diğer yöntemlerden daha tekrarlanabilir sonuçlarıdır.
Bu yöntem aynı zamanda bir RAW264.7 hücre kültürünü doğrulandı ve4insan periferik kan mononükleer hücreler. Aşağıdaki metin bu tahlil gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım yönergeler sağlar ve araştırmacılar deneyleri ihtiyaçlarını karşılamak üzere değiştirebilecek kritik adımlar vurgular.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences-Biotin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-fare CD16/32 Antikor</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Şampiyon pET SUMO Protein Ekspresyon sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Özel Gen Sentezi Hizmeti</td><td>Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE anti-fare antikoru FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B & nbsp; Ters Mikroskop</td><td>Leica Microsystems-PE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sıçan IgG2a, &kappa;-izotip kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin 633 floresan boya konjuge çalışma çözeltisi</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoglikolat ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

yeşil floresans protein-ifade gelişmiş kullanma fare peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için escherichia coli

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Bu el yazması fagositoz tahlil gerçekleştirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanır. Bu yöntem ilk bölümünde bir evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP vektör yapı içerir (SUMO küçük Ubikuitin benzeri değiştirici =) ve ifade gelişmiş yeşil floresans protein Escherichia coli (BL21DE) (EGFP). E. coli EGFP ifade ile makrofajlar 37 ° C'de 1 h için coincubated; negatif kontrol grubu aynı süre için buza inkübe. O zaman, makrofajlar değerlendirmesi için hazırsınız demektir. Bu teknik avantajları, basit ve kolay adımlar içerir ve fagositoz her iki akış sitometresi ve floresan mikroskop tarafından ölçülebilir. EGFP ifade E. coli stabildir ve sonra bile makrofajlar paraformaldehyde ile giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntüler. Bu yöntem yalnızca makrofaj hücre hatları veya birincil makrofajlar in vitro olarak değerlendirilmesi için uygun ama ayrıca periferik kan mononükleer hücrelerinde granülosit ve monosit fagositoz değerlendirilmesi için uygun değildir. Sonuçları genç (sekiz-hafta-yaşlı) fareler gelen periton makrofajlar fagositik kapasitesini makrofajlar yaşında (16-ay-yaşlı) fareler dan daha yüksek olduğunu gösteriyor. Özet olarak, bu yöntem makrofaj fagositoz ölçer ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi işlevi çalışmak için uygundur.

Evde beslenen hayvan-SUMO vektör yerli protein ifade E. coliizin vermek için küçük bir Ubikuitin benzeri değiştirici kullanır. SUMO füzyon kolayca algılanabilmesini sağlayan EGFP çözünürlük önemli ölçüde artırılabilir. EGFP ifade başarıyla laktoz tarafından indüklenen, yeşil kolonileri karanlıkta (Şekil 1A) görülebilir. E. coliEGFP ifade temsil, yeşil noktalar 40 x objektif lens (Şekil 1B) kullanarak bir floresa...

