Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma
22 Şubat 2019
Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.
Hücre içi çoğalan mikrobiyal patojenler eninde sonunda enfekte hücreden çıkmalıdır. Hangi, konak patojen etkileşimleri diğer yönleri ile karşılaştırıldığında nispeten az çalışılmıştır. Burada patojen efflux'ü analiz etme tekniklerini tanımlıyoruz.
Biz nispeten basit tahliller ya efflux verimliliği değerlendirmek veya post-efflux patojenleri karakterize etmek için kullanılabilir nasıl göstermek Burada açıklanan genel teknikler genel olarak uygulanabilir olsa da belirli patojen konak hücre modelleri kinetik farklı olabilir, dozajlar ve muhtemelen okuma-outs. Herhangi bir deneysel sistemin kurulmasında olduğu gibi, deneysel numunelerde veya kohortlarda gerçek, biyolojik süreçlerin gözlemlemesini sağlayacak net kontrollerin oluşturulması esastır. Prosedürü gösteren Petoria Gayle, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Enfeksiyon deneyi ile başlamak için, çanak biraz eğik ve pipet ucu dikkatle üstteki ortama yerleştirilir, kuyulara taze hazırlanmış Lm inoculum 20 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Pipet ucu ile kuyunun duvarlarına dokunmaktan kaçının. Yavaşça tam karıştırma sağlamak için her kuyunun içeriğini pipet.
LM'nin kuyunun duvarlarına yayılmasını önlemek için plakayı sallamayın veya önemli ölçüde eğmayın. Hücre kültürünü 37 santigrat dereceye, %5 karbondioksit kuvöze getirin. Mililitre gentamisin çözeltisi başına 10 mikrogram hazırlamak için dilüent olarak enfekte olmayan hücrelerden klimalı ortam kullanın.
30 dakika sonra enfeksiyon, dikkatle mililitre başına iki nokta-beş mikrogram son konsantrasyonulaşmak için çanak içine gentamisin çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin. Yavaşça kuyunun içeriğini karıştırmak ve kuvöze hücre kültürü çanak dönmek için pipet. Hasat için, biraz çanak eğmek ve dikkatle kuyudan tüm medya kaldırmak için bir pipet kullanın.
Kuyuya 5 mililitre distile, steril su ekleyin. 30 saniye sonra, elde edilen suyu 10 saniye boyunca bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüp ve girdap kuvvetle aktarın. Dört nokta beş mikrolitre ve 50 mikrolitre su damıtılmış, steril su 450 mikrolitre on kat ve yüz kat seyreltme hazırlamak için lysate ekleyin.
Kısa bir süre girdap iyice karıştırma sağlamak için. Lysogeny suyu agar plakaları üzerine orijinal on kat seyreltilmiş ve yüz kat seyreltilmiş örnekleri 50 mikrolitre ekleyin ve bir tabak yayıcı kullanılarak yayıldı. Ortaya çıkan LM için teşp etmek için, çanak bölen medya 10 mikrolitre ayıklayın ve iki beş mikrolitre aliquots ve mikro santrifüj tüpler bölün.
Bir aliquot'a beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin ve kontrol olarak ikinci aliquot'a mililitre başına beş mikrolitre dmem/FCS içeren beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika bekleyin. Her aliquot ve girdap 10 saniye boyunca şiddetle iki distile steril su 90 mikrolitre ekleyin.
Sonra LB agar plakaları üzerinde örnek 50 mikrolitre ekleyin ve bir plaka dağıtıcı kullanarak yayıldı. Lm kolonilerini sayısallandırmadan önce plakaları 37 santigrat derecede iki gün saklayın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hazırlanan, ham iki-altı-dört noktalı yedi hücreyi mililitre başına altıncı hücreye bir kere 10'luk konsantrasyona ayarlayın.
Altı kuyulu doku kültürü plakası kuyularına bir mililitre numune ekleyin. 50 enfeksiyon çokluğu karşılık gelen, hazırlanmış bir Lm inoculum ile hücreleri enfekte. Enfeksiyon sonrası bir noktadabeş saat, bir nokta-beş mililitre likit mikrosantrifüj tüp yüzde dört PFA 500 mikrolitre ile dolu, kuyuların ilk kümesinden medya toplamak ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
Hücre içi Lm toplamak için, her kuyuya bir mililitre distile, steril su ekleyin. 60 saniye sonra, elde edilen suyu bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 500 mikrolitre likit dört%PFA ile. Tüpü 10 saniye boyunca şiddetle girve buza yerleştirin.
