Name: Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Öğrenin bakteriyel patojenlerin hücre dışına çıkışını analiz etme yöntemlerini in vitro ve in vivo enfeksiyon testleri kullanarak. Bu teknikler konak-patojen etkileşimlerini anlamak için değerli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fareler insanca bakım için tüm uygun hükümet kılavuzlarınıza uygun olarak tedavi edildi ve kullanmak, laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık enstitüleri ve bunların kullanımı için tüm bu çalışma Miami Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı tarafından kabul edildi ve kullanım Komitesi (protokol 16-053).
1. enfeksiyon için hücreleri hazırlanması
<ol><li>Fare makrofaj gibi hücre kültürünü ham 264.7 DMEM doku kültürü medya % 10 fetal buzağı serum (bundan böyle DMEM/FCS da adlandırılır) ile takıma yaymak bir 125 mL şişe ve 37 °C/5% CO2' de tutulan bir doku kültürü kuluçka makinesi kullanarak.</li>
	<li>Enfeksiyon, önceki gün bir hücre kazıyıcı hücre genişletme balonun kaldırma ve bir 15 mL vidalı kapak konik tüp içinde toplamak için kullanın. Hücreleri vasıl 800 x g 10 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve hücre Pelet DMEM/FCS 1 ml (olmadan antibiyotik) askıya alma ve bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak titresi belirlemek.</li>
	<li>
2 x 106 hücre/ml titresi ayarlamak ve 48-iyi doku kültürü çanak wells için 0,10 mL (2 x 105 hücreleri) ekleyin. Hücre süspansiyon iyi tüm yüzeyine kapsar emin olun.
	<ol>
<li>Plaka hücreleri klimalı ortam daha sonra kaynağı için ek Wells. Aynı zamanda bir 'hiçbir hücre denetimi ' hizmet için üç ek Wells DMEM/FCS 0.10 mL yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecede bir doku kültürü kuluçka 37 °C/5% CO2kuluçkaya. Bakteri inoculum hazırlanan ve kullanıma hazır olana ertesi gün, kuluçka kaldırmaz.</li>
</ol>2. enfeksiyon için Listeria Monositogenez (Lm) hazırlanması
<ol><li>Bir koloni bir taze çizgili agar plaka ile beyin-kalp infüzyon (BHI) 2 mL aşılamak (< 2 gün) LM ve gecede 37 ° C'de 130 rotasyonlar/dk sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, 0.10 mL 2 ml gecede kültür BHI önceden ısıttı ve 37 ° C'de sallayarak ile optik yoğunluk (OD600) 0,4 ve 0.6 arasında kadar kuluçka devam ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık bakteriyel titresi bir ampirik olarak elde edilen dönüşüm formülü kullanarak belirleyin. Bizim laboratuarımızda BHI katlanarak büyüyen bir Lm kültüründe yaklaşık 1.3 x 10 's9 koloni oluşturan birimler (CFU) /OD600. Bakteriyel kültürlerde oda sıcaklığına maruz kalan süreyi en aza indirmek.</li>
	<li>Sadece enfeksiyon önce titresi 5 x 107 CFU/mL Önceden ısıtılmış DMEM/FCS eritici kullanarak ayarlayın.</li>
</ol>3. enfeksiyon
<ol><li>Hızlı ve hassas, çalışma eklemek 20 µL (1 x 106 CFU; çokluğu enfeksiyon, MOI = 5) taze hazırlanmış Lm inoculum (Adım 2.4 yukarıdaki) için biraz yemek devirme ve dikkatle damlalıklı ucunu örten medyada; yerleştirerek wells, Not: iyi damlalıklı ucu duvarlarının dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>Yavaşça damlalıklı karıştırma sağlamak için her şey içeriğini tamamlamak; sallamak ya da bu kuyunun duvarları üzerinde Lm yayılacak gibi önemli ölçüde plaka eğimli değil. Hücre kültür çanak 37 °C/5% CO2 kuluçka için dönmek.</li>
	<li>Klimalı ortam bulaşmamış kuyulardan eritici kullanarak 10 µg/mL gentamisin solüsyonu hazırlayın.</li>
	<li>Enfeksiyon (MPI) 30 dakika sonrası, dikkatle gentamisin çözüm (son konsantrasyonu 2,5 µg/mL) ve yavaşça damlalıklı 30 µL 37 °C/5% CO2 kuluçka için hem de daha önce ve dönüş hücre kültür çanak içeriği ekleyin.</li>
	<li>60 MPI CFU tahlil (60 MPI süresi noktası) veya FCM analiz için uygun wells (aşağıda bölüm 4 ve 5, sırasıyla açıklandığı gibi) hasat.</li>
	<li>Kalan kuyular için bundan sonra çeşitli zamanlarda ya önce veya, Lm ortaya çıkması tahlil için tamamen medya kuyudan kaldırmak ve klimalı ortam gentamisin ücretsiz 150 µL ile yerine hücre hasat.</li>
</ol>4. örnekleme işleme ve hücre içi ve acil Lm CFU tahlil tarafından analizi
