Name: Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Öğrenin Aeromonas enfeksiyonlarının patojenitesini ve virülansını Caenorhabditis elegans modeli kullanarak değerlendirme yöntemlerini. Bu teknik, bakteri türleri arasındaki toksisite farklılıklarını incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tayvan ve tanılama Mikrobiyoloji için C. elegans çekirdek tesisinden yardım için minnettarız ve antimikrobiyal direnç laboratuvar, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Aeromonas sağlamak için hastane izole ediyor. Ayrıca Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC) ve WormBase kabul edersiniz. Biz de Savana Moore el yazması düzenleme için teşekkür ederiz.
Bu çalışmada kısmen Bilim Bakanlığı ve Tayvan teknoloji (en 105-2628-B-006-017-MY3) ve Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi (NCKUH-10705001) dan gelen hibe için P.L. Chen tarafından desteklenmiştir.

1. kültür orta hazırlanması
Not: Bkz. Tablo 1 için çözüm hazırlık.
<ol><li>M9 orta12hazırlamak için KH2PO41.5 g, 5.66 g Na2HPO4ve NaCl 2.5 g 500 mL deiyonize su içinde çözülür. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de oda sıcaklığına soğutmalı kadar bekleyin ve sonra 0.5 mL 1 M MgSO4 ilk kullanımdan önce ekleyin.</li>
	<li>Nematot büyüme orta (NGM)12hazırlamak için 3 g NaCl, 2.5 g bakteriyel pepton ve 1 litre deiyonize su 20 g agar geçiyoruz. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de soğutmalı su banyosu içinde 55 ° c kadar bekleyin ve sonra 1 mL 1 M CaCl2, 1 M MgSO41 mL, 1 mL etanol içinde %5 kolesterol ve fosfat tampon 25 mL ekleyin. Girdap iyice karıştırın.</li>
	<li>Yaklaşık 5 mL NGM içine her 6 cm Petri kabına dökün. Yüzeyde kabarcık üretimini plaka kaçının. Tabaklar, oda sıcaklığında 1 gece ve 4 ° C'de kaydetmek için paketi için bırakın Kullanmadan önce oda sıcaklığına getir.</li>
	<li>Zenginleştirilmiş NGM (ENOA) hazırlamak için 3 g NaCl, 5 g bakteriyel pepton, 1 gr maya özü ve 1 litre deiyonize su 30 g agar geçiyoruz. Otoklav 20 dakika süreyle 121 ° C'de soğutmalı su banyosu içinde 55 ° c kadar bekleyin ve 1 mL 1 M CaCl2, 1 M MgSO41 mL, 1 mL etanol içinde %5 kolesterol ve fosfat tampon 25 mL ekleyin. Girdap iyice karıştırın.</li>
	<li>Yaklaşık 10 mL ENOA içine her 9 cm Petri kabına dökün. Yüzeyde kabarcık üretimini plaka kaçının. Tabaklar, oda sıcaklığında 1 gece ve 4 ° C'de kaydetmek için paketi için bırakın Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirmek.</li>
	<li>S orta12hazırlamak, 40 mL S bazal, 0.4 mL 1 M Potasyum sitrat karıştırmak için 0.4 mL izleme çözümü, 1 M CaCl2, 1 M MgSO40.12 mL, %5 kolesterol etanol içinde 40 µL 0.12 mL ve 1 mL 8 mm FudR kullanmadan önce metal.</li>
</ol>2. C. elegans6,9,12 eşitlenmesi
<ol><li>Yaklaşık 2000 solucanlar yetişkin gravid sahne 10 mL 15 mL tüp içinde steril deiyonize su ile yıkayın. Bakteri 3 x, solucanlar tüpün dibinde tutmak dışarı yıkamak.</li>
	<li>Örnek için solucanlar çekmek için 500 x g , 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın ve solucanlar 3,5 mL deiyonize su tutun.</li>
	<li>1 mL NaOCl (10-%15) ve 0.5 mL 5 M KOH tüp içine ekleyin. Mix eşit sallayarak için < solucan cesetleri koşullar için 6 dakika.</li>
	<li>Yumurta solucanlara salınır sonra lizis durdurmak için 10 mL deiyonize su ekleyin. Yumurta çekin ve süpernatant mümkün olduğu kadar kaldırmak için 1200 x g , 1 dk santrifüj. 15 mL M9 orta en az 3 x ile yıkayın. Not: adım 1.1 M9 orta bileşimi için bkz.</li>