Kalan kuyular için, medya kaldırmak ve mililitre başına beş mikrogram mililitre gentamicin ile dmem / FCS bir mililitre ile değiştirin mililitre lm.Promptly kuvöz için çanak dönmek öldürmek için. 30 dakika sonra, ortamı çıkarın ve gentamisin olmadan DMEM/FCS ile değiştirin. Başka bir iki ve dört saat sonra, tüpler içine ikinci ve üçüncü kez puan için lysates medya toplamak ve soğuması için buz üzerine yerleştirin.
Santrifüj tüpleri 10, 000 kez G yedi dakika. Pipet kullanarak, pelet rahatsız etmeden supernatant çıkarın. Tüp içine yüzde dört PFA ve 15 mikrolitre phalloidin 50 mikrolitre içeren boyama kokteyli ekleyin ve her pelet askıya almak için karıştırın.
Tüpleri karanlıkta 20 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her tüp ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için FACS tampon bir mililitre ekleyin. Yedi dakika boyunca 10,000 kez G santrifüj de spin tüpler.
Peletrahatsız etmeden supernatant çıkarın. Hemen kullanım için, FAKS tampon 400 mikrolitre her pelet askıya alın. Daha sonra analiz için depolama, 200 faks tampon ve tüp içine yüzde dört PFA 200 mikrolitre ekleyin ve askıya almak için karıştırın.
Antibiyotik gentamisin ile kısa tedavide enfeksiyon koşulları kullanılarak içselleştirilmeyen Lm ortadan kaldırmak için, yabani tip Lm sıfır nokta-bir-beş yüzde kültürlü makrofajlar ile co-inkübatasyon bir nokta beş saat sonra kurtarılır. Sonraki eş-kuluçka, sadece hücre içi proliferasyonu temsil canlı Lm kurtarma dört kat ve yedi nokta beş kat artış oldu. İlk enfeksiyon sırasında hipervirulent prfA'ya sahip lm suşu için karşılaştırılabilir profil gözlendi, ancak üç ile altı HPI arasında değildi.
PrfA Lm suşundan silindiğinde, uzun süreli eş kuluçkadan sonra gerilmede bir azalma meydana gelir. Gentamisin altı HPI'deki kuyulardan çıkarıldığında, hücre dışı Lm bir saat sonra hem yabani tip hem de hipervirulent prfA suşları için tespit edilebilir, ancak prfA ile yapılan zorlanma için saptanabilir. Hem enfekte olmayan hem de enfekte olmuş makrofajların örtünmesi, ışık saçılımı, bakteri büyüklüğünde partikül madde içeriyordu.
Ancak, sadece enfekte makrofajlardan medya boyutu gating içinde GFP pozitif sinyalleri sahip. Enfekte makrofajlarda phalloidin pozitif Lm görünümünde zamana bağlı bir artış gözlendi. 48-iyi doku kültürü çanak makrofajlar dışarı kaplama zaman, hücre olmadan bazı kuyular bırakın.
Bu hücre dışı kontrol kuyuları daha sonra, deneysel sinyallerin konak hücrelerinin varlığına bağlı olduğundan emin olmak için patojen, antibiyotikler vb. eklenmesi açısından hücre içeren kuyularla tamamen aynı şekilde tedavi edilir. Birinci ve üçüncü şekillerde gösterilen deneylere benzer şekilde, patojen veya konak faktörleri ve veya küçük moleküller patojen hücresel efflux üzerindeki etkileri açısından test edilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hücre içi mikrobiyal patojenlerin çıkışını analiz etme tekniklerini tartışmaktadır. Hem in vitro hem de in vivo enfeksiyon testlerini vurgulayarak, konak kodlayan faktörlerin aktivitelerini ve patojen çıkışının verimliliğini değerlendirmek için kullanılabilecek yöntemlere değinir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyal Patojen Etkileşimleri
- Konak-Patojen Dinamikleri
- Enfeksiyon Testleri
Arka Plan
- Hücre içi patojenlerin çoğalabilmesi için konak hücrelerden çıkmaları gerekmektedir.
