Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlanmasını geliştirmek için, örneğin anizotropi ölçümlerini kullanarak dissosilasyon sabitlerini büyük ölçekte ölçmek için bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, yüksek hassasiyetle dissosyasyon sabitini belirlemek için otomatik olarak tam titrasyon eğrilerinin elde edilmesine olanak sağlar. Bu denge de çözüm çalışır, orta iş hacmi ve büyük dinamik aralığı vardır.

Transkripsiyon faktörlerinin bağlayıcı afiyet incelik lerini iyileştirmek için HiP-FA uyguladık. Ancak protokol, örneğin protein-protein veya protein-ilaç etkileşimleri gibi diğer bağlayıcı olaylara uygulanabilir. Ölçümlerin tekrarlanabilirliği hakkında bir tahmin almak için önce aynı bağlama ortaklarıyla birden fazla titrasyon gerçekleştirmenizi tavsiye ederim.

Varsa, daha da iyi bir reducibility için otomatik bir sistem kullanın. Referans DNA'nın DNA oligomerlerini tavlamak için, her on milimolar di-etiketli ileri ve etiketsiz ters iplikçik bir tüp içinde yedi mikrolitre karıştırın. Rakip DNA için, her 100 milimolar etiketsiz iplikçik 20 mikrolitre 96 kuyu pcr plaka iki kuyu içine karıştırın.

Daha sonra, DNA çözümlerini üç dakika boyunca 70 santigrat dereceye ısıtmak için standart bir PCR makinesi kullanın. Daha sonra, saniyede 0,1 santigrat derece hızında oda sıcaklığına düşürün. 100 mililitre bağlayıcı tampon 0,5 gram agarose eritmek için bir mikrodalga fırın kullanın.

Olası buharlaşmayı telafi etmek için son hacmi ayarlamak için çift distile su ekleyin. On mililitrelik hisse senedi aliquots hazırlayın. 96 kuyu plakasının titrasyon ve kalibrasyon kuyularını hazırlamak için iki jel stok aliquot'u 75 derece lik bir inkübatör çalkalayıcısına aktarın.

Her titrasyon için iyi, referans DNA 1.4 nanomols ekleyin, transkripsiyon faktörü protein, 20-60 nanomols son konsantrasyonunda, 0.2 milimolar DTT, ve erimiş jel 240 mikrolitre bağlayıcı tampon. Tüpü ters çevirerek ve sallayarak iyice karıştırın. Daha sonra, yavaş yavaş pipet 96 kuyu plaka belirlenen titrasyon kuyularında DNA içeren jel kuyu başına 200 mikrolitre.

Her kalibrasyon için iyi, erimiş jel 240 mikrolitre 5 nanomoles nil mavisi boya ekleyin. Hava kabarcıkları kaçınarak, yavaş yavaş pipet 200 96 kuyu plaka beş ila altı kuyularda boya içeren jel çözeltisi mikrolitre. Jeli mükemmel yatay bir yüzeye yerleştirin ve oda sıcaklığında on dakika, 4 santigrat derecede ise 10 dakika kuluçkaya yatırın.

Plakanın farklı kuyularında jel yüksekliği düzeylerinin homojenliğini kontrol etmek için çok iyi bir plaka okuyucu kullanın. Rakip DNA çözeltisini hazırlamak için, önce etiketli referans DNA, protein ve üç kat konsantre bağlayıcı tamponu birleştirin. Daha sonra, çözeltinin 20 mikrolitresini, her biri için 40 mikrolitre olan anneleştirilmiş rakip DNA çözeltilerinin her biriyle karıştırın.

Her kalibrasyon için iyi, annealed rakip DNA çözeltilerinden biri ve 15 milimolar nil mavisi boya çözeltisi içeren üç kat konsantre bağlayıcı tampon uygun miktarda birleştirir. Son olarak, mümkün olduğunca aynı anda jellerin üstüne karışık rakip çözümler50 mikrolitre ekleyin. Görüntü edinimi başlatmak için, mikroskop aşamasında 96 kuyu plaka yerleştirin.

Daha sonra, referans DNA'dan proteinin tamamen bağlanmadan kadar kuyuların Z-yığın görüntüleri zaman serisi almak. El yazmasına göre titrasyon tahsinini yapın. Ardından, tek tek rakip dizileri için titrasyon eğrileri oluşturmak için HiP-FA yazılımLarını kullanın.

Daha sonra, ayrışma sabiti ve her titrasyonda aktif protein konsantrasyonunu elde etmek için dışa aktarma düğmesini tıklatın. Viskoz jel çözeltileri pipetting zaman özel dikkat edin. Yanlış pipetleme, dissosilasyon sabitlerinin belirlenmesi için doğruluğunu düşürebilir.

Bu çalışmada, B-sıkıştırılmış transkripsiyon faktörünün DNA bağlayıcı tercihlerini belirlemek için HiP-FA yöntemi uygulanmıştır. Dev, sinek segmentasyon gen ağından. PWM'nin el ile veya otomasyon teknikleri kullanılarak hazırlanan çoğaltmalar için yüksek benzerliği HiP-FA yönteminin yüksek tekrarlanabilirliğini göstermiştir.

PWM bu yöntem ve diğer yöntemlerle elde edilen genel benzer. Ancak, mutasyonların ya tam bağlanma kaybına ya da önceki ölçümlere göre çok daha güçlü bağlayıcıya yol açabileceği çekirdek motifinin iki ve yedinci pozisyonlarında önemli sapmalar görülebilir. HiP-FA'yı onlarca transkripsiyon faktörünün ciltlemeleri için iyileştirmeler oluşturmak için kullanıyoruz ve bu, sonunda verilerin daha iyi tahmin edilmesine neden olduğunu gösteriyor.

TF-DNA'nın tüm sistem için veya her türlü etkileşim için daha iyi anlaşılması için yüksek doğruluk ölçüsünün çok yararlı olabileceğine inanıyoruz.