<ol><li>Hasat için biraz yemek eğilme ve dikkatli bir şekilde tüm medya kuyudan çıkarın. 0.50 mL distile steril su (dsH2O) kuyuya ekleyin. Sonra 30 s, lysate elde edilen su transferi (100) 1.5 mL microcentrifuge tüp ve şiddetle 10 için girdap s.</li>
	<li>10-1 ve 10-2 dilutions ya 4.5 µL veya 50 µL dsH2O 450 µL için lysate su ve kısaca ayrıntılı karıştırma sağlamak için girdap ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>10 50 µL yaymak0, 10-1 ve/veya lysogeny suyu (LB) Ağar kaplamalar üzerine 10-2 örnekleri.</li>
	<li>Acil Lm için (Adım 3.6 yukarıdaki) tahlil, 10 µL overlaying medya kaldırmak ve iki 5 µL aliquots bölmek için: bir aliquot için 5 µL DMEM/FCS ve ikinci aliquot DMEM/FCS 5 µg/mL gentamisin içeren 5 µL ekleyin. İkinci denetim hücre dışı Lm arasında (gentamisin duyarlı) ayıran ve hücre içi Lm (gentamisin sonraki CFU dayanıklı) tahlil.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dk sonra dsH2O, 10 s için şiddetle girdap 90 µL ve yayılan 50 µL LB agar Tabaklarda ekleyin.</li>
	<li>LM kolonileri LB agar plakaları, kuluçka 37 ° C'de 2 gündür takip numaralandır</li>
</ol>5. örnekleme işleme ve analiz hücre içi ve acil Lm Akış Sitometresi (FCM) tarafından
<ol><li>HAM 264.7 hücreleri 1,1-4 adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. 1 x 106 hücre/mL hücrelere ayarlamak ve 1 mL (1 x 106 hücreler) 6-iyi doku kültürü çanak wells için ekleyin.</li>
	<li>Bakteri inoculum 2.1 2.3. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın ve inoculum 50 (5 x 107 CFU) MOI için karşılık gelen hacmi içeren hücreleri enfekte.</li>
	<li>1,5 saat sonrası enfeksiyon (HPI), medya Wells ilk kümesinden toplamak ve bütün wells işlenene kadar 500 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) ve buz üzerinde yer ile 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin.</li>
	<li>Hücre içi Lmtoplamak için iyi ve 60 sonra dsH2O 1 mL ekleyin s, lysate elde edilen su ile 500 µL % 4'lük bir 1.5 mL microcentrifuge tüp transfer PFA. 10 s ve bütün wells işlenene kadar buz üzerinde yer için şiddetle girdap. (Örnek işleme adım 5,8 aşağıda açıklanmıştır.)</li>
	<li>Kalan wells, medyayı çıkarın ve DMEM/FCS 1 mL hücre dışı Lm öldürmek ve hemen iade hücreleri kuluçka için 5 µg/mL gentamisin ile değiştirin.</li>
	<li>30 dk (2 HPI) sonra medyayı çıkarın ve gentamisin DMEM/FCS ile değiştirin.</li>
	<li>2 ve 4 h (4 ve 6 HPI) sonra ikinci al ve üçüncü adım 5.3 ve 5,4 medya ve lysates toplayarak Puan oluyor.</li>
	<li>10.000 x g 7 dk. Kaldır süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet için de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>%4 50 µL kokteyl boyama içinde her Pelet askıya PFA ve phalloidin 15 µL. 20 dk için 4 ° C'de karanlık tüplerde kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra 1 mL FACS arabelleği her tüp ve pipet yukarı ve aşağı karışımı ekleyin.</li>
	<li>Tüpler, 10.000 x g 7 dk. Kaldır süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet için spin.</li>
	<li>Her Pelet 400 µL FACS arabelleği için acele kullanma, ya da 200 µL FACS arabelleği ve % 4'lük 200 µL'askıya alma daha sonraki analizler için depolama Eğer PFA.</li>
	<li>Bir Akış Sitometresi örneği çalıştırmak ve toplanan verileri çözümleyebilirsiniz.</li>
</ol>6. örnekleme işleme ve Lm kolonizasyon ve ana bilgisayar yanıt karaciğerde analizi
<ol><li>LM 2.1 2.3 adımda anlatıldığı gibi enfeksiyon için hazır olun.</li>
	<li>Alt kültür 3 x 106 CFU/mL istenen titresi için gerekli miktarı hesaplamak.</li>
	<li>Sadece enfeksiyon önce hesaplanan bakteri ile Önceden ısıtılmış Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) 1 ml son birimindeki miktarı oranında seyreltin. Fareyi enjekte edilir giriş inoculum bu.</li>
	<li>28 G½ 100U insülin kullanarak, 100 µL (3 x 105 CFU) giriş inoculum çizmek ve herhangi bir görünür hava kabarcıkları kaldırın.</li>
	<li>Fare (soy C57BL/6; 6 ve 12 hafta yaşlı arasındaki erkekler) holding kısıtlama yerleştirin ve kuyruk ven genişletmek için ılık su (en fazla 45 ° C) kullanın, sonra giriş inoculum damar içine enjekte.</li>