Burada, fare peritoneal makrofaj fagositoz gelişmiş yeşil floresans Escherichia coliprotein ifade kullanarak değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Bu protokol, EGFP ifade eden Escherichia coli kullanarak makrofajların fagositoz yeteneğini değerlendirmek için basit ve üredüzebilir bir yöntem göstermiştir. Merhaba, benim adım Dalian Tıp Üniversitesi'nden Jun-Yu. Bugün size kolay ve iki saat içinde kolayca yapılabilecek makrofaj fagositoz değerlendirmek için yol görselleştirmek için gidiyoruz.Bu yöntem doğuştan gelen immün fonksiyon çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. Bu doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu yaşlılarda bozulmadan kaldı inanılmaktadır. Bugün, yaşlı ve genç farelerden periton makrofajlarını izole edeceğiz ve bu iki grubun fagositik yeteneğini göreceğiz.Hadi başlayalım. İlk olarak, EGFP gen parçasını sentezleyin ve yüksek sadakatli Taq DNA polimeraz kullanarak parçayı klonla. Daha sonra PCR ürünlerini pET SUMO vektörüne dönüştürün.Üçüncü olarak, e.coli suşu içine ligasyon ürünleri dönüştürmek ve laktoz ile ifade EGFP neden. Bu EGFP ifade E.coli fagositoz tofmu için belirteç olarak görev yaptı. Daha sonra, bir fare periton makrofajlar izole edildi ve kültürlü.Daha sonra, EGFP ifade E.coli 37 santigrees bir saat makrofajlar ile coincubated edildi. Söndürme adımından sonra makrofajlar hem floresan mikroskobu hem de akış sitometresi ile değerlendirilmeye hazırdı. EGFP gen parçasını sentezleyin ve yüksek sadakatli Taq DNA polimeraz kullanarak ileri ve ters astarlarla parçayı yükseltin.PCR ürünlerinin bir sonraki adımda TA klonlama için tek üç uçlu adenin çıkıntılara sahip olduğundan emin olmak için, son döngüden sonra 72 santigrat derecede 30 dakikalık bir uzatma önerilir. AGAROSE jel elektroforez ile PCR ürün kontrol edin. Eğer parça doğru bir şekilde güçlendirilmişse, jel üzerinde 717 bp bandı gözlemlenebilir.T4 DNA ligaz ile TA klonlama yöntemini kullanarak PCR ürünlerini pET SUMO vektörüne kopyala. Reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. BL21 yetkili hücrelerin 100 mikrolitre içine PCR ürün beş mikrolitre ekleyin.Isı hücreleri 42 derecede 90 saniye boyunca şok eder, sonra karışımı üç dakika buzda tutar. Lb orta 400 mikrolitre ekleyin, önceden ısıtılmış 37 santimetre centigrees. 37 derece centigrees ve 120 rpm bir saat sallayarak.Vektöre dönüştürülmüş E.coli'yi taramak için bakterileri mililitre kanamisin başına 100 mikrogram ile LB plakayüzeyine aşılayın. Tabağı bir gecede 37 derece lik fırında kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, mililitre kanamisin başına 100 mikrogram ile LB medya beş mililitre içine pozitif bir koloni aşılamak.37 derece centigrees iki saat boyunca 120 rpm inkübatör sallayarak kuluçka. Sonra litre başına 0.5 milimol son konsantrasyonuna indükleyici laktoz ekleyin ve altı saat sallayarak devam, EGFP ifade indükleyen. Ampirik olarak, altı saat sallayarak, OD600 0.7 veya daha yüksek ulaşabilir.Son olarak, EGFP ifade ölçüde doğrulamak için floresan mikroskop kullanarak. Bir slayt için bakteri kültürü orta 10 mikrolitre ekleyin. Sonra bir kapak fişi ile kaplayın.Floresan mikroskobu altında EGFP ifadesini inceleyin. 100 mililitre distile suya 3,5 gram tiyoglikolat ekleyin. Kullanmadan önce otoklavda sterilize edin.Tioglikolat ortasını kaputtaki bir mililitrelik steril şırıngaya aspire edin. Enfeksiyonönlemek için şırınga başına bir fare. Fare periton boşluğuna 23 kalibrelik bir iğne kullanarak bir mililitre 3,5 tioglikolat ortası enjekte edin ve fareyi üç gün boyunca su ve gıda reklamı libitum ile koruyun.Üç gün sonra, hızlı bir şekilde kapalı bir kutuiçinde sevofluran e-posta ile anestezi indükledikten sonra servikal çıkış ile fare ötenazi. Sonra, steril ve hızlı bir şekilde kaputa aktarmak için% 75 etanol ile bir çanak içine fare koyun. Fareyi plakaya yerleştirin ve farenin konumunu düzeltmek için ön pençeyi tahtaya sabitle.20-gauge iğne ile beş mililitrelik şırınga kullanarak, fare periton boşluğuna alt karın soğuk PBS beş mililitre enjekte, bağırsak delinme kaçınarak. Fare karnının iki tarafına hafifçe masaj yapın. Sonra yavaşça ve yavaşça karın sıvısı aspire.Periton sıvısını 50 mililitrelik bir santimetrelik tüpe dağıtın. Bu adımları iki veya üç kez tekrarlayın. Askıda hücreleri 4-8 santigrat derece400 g 10 dakika santrifüj.Supernatant atın ve% 10 fetal sığır serumu ile RPMI 1640 orta hücre pelet resuspend. Akış sitometri sitometri satometri satomu ve floresan mikroskobu için 24 iyi plaka içine iyi başına 500.000 hücre için altı iyi plaka her kuyuya beş milyon hücre ekleyin. Kültür hücreleri 37 derecede bir gecede %5 karbondioksit kuvözde.Bunların çoğu lenfositler olduğu için kültür ortamı nonadherent hücreleri kaldırmak için üç saat sonra yenilenebilir. Hücre canlılığını ve hücre yoğunluğunu değerlendirmek için hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Burada gösterilen görüntü birincil hücrenin normal durumundaydı.Periton hücrelerinin büyük bir kısmı lenfositler olduğu için genellikle makrofaj hücre yoğunluğu yüksek değildi. Kültür ortamını 24 kuyulu plakadan çıkarın. Taze kültür orta 100 mikrolitre ve bakteriyel orta 10 mikrolitre ekleyin.Sonra plakayı 37 derecede bir saat boyunca %5 karbondioksit kuvözde kuluçkaya yatırın. İçselleştirilmeyen bakterileri temizlemek için her kuyuda 500 mikrolitre soğuk PBS ile 3-5 kez hafifçe yıkayın. Hücreleri PBS'de %4 formaldehit ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. F-aktin lekepoid 633 eşleyolnize çalışma solüsyonu ekleyin. 