	<li>Yumurta 1 mL M9 ortamda tutmak. 3.5 cm çanak için bir gece (yaklaşık 12-18 h) 20 ° C'de kuluçka yumurta taşıma. Not: kuluçka sonra ilk larva (L1) sahne adlandırılan larva solucan için yumurtalar çatlar.</li>
	<li>Pipet L1 Worms M9 orta 10 µL dışarı. Solucan sayar ve L1 konsantrasyonu M9 ortamda solucanlar hesaplayın.</li>
	<li>Tohum en az 10.000 Escherichia coli OP50 ile yayılmış 9 cm ENOA plaka üzerinde bir damlalıklı ile L1 sahne solucanlar inkübe.<ol>
<li>Bu adımda, formanın 0.5 mL gecede E. coli OP50 9 cm ENOA plaka üzerinde Luria-Bertani (LB) et suyu ile kültürlü. 16-18 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya Not: kirlenmesini önlemek için Yayilim adım laminar akış mahallede yapılmalıdır.</li>
		<li>L1 solucanlar tohum önce oda sıcaklığına kadar serin. Tohum en az 10.000 L1 sahne solucanlar ENOA plaka E. coli OP50 ile inkübe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 ° c kadar 4th larva (L4) sahne alanı'na büyürler veya 44 h için solucanlar kuluçkaya. Not: Adım 1.3 ENOA orta bileşimi için bkz. Bir solucan L4 aşamada vücut yan ortasında yarım ay şeklinde beyaz bir nokta vardır.</li>
	<li>Aşağıdaki deneyleri sahne solucanlar eşitlenmiş L4 kullanın. Vahşi C. elegans hayatta kalma tahlil Aeromonas dhakensis ile ve C. elegans sıvı toksisite tahlil Aeromonas dhakensisile N2 solucanlar türünü kullanın. RW1596 solucanlar (myo-3(st386); kullanın stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) C. elegans kas nekrozu tahlil Aeromonas dhakensisile.</li>
</ol>3. C. elegans hayatta kalma tahlil Aeromonas6,9
<ol><li>E. coli OP50 ile yayılan ENOA L1 solucanlar tohum günde, bir koloni dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ve kültürü ile 2 mL LB suyu sırasıyla 37 ° C'de 16 h için Seç. Not: Kirlenmesini önlemek için bu adımı laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Burada, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır.</li>
	<li>OD600 absorbans bakteriyel suyu ölçmek ve bakteriyel suyu OD600 ayarlamak 2.0 LB suyu ile =.</li>
	<li>Spot ve bakteriyel suyu 30 µL her 6 cm NGM plaka yayıldı. Oda sıcaklığında plakaları gecede kültür. Not: NGM orta bileşimi için 1.2 adıma bakın.</li>
	<li>Gününde, L1 solucanlar L4 sahne alanı'na büyümek rasgele almak ve 50 solucanlar bir NGM plaka her dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ile aktarın.</li>
	<li>Tahlil tamamlanana kadar 20 ° C'de NGM plakaları kuluçkaya.</li>
	<li>Tüm yaşayan solucanlar bakteri ve numaralarını canlı, ölü sayısı ve sensör solucanlar yeni hazırlanan bir NGM plakalı son solucan ölene kadar her gün aktarın. Not: Solucanlar olsanız steril solucanlar bir taze hazırlanmış NGM plakasına enfeksiyon, bakımı için her gün transfer (örneğinglp-4, ya da FudR ile).</li>
	<li>Günlük veri hesaplama temel hayatta kalma eğriler çizmek.</li>
</ol>4. C. elegans sıvı toksisite tahlil Aeromonas7 ile
Not: Kirlenmesini önlemek için laminar akış mahallede gerçekleştirilen adımlar.
<ol><li>L1 solucanlar E. coli OP50 ile yayıldı ENOA plaka üzerinde tohum sonra seçtiklerimiz bir koloni dört Aeromonas suşları ve E. coli OP50 ve kültürü ile 5 mL LB suyu her 16 h için 37 ° C'de. Not: protokol, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır.</li>
	<li>OD600 absorbans bakteri suyu ölçmek.</li>