	<li>10-2 ve 10-3 dilutions LB agar 10bcm levhalar üzerine giriş inoculum, plaka ve gecede 37 ° C gerçek giriş dozu belirlemek için kuluçkaya.</li>
	<li>18 HPI insanca fare (servikal çıkığı tarafından takip CO2 boğulma) ve frontal lob için dış ve iç in ayırın cımbız ve makas kullanarak karaciğer toplamak için steril makas kesim açık fare karın zarını kullanarak ötenazi fare. Karaciğer 6 cm buzda Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Karaciğer küçük küpler halinde kesilmiş ve bir manyetik heyecan bar ile cam şişe içine yerleştirin. 2 mL 2 mg/mL collagenase D DMEM FCS olmadan yeniden ekleyin. Şişeleri 30−45 min için bir manyetik karıştırıcı olarak 37 ° C'de kuluçkaya. Doku homojen bir kez collagenase devre dışı bırakabilirsiniz için DMEM/FCS 3 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla daha fazla DMEM/FCS ekleme bir konik tüp filtre.</li>
	<li>10 dk 4 ° C'de cips, süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet ACK arabellek kırmızı kan hücreleri parçalayıcı 500 µL içinde askıya almak için 800 x g hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücreleri bildirim arabelleğindeki 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. 1 mL DMEM/FCS hücrelerde askıya alma.</li>
	<li>10 dk 4 ° C'de cips, süpernatant kaldırmak ve 1 mL DMEM/FCS askıya almak için 800 x g hücreleri santrifüj kapasitesi. Sonra bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>1 x 106 hücre transfer için 1.5 mL microcentrifuge tüp ve cips için döndür. O zaman 1 mL dsH2O ve girdap hücreleri parçalayıcı askıya alma. 50 µL LB plakaları, su katılmamış ve 10-2 dilutions plaka ve 37 ° C'de Lm CFU analiz için numaralandırmak için kuluçkaya.</li>
	<li>1 x 106 hücre hücre sayımları göre her doku örneği için FACS tüpler içine transfer ve 1 mL FACS arabellek ile yıkayın.</li>
	<li>10 dk 4 ° C'de cips ve süpernatant kaldırmak için 800 x g hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Her antikor ve FACS arabellek için önerilen konsantrasyon göre faiz antikorlar içeren bir antikor kokteyl hazırlamak. Önerilen tutarlarda analizinde kullanılan Malzemeler tablo bakın.</li>
	<li>Pelet antikor kokteyl 100 µL içinde askıya alma ve tüpler için 30 dk 4 ° C'de karanlıkta kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra her tüpün FACS arabellek 2 mL ekleyin ve hücreleri askıya alma.</li>
	<li>4 ° C'de cips ve süpernatant atmak için 800 x g hücreleri santrifüj kapasitesi. Öyleyse Pelet 400 µL FACS arabelleği için acele kullanma, ya da 200 µL FACS arabelleği ve 200 µL % 4'askıya sonraya saklamak Eğer PFA.</li>
	<li>Hücreleri Akış Sitometresi tarafından analiz (bkz. Adım 5.13).</li>
</ol>

<ol><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
<li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li>
<li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li>
<li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085(2018).</li>
<li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li>
<li>Blériot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut%2C+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li>
<li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li>
<li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li>
<li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+%28HRI%29+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754(2013).</li>
<li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2%CE%B1+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707(2018).</li>
<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
<li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Onun hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu nedeniyle, Lm enfeksiyon etkisi hücresel aktiviteler soruşturma için ideal bir patojen bir programdır. Ana faktörlerin bir Lm hücresel enfeksiyon11,12,13,14olumlu veya olumsuz yönde etkileyen tespit edilmiştir. İki tür ev sahipliği bizim laboratuvar Perforin-2 ve Heme düzenlenir inhibitörü ile karakterize faktörler (P2 ve Merhab...