60 dakika oda sıcaklığında karanlık ve nemli bir yerde saklayın.Hücre nükleer leke VE oda sıcaklığında karanlık bir yerde beş dakika kuluçka IÇIN DAPI çalışma solüsyonu ekleyin. Bir kez PBS ile durulayın ve bir kez distile suda aynı hacimde. Yeşil renkte görüntülenen EGFP ifade eden E.coli fagositozun belirteci olarak görev yaptı.Deneysel hataları en aza indirmek ve sonuçların doğru yorumlanmasını sağlamak için, tablo 2'de listelenen deney için gruplar ve kontrol tüpleri ayarlayın. Buzun üzerine yerleştirilecek kontrol grubu için, ortayı altı kuyulu plakadan çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın. Sonra hücre ayırmak ve akış sitometri tüpü içine aktarmak için kuyuiçine litre soğuk EDTA bir mililitre başına 70 milimole ekleyin.Tüpiçine 50 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin. Diğer gruplar için, kültür ortamı kaldırmak, her kuyuya bir mililitre taze orta ekleyin. Tablo ikide açıklandığı gibi grup ayarına göre kuyulara 50 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin.Sonra bir saat için 37 derece centigrees% 5 karbondioksit inkübatör altı iyi plaka yerleştirin. İçselleştirilmeyen E.coli floresansını gidermek için, kuyuya 200 mikrolitre %0,8 kristal menekşe su çözeltisi ekleyin ve kısa bir süre sallayın. Bu adım, makrofajların yüzeyine bağlanan ancak içselleştirilen EGFP E.coli tarafından yanlış pozitif sonuçları önlemek amacıyla tasarlanmıştır.Herhangi bir kalıntı kristal menekşe kaldırmak için PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Sonra hücre ayırmak ve akış sitometri tüpü içine aktarmak için kuyuiçine litre soğuk EDTA bir mililitre başına 70 milimole ekleyin. Tüpleri santrifüj 2, 000 rpm beş dakika ve supernatant atın.Hücreleri yeniden askıya almak için 100 mikrolitre PBS ekleyin. Grup ayarına göre tüplere veya isotiplere beş mikrolitre F4 ATP konjuge antikor ekleyin. Girdap kısaca ve karanlıkta 5 ila 10 dakika buz üzerinde örnekleri kuluçka.Her tüp ve santrifüj içine bir mililitre PBS ekleyin 2, 000 rpm beş dakika. Supernatant atın. Akış sitometri analizi için 200 ila 300 mikrolitre PBS ile hücre peletlerini yeniden askıya alın.Her tüpü çalıştırın ve F4/80 pozitif hücrelerin en az 10.000 olayı için veri elde edin. Burada genç ve yaşlı gruplardan periton makrofajlar floresan görüntüleri vardır. Kırmızı floresan F-aktin'i temsil eder.Yeşil, EGFP ifade eden E.coli'yi, mavi ise DAPI tarafından boyanmış çekirdeği temsil eder. Bu görüntüler, genç fareden gelen makrofajların yaşlı fareden daha güçlü fagositik bir yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir. F4/80-pozitif ve EGFP pozitif hücreler makrofajların fagositik yeteneğini gösterdi.Bu sonuçlar floresan mikroskop sonuçları nın eğilimi ile tutarlıdır. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin sayısı yaşlı farede korunsa da fagositik yetenek genç fareye göre önemli ölçüde azaldı. Makrofaj fagositözün değerlendirilmesinde birçok yöntem kullanılmıştır.Burada uygun, hızlı ve ekonomik açıdan uygun geliştirilmiş bir yöntem gösteriyoruz. EGFP ifade eden E.coli ile fagositoz tetkik, araştırmacının tercihlerine göre hem akış sitometresi hem de floresan mikroskop ile kolayca yapılabilir ve ölçülebilir. Ayrıca bu yöntem doğrudan fagositik yeteneğini ölçer.Sonuçlar diğer dolaylı yöntemlere göre daha çoğaltılabilir.

using-enhanced-green-fluorescence-protein-expressing-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme...

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Makrofajlar uzun doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Makrofajlar ve mikrop arasındaki etkileşimin, evrimsel genetik ve biyokimyasal yönleri ile ilgili bilginin son patlama makrofajlara bilimsel ilgi yenilenmiştir. Bu makalede, fare kemik iliği makrofajları ayırt etmek için bir yöntem tarif edilir.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Bir fare modeli enterohemorrhagic bioluminescence etiketli bakteri kullanarak E. coli (EHEC) kolonizasyon için detaylı bir protokol sunulmuştur. Kollarındaki bu bakteriler tarafından bir non-invaziv görüntüleme sistemi içinde canlı hayvan vivo içinde tespiti geçerli anlayışımız EHEC kolonizasyon ilerletebilirsiniz.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Makrofajlar, özellikle birincil makrofajlar, kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşdıkları için transfect yapmak zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile birincil makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Öğrenin, fare peritoneal makrofajlarının fagositoz yeteneğini EGFP ifade eden Escherichia coli kullanarak değerlendirmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem. Bu protokol doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonlarını incelemek için değerlidir.

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

Daha fazla video keşfet