	<li>Bakteriyel suyu 3500 x g LB suyu kaldırmak 15 dakika, santrifüj kapasitesi. Bakteri resuspend ve bakteriyel suyu OD600 ayarlamak 3.0 ile S orta =. Bakteriyel suyu 195 µL S ortamda bir 96-şey plaka en az 8 wells için ekleyin. Not: Adım 1.6 S orta bileşimi için bkz.</li>
	<li>L4 solucanlar M9 orta kullanarak ENOA plaka E. coli OP5 ile kapalı yıkayın. Bir konsantrasyon µL başına 5 solucanlar solucan çözüm ayarlamak ve solucan çözüm 5 µL 96-şey plaka her şey için ekleyin. Yaklaşık 25 solucanlar iyi ücret olduğundan emin olun.</li>
	<li>Bir shaker 200 devirde 25 ° C'de 96-şey tabağa kuluçkaya</li>
	<li>24, 48 ve 72 h. aşağıdaki formül ile her şey hayatta kalma oranları hesaplamak sonra canlı solucanlar ve ölü solucanlar saymak: (canlı solucanlar/toplam solucanlar) × %100.</li>
	<li>Bir dağılım çizim grafik günlük veri hesaplama ile çizin.</li>
</ol>5. C. elegans kas nekrozu tahlil Aeromonas6
Not: Kirlenmesini önlemek için aşağıdaki adımları bir laminar akış mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>L1 solucanlar yayılmış ENOA E. coli OP50 ile üzerinde seribaşı gününde bir koloni dört Aeromonas suşları ve E. coli OP50 ve kültürü ile 2 mL LB suyu her 16 h için 37 ° C'de seç. Not: Burada, aşağıdaki bakteri suşları kullanılmıştır: E. coli OP50, C. elegans normal gıda kaynağıdır. A. dhakensis AAK1, ilk tam sıralı patojenik klinik A. dhakensis yalıtmak. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 ve A. caviae A2-9307121 Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi'nden dinlerinden klinik yalıtır vardır.</li>
	<li>OD600 absorbans bakteri suyu ölçmek ve bakteri suyu OD600 ayarlamak 2.0 LB suyu ile =. Spot ve 6 cm NGM plakaları bakteriyel suyu 30 µL yayıldı. Oda sıcaklığında plakaları gecede kültür.</li>
	<li>Gününde L1 solucanlar L4 sahneye, transfer 50 solucanlar her NGM plaka her dört Aeromonas suşları veya E. coli OP50 ile büyümek. 20 ° C'de NGM plakaları kuluçkaya Solucanlar her 24 h bakteri ile yeni hazırlanan NGM plakalar aktarın.</li>
	<li>Kas görüntüleri floresan mikroskop kullanarak alın.<ol>
<li>Rastgele bir % 2 özel jel üzerine 10 solucanın M9 orta bir slayttaki seçin. 2 µL % 1 Sodyum azid özel M9 ortamda az 5 dk için resim çekmeden önce kullanarak solucanlar felç.</li>
		<li>Bir kapak notu yerleştirin ve floresan protein (GFP) filtre bir yeşil üzerinde floresan mikroskop kullanarak şarj kuplajlı cihaz fotoğraf makinesi ile kas çekim. 24 Kas çekim, 48 ve 72 h L4 sahne sonrası.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntü analizi ve şekil hazırlık bir görüntü işleme yazılımı ile yapmak. Not: Puanları ve kas hasarı düzeyleri tanımları için ölçütleri listelenen aşağıdaki gibi Şekil 3' te, gösterilmektedir: 3 puan için eksik kas lifleri; 2 puan parçalanmış veya kırık kas lifleri için; 1 puan bükülmüş kas lifleri için; sağlıklı kas lifleri için 0 puan.</li>
</ol>6. istatistiksel analizler
<ol><li>Tüm deneyler bağımsız olarak en az üç kez gerçekleştirin.</li>
	<li>C. elegans hayatta kalma deneyleri değerlendirmek için Kaplan-Meier yöntemini kullanın ve hayatta kalma farklılıklar analiz günlük-rank testi kullanabilirsiniz. İstatistiksel anlamlılık 0,05 ayarla.</li>
	<li>Öğrenci t-test için iki farklı grup C. elegans sıvı toksisite deneyleri istatistiksel sonuçlarını çözümlemek için kullanın. Bir bağımsız değişken için üç veya daha fazla değer arasında farklılıklar analiz tek yönlü ANOVA testi kullanın. İstatistiksel anlamlılık 0,05 ayarla.</li>
</ol>