Enfeksiyon tabanlı deneysel modeller bağımlılığını başlangıç durumu koşullar ev sahibi ve patojen, çeşitli patojen bulaşma stratejileri ve patojen ve ana bilgisayar kullanan işlemler atfederek zorluğu nedeniyle doğal olarak zor olan bağlı olarak sonuçlar. Listeria Monositogenez (Lm) bakteri konak savunma yanıt-e doğru onun genetik ve mikrobiyolojik tractability, hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu stratejisini ve nispeten açık nedeniyle soruşturma için ideal bir patojen haline gelmiştir onun cep-organismic düzeyi ve enfeksiyon fenotipleri arasındaki ilişki. Lm hücresel enfeksiyon dört ayrı aşama1ile devam eder: (i) içinde bir çarpıtma; kapalı Lm ile adl hücresel Invasion (II) Lm-yönetmen çarpıtması membran dağılması ve Lm yayın içine sitozol; (III) intracytosolic yineleme; ve her iki bitişik hücreleri (olduğu gibi bir epitel sayfası gibi) enfeksiyon veya soliter hücrelerdeki sonuçları plazma zarı Lm sürümü ekstraselüler ortamın içine (IV) fiziksel nüfuz. Her bu aşamalardan belirli Lmtarafından terfi-kodlanmış faktörler ('virülans faktörleri' anılacaktır), silindiğinde, hücresel ve hayvan modellerinde enfeksiyon kusurları neden. Bu genel enfeksiyon strateji sözde 'sitozolik' patojenler2bir dizi tarafından bağımsız olarak gelişmiştir.
Koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri yaygın olarak tüp bebek her ikisi de değerlendirmek için istihdam (yani, hücresel) olarak içinde vivo de (örneğin, organismic) enfeksiyon sonuçları. Ek olarak içinde vivo enfeksiyonlar, özellikle için onların yüksek hassasiyet patojen işgali ve hücre içi hayatta kalma/yayılması için net bir okuma CFU deneyleri sağlar. CFU deneyleri kapsamlı enfeksiyon etkisi Lm ve konak hücre belirleyicileri analiz etmek için kullanılmaktadır. Bu önceki çalışmalarda hücresel istilası ve intracytosolic çoğaltma çözümlemek için olduğu gibi bilgilendirici, CFU deneyleri bilgimizi, en iyi şekilde Lm enfeksiyon işleminin dördüncü aşamasını izlemek için kullanılmayan,: hücresel kaçış. Burada, biz (bundan böyle 'olarak ortaya çıkması' denir) nasıl hücresel kaçmanın bir yolu CFU tahlil (yanı sıra Akış Sitometresi) izlenebilir ve Lm bu aşaması nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler örnekleri gösteri düzenleyen nispeten basit tarif enfeksiyon döngüsü. Hücresel Lm enfeksiyon döngüsü terminal aşamasının analiz ek patojen ve konak hücre enfeksiyon özgü faktörler ve aktiviteleri tanımlama mümkün yapabilir.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Tamponu</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>ArC Amin Reaktif Kompanzasyon Boncukları&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) et suyu</td><td>EMD Milipore</td><td>110493</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci, 70 & m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ortamı&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Isı Etkisiz Hale Getirildi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Dengeli Tuz çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Büyüme Hücreleri MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre Lekesi kiti&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800 Spektral Analiz Cihazı</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 28 G 1/2 "1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP Doku Kültürü 48 Kuyulu Plakalar ve nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>TPP Doku Kültürü 6 Kuyulu Plaka&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Antijen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>flurochrome = PE Cy5, seyreltme = 1/100, klon = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>biolegend</td><td></td><td>flurochrome = AF 647, seyreltme = 1/100, klon = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>biolegend</td><td></td><td>flurochrome = APC cy7, seyreltme = 1/100, klon = 30-f11</td></tr><tr><td>f4/80</td><td>biolegend</td><td></td><td>flurochrome = PE, seyreltme = 1/100, klon = BM8</td></tr><tr><td>canlı/ölü</td><td>invitrogen</td><td></td><td>Flurokrom = AmCyN, Seyreltme = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PacBlue, Seyreltme = 1/200, Klon = HK1.4 MHC</td></tr><tr><td>II</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurokrom = AF 700, Seyreltme = 1/200, Klon = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = BV 605, Seyreltme = 1/100, Klon = PK136</td></tr></tbody></table>

bakteriyel pathogen sonda için hücresel ve organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Hayatta kalmak için ve bir kez ökaryotik hücre içinde prolifere bakteriyel patojenler istihdam stratejileri çeşitli vardır. Sözde 'sitozolik' patojenler (Listeria Monositogenez, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, FRANCISELLA tularensisve Rickettsia'nin spp.) tarafından enfekte hücre sitozol erişim fiziksel ve enzimatik birincil vacuolar membran aşağılayıcı. Bir kez sitozol Bu patojenler hem çoğalırlar yanı sıra yeni hücre bulaştırmak için ana hücresinin plazma zarı nüfuz için yeterli mekanik Kuvvetleri oluşturmak. İşte, L. Monositogenez (Lm) hücresel enfeksiyon döngüsünün terminal bu adımı koloni oluşturan birim testleri ve Akış Sitometresi tarafından sayısal ve nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler etkisi örnekleri bu vermek nasıl göstermektedir işlem. Ayrıca yakın bir ilişkiyi Lm enfeksiyon dinamikler kültürlü hücre tüp bebek bulaşmış ve bu fareler türetilmiş karaciğer hücrelerinin enfekte içinde vivo gösteriyoruz. Bu işlev tabanlı deneyleri oldukça basit ve kolayca keşif dayalı yüksek üretilen iş ekranlar için modülatörler ökaryotik hücre işlevinin için ölçeklendirilebilir.

Patojen ve hücresel enfeksiyon etkileyen ev sahibi olarak kodlanmış faktörlerin rolü değerlendirilmesi Yukarıda açıklanan enfeksiyon koşulları kullanarak, giriş vahşi tipi Lm yüzde 0.15, kültürlü makrofajlar (şekil 1A) ile ortak kuluçka 1,5 saat sonra kurtarılır. Sonraki 1,5 saat, co kuluçka (3 h sonrası enfeksiyon, HPI) kurtarma uygun Lm 4-fold bir artış oldu ve 3 6 HPI için uygun Lmkurtarma bir...

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Hücre içi çoğalan mikrobiyal patojenler eninde sonunda enfekte hücreden çıkmalıdır. Hangi, konak patojen etkileşimleri diğer yönleri ile karşılaştırıldığında nispeten az çalışılmıştır. Burada patojen efflux'ü analiz etme tekniklerini tanımlıyoruz.Biz nispeten basit tahliller ya efflux verimliliği değerlendirmek veya post-efflux patojenleri karakterize etmek için kullanılabilir nasıl göstermek Burada açıklanan genel teknikler genel olarak uygulanabilir olsa da belirli patojen konak hücre modelleri kinetik farklı olabilir, dozajlar ve muhtemelen okuma-outs. Herhangi bir deneysel sistemin kurulmasında olduğu gibi, deneysel numunelerde veya kohortlarda gerçek, biyolojik süreçlerin gözlemlemesini sağlayacak net kontrollerin oluşturulması esastır. Prosedürü gösteren Petoria Gayle, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Enfeksiyon deneyi ile başlamak için, çanak biraz eğik ve pipet ucu dikkatle üstteki ortama yerleştirilir, kuyulara taze hazırlanmış Lm inoculum 20 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Pipet ucu ile kuyunun duvarlarına dokunmaktan kaçının. Yavaşça tam karıştırma sağlamak için her kuyunun içeriğini pipet.LM'nin kuyunun duvarlarına yayılmasını önlemek için plakayı sallamayın veya önemli ölçüde eğmayın. Hücre kültürünü 37 santigrat dereceye, %5 karbondioksit kuvöze getirin. Mililitre gentamisin çözeltisi başına 10 mikrogram hazırlamak için dilüent olarak enfekte olmayan hücrelerden klimalı ortam kullanın.30 dakika sonra enfeksiyon, dikkatle mililitre başına iki nokta-beş mikrogram son konsantrasyonulaşmak için çanak içine gentamisin çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin. Yavaşça kuyunun içeriğini karıştırmak ve kuvöze hücre kültürü çanak dönmek için pipet. Hasat için, biraz çanak eğmek ve dikkatle kuyudan tüm medya kaldırmak için bir pipet kullanın.Kuyuya 5 mililitre distile, steril su ekleyin. 