- Çıkış mekanizmaları diğer konak-patojen etkileşimlerinde olduğu kadar incelenmemiş durumdadır.
- Doğru gözlemler için açık deneysel kontroller şarttır.
- Teknikler, belirli patojen-konak hücre modellerine göre değişebilir.
Çalışmanın Amacı
- Patojen çıkışını analiz etme yöntemlerini tanımlamak.
- Çeşitli testlerde çıkış verimliliğini değerlendirmek.
- Çıkış sonrası patojenleri karakterize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- In vitro enfeksiyon testleri
- In vivo enfeksiyon testleri
- Çıkış verimliliğinin değerlendirilmesi
- Çıkış sonrası patojenlerin karakterizasyonu
Ana Sonuçlar
- Gösterilen teknikler geniş çapta uygulanabilir.
- Testler farklı patojenler ve konak hücreler için uyarlanabilir.
- Biyolojik alakalılık sağlamak için açık kontroller hayati önem taşır.
- Laboratuvardan bir lisansüstü öğrencisi tarafından gösterilen prosedür.
Sonuçlar
- Patojen çıkışını anlamak, konak-patojen etkileşimlerini kavrama açısından kritik öneme sahiptir.
- Basit testler, patojen davranışı hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu teknikler üzerine inşa ederek çeşitli patojenleri araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding pathogen efflux mechanisms provides critical insights into host-pathogen dynamics, enabling target validation for anti-infective strategies. Quantitative assays for cellular efflux support mechanistic de-risking in early discovery by linking pathogen factors to host responses. This approach enhances predictive confidence in identifying modulators of eukaryotic cell function relevant to therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying pathogen efflux as a functional readout of host cellular processes.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized measurement of intracellular pathogen recovery and proliferation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating pathogen strain variations (e.g., prfA status) with efflux efficiency and intracellular survival.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for high-throughput screening by establishing reproducible efflux assays using CFU and flow cytometry.
- Operational Value: Addresses assay standardization through defined controls (e.g., gentamicin protection, no-cell wells) ensuring signal dependence on host cells.
- Scalability: Highlights readiness for discovery-based screens due to simplicity and scalability of water lysate dilution and plating protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrates close correspondence between in vitro cultured cell infection and in vivo hepatic cell responses, supporting extrapolation to physiological contexts.
- Mechanistic De-risking: Focuses on pathogen- and host-encoded factors impacting efflux, enabling risk-adjusted advancement decisions based on functional validation.
- Predictive Confidence: Connects efflux efficiency to intracellular proliferation dynamics, informing dose-response and timing considerations in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within early discovery to lead identification, this method supports hypothesis testing, assay readiness, and quantitative analytics critical for downstream decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking pathogen efflux to host cytoskeletal dynamics via phalloidin staining and size gating in flow cytometry.
- Screening: Describes assay readiness through standardized infection, antibiotic treatment, and lysis protocols enabling consistent quantitative outputs.
- Analytics: Highlights CFU enumeration and flow cytometry as quantitative readouts that enable comparison of efflux efficiency across conditions and time points.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via demonstrated correlation between in vitro and in vivo hepatic cell infection dynamics.
- Enterprise Reuse: Frames the efflux assay as a reusable platform for testing pathogen, host, or small molecule modulators across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-host interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined controls and scalable assay formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of efflux-modulating compounds with reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable efflux efficiency linked to pathogenic fitness and host adaptation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques, tissue culture, and flow cytometry for accurate pathogen quantification and host response assessment.
- Dependent on instrumentation including centrifuges, vortexers, automated cell counters, and flow cytometers for lysate processing and signal detection.
- Necessitates cross-team standardization of infection timing, antibiotic concentrations, and dilution protocols to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending to different pathogen-host cell models due to variations in kinetics, dosages, and read-outs as noted in the source.
- Includes practical limitations such as the need for careful avoidance of well wall contact during inoculation and strict adherence to timing for gentamicin treatment to distinguish intracellular from extracellular pathogens.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
Infection Procedures
2:16
Sampling Processing of Intracellular and Emergent Lm for Colony-forming Unit (CFU) Assay
3:58
Sampling Processing of Intracellular and Emergent Lm for Flow Cytometry (FCM)
6:22
Results: The Role of Pathogen and Host-encoded Factors on Cellular Infection
7:54
Conclusion