<ol><li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft-tissue+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biliary tract infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).</li>
<li>Chuang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+clinical+characteristics+among+Aeromonas+hydrophila%2C+Aeromonas+veronii+biovar+sobria+and+Aeromonas+caviae+monomicrobial+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia.</a> Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft+tissue+infection+caused+by+Aeromonas+species+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Disease+Model+of+Muscle+necrosis+caused+by+Aeromonas+dhakensis+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 2058(2016).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates%3A+ex+vivo%2C+animal%2C+and+clinical+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213(2014).</li>
<li>Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+infection+models+in+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29+to+study+the+pathogenesis+of+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1219(2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIOK-1+Is+a+Suppressor+of+the+p38+MAPK+Innate+Immune+Pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Immunology. 9, 774(2018).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Caenorhabditis+elegans+infection+by+bacterial+and+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens.</a> Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Engelmann, I., Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in C. elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).</li>
<li>Feinbaum, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence-related+genes+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813(2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

C. elegans olduğunu bacterivorous Yuvarlak solucanlar bu doğal gıda alımı bakteri ve bakteri için karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık onun evrim sürecinde geliştirmiştir. İki önemli organları korumak ve bağışıklığı destekleyici epidermis ve bağırsak9,13vardır. Epidermis ve C. elegans kas bantları memeliler ve insanlar6' yumuşak doku yapıları benzer. Bu özellikleri nedeniyle, C. elegans Aeromonas enfek...

İnsan patojen Aeromonas, klinik olarak gastroenterit, yara enfeksiyonları, septisemi ve idrar yolu enfeksiyonları1,2neden olduğu gösterilmiştir. En ilişkili insan hastalıkları dört bakteriyel türler ile ilişkili olduğu bildirilmiştir: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniive Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. Aeromonas bulaşıcı hastalıklar arasında yumuşak doku enfeksiyonları ciddi morbidite ve mortalite insanlarda neden olabilir. Not, kas nekrozu yumuşak doku enfeksiyonu6en ağır şeklidir. Gözlem hayatta kalma ve Caenorhabditis elegans kas nekrozu enfeksiyon sonra Aeromonastoksisite spekülasyon kullanılacak uygun bir yöntemdir.
Bilim adamları zaten bakteriyel enfeksiyonlar çalışmaya çok sayıda model organizmalar geliştirdik. Önceki çalışmalarda, fareler, zebrafishes ve Nematodlar patogenez ve virülans Aeromonas6,7,8çalışmaya hayvan modelleri olarak kullanılmıştır. Her hayvan modeli vardır onun ' avantajları ve uygulamaları. Model organizma, Caenorhabditis elegans, bacterivorous Yuvarlak solucanlar hangi alımı bakteri foodnaturally değil. C. elegansevrimi boyunca bakteriyel enfeksiyona karşı karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi geliştirmiştir. Bakteriyel enfeksiyon stres altında C. elegans Aeromonas6,7,9 ve diğer patojenleri bakteriyel patogenezi okumaya bir mükemmel enfeksiyon model olmak kanıtlanmıştır mantar10 ve enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H711gibi. Ancak, hala C. elegans Aeromonasvirülans eğitimi için bir model olarak kullanarak metodoloji üzerinde duruluyor hiçbir yayın yoktur.
Burada, Aeromonas enfeksiyon C. elegans hayvan bir model olarak kullanarak eğitim için üç farklı deneyler tanıtmak: hayatta kalma, sıvı toksisite ve kas nekrozu deneyleri. Bu yöntemler arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek ve Aeromonaspatogenezinde anlayış geliştirmek için uygun bir yoldur.