30 saniye sonra, elde edilen suyu 10 saniye boyunca bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüp ve girdap kuvvetle aktarın. Dört nokta beş mikrolitre ve 50 mikrolitre su damıtılmış, steril su 450 mikrolitre on kat ve yüz kat seyreltme hazırlamak için lysate ekleyin.Kısa bir süre girdap iyice karıştırma sağlamak için. Lysogeny suyu agar plakaları üzerine orijinal on kat seyreltilmiş ve yüz kat seyreltilmiş örnekleri 50 mikrolitre ekleyin ve bir tabak yayıcı kullanılarak yayıldı. Ortaya çıkan LM için teşp etmek için, çanak bölen medya 10 mikrolitre ayıklayın ve iki beş mikrolitre aliquots ve mikro santrifüj tüpler bölün.Bir aliquot'a beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin ve kontrol olarak ikinci aliquot'a mililitre başına beş mikrolitre dmem/FCS içeren beş mikrolitre DMEM/FCS ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika bekleyin. Her aliquot ve girdap 10 saniye boyunca şiddetle iki distile steril su 90 mikrolitre ekleyin.Sonra LB agar plakaları üzerinde örnek 50 mikrolitre ekleyin ve bir plaka dağıtıcı kullanarak yayıldı. Lm kolonilerini sayısallandırmadan önce plakaları 37 santigrat derecede iki gün saklayın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hazırlanan, ham iki-altı-dört noktalı yedi hücreyi mililitre başına altıncı hücreye bir kere 10'luk konsantrasyona ayarlayın.Altı kuyulu doku kültürü plakası kuyularına bir mililitre numune ekleyin. 50 enfeksiyon çokluğu karşılık gelen, hazırlanmış bir Lm inoculum ile hücreleri enfekte. Enfeksiyon sonrası bir noktadabeş saat, bir nokta-beş mililitre likit mikrosantrifüj tüp yüzde dört PFA 500 mikrolitre ile dolu, kuyuların ilk kümesinden medya toplamak ve buz üzerinde tüp yerleştirin.Hücre içi Lm toplamak için, her kuyuya bir mililitre distile, steril su ekleyin. 60 saniye sonra, elde edilen suyu bir nokta-beş mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 500 mikrolitre likit dört%PFA ile. Tüpü 10 saniye boyunca şiddetle girve buza yerleştirin.Kalan kuyular için, medya kaldırmak ve mililitre başına beş mikrogram mililitre gentamicin ile dmem / FCS bir mililitre ile değiştirin mililitre lm.Promptly kuvöz için çanak dönmek öldürmek için. 30 dakika sonra, ortamı çıkarın ve gentamisin olmadan DMEM/FCS ile değiştirin. Başka bir iki ve dört saat sonra, tüpler içine ikinci ve üçüncü kez puan için lysates medya toplamak ve soğuması için buz üzerine yerleştirin.Santrifüj tüpleri 10, 000 kez G yedi dakika. Pipet kullanarak, pelet rahatsız etmeden supernatant çıkarın. Tüp içine yüzde dört PFA ve 15 mikrolitre phalloidin 50 mikrolitre içeren boyama kokteyli ekleyin ve her pelet askıya almak için karıştırın.Tüpleri karanlıkta 20 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her tüp ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için FACS tampon bir mililitre ekleyin. Yedi dakika boyunca 10,000 kez G santrifüj de spin tüpler.Peletrahatsız etmeden supernatant çıkarın. Hemen kullanım için, FAKS tampon 400 mikrolitre her pelet askıya alın. Daha sonra analiz için depolama, 200 faks tampon ve tüp içine yüzde dört PFA 200 mikrolitre ekleyin ve askıya almak için karıştırın.Antibiyotik gentamisin ile kısa tedavide enfeksiyon