<table><tbody><tr><td>Çalkalayıcı inkübatör</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>Bakteri inkübasyonu</td></tr><tr><td>K 2 HPO 4 </td> <td>JT Baker</td><td>MP021519455</td><td>Kültür ortamı hazırlama ve nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SIGMA</td><td>M7506</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>kolesterol</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>etanol</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>6 cm Petri plakası</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>agar plakası hazırlama</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>sıvı testi</td></tr><tr><td>bakteriyel pepton</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ20048P2</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>maya özütü</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>sitrik asit ve boğa; H2O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>tri-potasyum sitrat ve boğa; H2O</td><td>SIGMA</td><td>104956</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>FudR&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>disodyum EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO4&boğa; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>215422</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>MnCl2&boğa; 4 H2O</td><td>SIGMA</td><td>221279</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>ZnSO4&boğa; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>204986</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO<alt>4</alt>&boğa; 5 H2O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>tripton</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>Kültür ortamı hazırlama&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop sistemi</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eklipaz Ti ters çevrilmiş&nbsp;</td><td>Mikroskop görüntüleme</td></tr><tr><td>Bilimsel CCD Kamera</td><td>Görselleştirme&nbsp;</td><td>Retiga-2000R Hızlı 1394&nbsp;</td><td>Mikroskop görüntüleme</td></tr></tbody></table>

virülans ve aeromonas enfeksiyon caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

İnsan patojen Aeromonas klinik olarak gastroenterit, yara enfeksiyonları, septisemi ve idrar yolu enfeksiyonu neden olduğu gösterilmiştir. En insan hastalıkları bakteri dört türleri ile ilişkili olduğu bildirilmiştir: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniive Aeromonas caviae. Model organizma Caenorhabditis elegans mükemmel enfeksiyon modeli hangi Aeromonasbakteriyel patogenezi okumaya sağlar bacterivore olduğunu. Burada, hayatta kalma, sıvı toksisite ve kas nekrozu deneyleri gibi bir C. elegans modeli kullanarak Aeromonas enfeksiyon çalışmaya üç farklı deneyler tanıtmak. Aeromonas virülans belirleyen üç yöntem sonuçları tutarlı edildi. A. dhakensis klinik enfeksiyonlar neden 4 büyük Aeromonas türler arasında en zehirli olduğu gösterilmiştir. Bu yöntemler arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek ve Aeromonas enfeksiyon patogenezi bilgimizi katkıda bulunmak için uygun bir yol olarak gösterilmektedir.

Yukarıda açıklanan protokolleri takip ederek, toksisite üzerinden dört Aeromonas suşları arasında ayırt etmek kolaydır. C. elegans hayatta kalma tahlil Şekil 1' de gösterilen. Hayatta kalma oranları düşük ile yüksek sırada gösterilen Aeromonas türleri ile enfekte C. elegans vardı: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila ve A. dhakensis. Çeşitlilik açısından toksisite arasında ve Aeromonas türleri içi...

Burada, C. elegansenfeksiyonunda Aeromonas çalışmaya üç farklı deneyler tanıtmak. Bu uygun yöntemler kullanarak, arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek kolaydır.

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Bu yöntem, bakteriyel enfeksiyonun patojenitesi ve virülansı gibi konak-patojen etkileşim alanındaki anahtar soruların yanıtlatılabiliyor. Bu tekniğin en büyük avantajı, Aeromonas türleri arasındaki toksisiteyi değerlendirebilmek ve Aeromonas enfeksiyonunun patogenezi anlayışımıza katkıda bulunmaktır. Steril deiyonize su ile yaklaşık 2.000 gravid yetişkin solucanlar yıkamabaşlamak için.Solucanları tüpün dibinde tutarak yıkamayı üç kez tekrarlayın. Solucanlar santrifüj sonra supernatant kaldırmak ve deiyonize su 3,5 mililitre solucanlar tutun. Tüpe bir mililitre sodyum hipoklorit ve 0,5 mililitre potasyum hidroksit ekleyin.Daha sonra solucan vücutlarını lyse için altı dakika tüp sallayın. Yumurtalar serbest bırakıldıktan sonra, lysis durdurmak için deiyonize su 10 mililitre ekleyin. Sonra yumurta aşağı çekmek ve mümkün olduğunca supernatant kadar kaldırmak için tüp santrifüj.Yumurtaları 15 mililitre M9 orta ile en az üç kez yıkayın. Yumurtaları 3.5 santimetrelik bir tabağa aktarın ve bir gece için 20 derecede kuluçkaya yatırın. Bundan sonra 10 mikrolitre L1 solucanı ve M9 ortamını plakadan çıkarın.Solucanları sayın ve M9 ortamındaki L1 solucanlarının konsantrasyonuna kavuşun. Bir pipet kullanarak E.coli OP50 LB suyu 0.5 mililitre almak ve bir ENGM plaka üzerine yayıldı. Sonra 16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derece plaka kuluçka.ENGM'yi oda sıcaklığına kadar soğutun. Sonra tohum E.coli OP50 ile bir ENGM plaka üzerinde L1 solucanlar kuluçka. Solucanları 20 derecede L4 aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın.İlk olarak, dört Aeromonas suşları her tek bir koloni seçin ve metin protokolüne göre onları kültür. Daha sonra bakteriyel et suyu OD 600 emici ölçmek ve emici 2,0 eşit olana kadar ayarlayın. Sonraki nokta ve NGM plakaları içine her suşu bakteriyel suyu 30 mikrolitre yayıldı.Daha önce hazırlanmış L4 solucanlarını aeromonas suşları ile NGM plakalarına rastgele seçin ve aktarın. Daha sonra plakaları 20 derecede kuluçkaya yatırın ta ki taslı kaynır tamamlanana kadar. Her gün tüm canlı solucanları bakterilerle dolu yeni bir NGM plakasına aktarın.Son solucan ölene kadar her gün yaşayan, ölü ve sensörsolucanlarının sayısını sayın. Aeromonas suşları kültürve daha önce açıklandığı gibi onların absorbans ölçme sonra, 3, 500 g's 15 dakika bakteriyel suyu santrifüj. Bakteriyel suyu S Medium ile ayarlayın.Ve 96 kuyulu bir plakanın sekiz kuyusu için S orta bakteri suyu 195 mikrolitre ekleyin. Solucanları ENGM plakasının üzerinde M9 orta sıyla yıkayın. Daha sonra solucan çözeltisinin konsantrasyonunu mikrolitre başına beş solucana ayarlayın.96 kuyulu plakanın her kuyuya solucan çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Plakayı bir çalkalayıcıya yerleştirin ve canlı solucan sayısını 24, 48 ve 72 saat olarak sayın. Aeromonas suşları kültürve metin protokolü noktaya göre emici ayar ve NGM plakaları üzerinde bakteriyel suyu yayıldı sonra.Bundan sonra, her NGM plaka 50 L4 solucanlar aktarın. Her 24 saatte bir solucanları taze NGM plakalarına aktarın. Rastgele 10 solucan seçin ve bir slayt üzerinde M9 ortamda% 2 agarose jel aktarın.Son olarak jel üzerinde bir coverslip konumlandırmak ve bir kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop üzerinde yeşil floresan protein filtresi ile kas görüntüleri yakalamak. Bu protokolde dört Aeromonas suşunun toksisitesi değerlendirildi. Aeromonas türleri ile enfekte C.elegans sağkalım oranı A.caviae kullanarak tahlillerde en yüksek, a.dhakensis kullanarak tahlillerde en düşük oldu.Bir sıvı toksisite tisöz titrek töz c.elegans sağkalım önemli ölçüde zaman A.dhakensis veya A.hydrophilia ile enfekte azalmıştır. Kas nekroz istinat derecelerinde aeromonas türleri arasında çeşitli kas hasarı. En az kas hasarına a.caviae neden olurken, en fazla kas hasarına a.dhakensis neden oldu.Bu videoda açıklanan yöntemler Aeromonas türleri arasında ve içinde virülans çeşitliliğini ayırt etmek için uygun bir yol sunuyoruz. Ayrıca, aynı zamanda bir patojen ve konak arasındaki etkileşimi incelemek için güvenilir bir modeldir.