koşulları kullanılarak içselleştirilmeyen Lm ortadan kaldırmak için, yabani tip Lm sıfır nokta-bir-beş yüzde kültürlü makrofajlar ile co-inkübatasyon bir nokta beş saat sonra kurtarılır. Sonraki eş-kuluçka, sadece hücre içi proliferasyonu temsil canlı Lm kurtarma dört kat ve yedi nokta beş kat artış oldu. İlk enfeksiyon sırasında hipervirulent prfA'ya sahip lm suşu için karşılaştırılabilir profil gözlendi, ancak üç ile altı HPI arasında değildi.PrfA Lm suşundan silindiğinde, uzun süreli eş kuluçkadan sonra gerilmede bir azalma meydana gelir. Gentamisin altı HPI'deki kuyulardan çıkarıldığında, hücre dışı Lm bir saat sonra hem yabani tip hem de hipervirulent prfA suşları için tespit edilebilir, ancak prfA ile yapılan zorlanma için saptanabilir. Hem enfekte olmayan hem de enfekte olmuş makrofajların örtünmesi, ışık saçılımı, bakteri büyüklüğünde partikül madde içeriyordu.Ancak, sadece enfekte makrofajlardan medya boyutu gating içinde GFP pozitif sinyalleri sahip. Enfekte makrofajlarda phalloidin pozitif Lm görünümünde zamana bağlı bir artış gözlendi. 48-iyi doku kültürü çanak makrofajlar dışarı kaplama zaman, hücre olmadan bazı kuyular bırakın.Bu hücre dışı kontrol kuyuları daha sonra, deneysel sinyallerin konak hücrelerinin varlığına bağlı olduğundan emin olmak için patojen, antibiyotikler vb. eklenmesi açısından hücre içeren kuyularla tamamen aynı şekilde tedavi edilir. Birinci ve üçüncü şekillerde gösterilen deneylere benzer şekilde, patojen veya konak faktörleri ve veya küçük moleküller patojen hücresel efflux üzerindeki etkileri açısından test edilebilir.

using-bacterial-pathogen-to-probe-for-cellular-organismic-level-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Odaklanan bir bakteriyel patojen tarafından işgalinin ana hücrelerinin çalışma için genel bir...

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Bu video, koloni oluşturan birim testi ile makrofajların Listeria monocytogenes enfeksiyonunu belirlemek için bir in vitro miktar tayin tekniğini göstermektedir. Agar plakasındaki bakteri kolonileri, konak savunma mekanizmasından kaçan ve makrofajlar içinde hayatta kalan hücre içi bakteri popülasyonunu temsil eder.

Konak Hücrelerde Bakteriyel Enfeksiyonun Koloni Oluşturan Birim Testi ile Miktar Tayini

Bu videoda, anaerobik patojenik bir bakteri olan Porphyromonas gingivalis'in insan göbek damarı endotel hücrelerine (HUVEC'ler) yapışma ve istila etme yeteneğini değerlendirmek için bir teknik gösterilmektedir. Konakçı hücreleri bakterilerle enfekte ettikten sonra, konakçı hücreler hem yapışmış hem de içselleştirilmiş bakterileri serbest bırakmak için parçalanır. Lizat uygun bir ortamda kaplandığında, kolonilerin varlığı başarılı bakteri-konak hücre etkileşimlerini gösterir.

Anaerobik Bakteri-Konak Hücre Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Bakteriyel Enfeksiyon Testi

Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon profili oluşturmak için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Brucella enfeksiyonunda rol oynayan konak faktörlerinin mikroskopi tabanlı yüksek verimli taraması için iki test tanımlanmıştır. Giriş testi, Brucella girişi için gerekli olan konak faktörlerini ve hücre içi replikasyon için gerekli olanları uç nokta testini tespit eder. Alternatif yaklaşımlar için uygulanabilir olsa da, protokolleri göstermek için HeLa hücrelerinde siRNA taraması kullanılır.

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Öğrenin bakteriyel patojenlerin hücre dışına çıkışını analiz etme yöntemlerini in vitro ve in vivo enfeksiyon testleri kullanarak. Bu teknikler konak-patojen etkileşimlerini anlamak için değerli bilgiler sağlar.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Daha fazla video keşfet