evaluating-virulence-pathogenesis-aeromonas-infection-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Anderson, Q. L., ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)Video, genetiği değiştirilmiş C. elegans larvalarının bir mikroplakada patojenik bakterilere maruz bırakıldığı sıvı bazlı bir testi göstermektedir. Ortama salgılanan bakteriyel toksinler, konakçı stresine ve ölümüne neden olur. Bir floresan boya, ölü solucanları boyayarak, genetik duyarlılığı veya direnci değerlendirmek için görüntülemeye dayalı ölüm oranının...

C. elegans Larvalarında Patojenik Bakteri Kaynaklı Mortalitenin Değerlendirilmesi

Kaynak: Chen, Y. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas enfeksiyonunun virülansı ve patogenezi değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, C. elegans kullanılarak Aeromonas patogenezini modellemek için bir hayatta kalma testini gösteriyor; burada bakterilerin ağızdan yutulması bağırsak enfeksiyonu ve ölüme yol açarak canlı bir konak sisteminde bakteriyel virülansın nicel olarak değerlendirilmesini sağlıyor.

C. elegans'ta Aeromonas Patogenezi'nin Hayatta Kalma Testi Kullanılarak Modellenmesi

Kaynak: Chen, Y. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas enfeksiyonunun virülansı ve patogenezi değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018).Bu video, besin sınırlı sıvı ortamda solucanların hayatta kalmasını ölçerek bakteriyel virülansı değerlendirmek için kullanılan C . elegans Aeromonas ile Sıvı Toksisite Testini gösteriyor. Test, C. elegans'ta toksin kaynaklı hasar ve ölüm oranına dayalı suş özgül patojenikliği ortaya koymaktadır.

C. elegans Sıvı Toksisite Testi ile Bakteriyel Virulansın Değerlendirilmesi

Kaynak: Chen, Y. ve ark., Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas Enfeksiyonunun Virulansı ve Patogenezi Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, patojenik Aeromonas suşları kullanılarak C. elegans (Caenorhabditis elegans) üzerinde kas nekrozu testini göstermektedir.  Aeromonas tohumlu plakalarda yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu olan solucanları besleyerek analiz, bakteriyel enfeksiyonu modeller ve floresan görüntüleme yoluyla doku hasarını ortaya çıkarır. Kas yapısının ve GFP...

Patojenik Aeromonas Suşuyla İndüklenen C. elegans'ta Kas Nekrozu Testi

Bir yumurta-in-solucan (EIW) testi yumurtlama davranışı ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Yumurtlama değişiklikler model organizma bir davranış tepki...

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Burada bir uyarlanabilir, tüm ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve ilaç keşfi için kullanılması için kullanılması gereken yüksek içerik tarama aracı bir protokol açıklayın.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

Yabani Caenorhabditis nematodları, genellikle bağırsak lümeninde veya bağırsağı enfekte eden birçok mikropla ilişkilidir. Bu protokol, dauer lütikülün direncinden yararlanarak bağırsağı kolonlaştıran kültürsüz mikropları zenginleştirmek için bir yöntemi detaylandırıyor.

Bağırsak Mikrobiyom Bakterileri İçin Zenginleştirmek için Yabani Caenorhabditis Nematodlarının Seçici Temizliği

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

Öğrenin Aeromonas enfeksiyonlarının patojenitesini ve virülansını Caenorhabditis elegans modeli kullanarak değerlendirme yöntemlerini. Bu teknik, bakteri türleri arasındaki toksisite farklılıklarını incelemeye olanak tanır.

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet