Name: Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, düşük yoğunluklu darbeli ultrason stimülasyonunu (LIPUS) epifloresan mikroskobunda uygulayarak mekanobiyolojide hücresel tepkileri gerçek zamanlı incelemeyi. Bu yöntem, biyolojik örnekler üzerinde invaziv olmayan mekanik kuvvet uygulaması sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Drs. Mikhail Shapiro ve Nikita Reznik verimli tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu eser Western Üniversitesi Sağlık Bilimleri fonlarından start-up tarafından desteklenen ve NIH R21NS101384 verin.

1. artan akustik şeffaf Polyester Film hücrelerdeyse
<ol><li>12 mm delik boyutunu dikey bir basın matkap kullanarak standart 35 mm Kültür çanak alt matkap. Matkap yavaş hareket ve göz koruma giymek. Dış tarafta (Şekil 2) pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için bir bıçak kullanarak çanak alt bağlı plastik parçaları kaldırın.</li>
	<li>Deniz-grade epoksi veya tutkal yemeğin dış alt yüzeyinde ince bir tabaka uygulayın.</li>
	<li>Polyester (2.5 µm kalınlık) çanak dış alt yüzeyine karşı bir film yerleştirin ve sıkıca Epoksi/Yapıştırıcı film ve kalın plastik yüzey arasında eşit olarak yayılır emin olmak için tuşuna basın. Yavaşça film ile a düz yüzey (Şekil 2) oluşturmak için parmak santrifüj bir şekilde çekin.</li>
	<li>Epoksi/tutkal kuruduktan sonra kısaca durulama kuru polyester-alt çanağı ile % 95 etanol ve çanak ve içine yerleştirerek sterilize kapağı güçlü bir 254 nm UV uyarma kaynağı altında yüzey. Süresi ve yoğunluğu yaklaşık 330 mJ cm-2 en tip-in mikro-organizmaların tam imha için bir UV doz teslim etmek için ayarlayın. Bu enerji yaklaşık 5 dk 1000 µW cm-2 UV aydınlatma kullanarak bir süreye karşılık gelir.</li>
	<li>Aliquot ticari olarak mevcut hücre dışı matriks protein karışımları (EMPM) küçük tüpler (50-100 µL) ve store veya daha az steril koşullarda-20 ° C'de onları.</li>
	<li>Steril bir ortamda (Örneğin, bir Biyogüvenlik kabini içine), EMPM donmuş bir hisse senedi ile istenen bir kültür orta ve 1: 100 oranında seyreltin. Buz EMPM polimerizasyon oda sıcaklığında önlemek için çalışın. Hızla 100 µL üzerine polyester film orta karışımı uygulamak. Kısırlık korumak için kapağını geri yemek yer.</li>
	<li>EMPM kaplamalı polyester alt yemekleri 37 ° C'de kuluçka hücre kültür CO2 6-12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra aşırı orta Aspire edin ve doğrudan istenen yoğunluğu hücreleri ile yüzey temel olarak belirler. Kısırlık korumak için steril koşullar altında çalışır.</li>
</ol>2. LIPUS uygulama
<ol><li>Amacı, büyük çalışma hacmi ve aydınlatma donanımı olmayan dik bir mikroskop altında bir su deposu iletim yoluna koyun.</li>
	<li>Piyasada bulunan mikroskoplar bileşenleri'ni kullanarak, amacı aşağıda bir örnek sahibi ve bir dönüştürücü sahibi örnek sahibi altına yerleştirin. Sonraki örnek hizalama için arama ve ultrason, bu iki sahipleri çeviri etaplar bağlayın.<ol>
<li>Hareketli parçaları ve aktüatörler Çeviri aşamaları tank dışında veya su su zarar görmemesi için satırın üstüne yerleştirin. Sadece anodize alüminyum ve paslanmaz çelik gibi aşındırıcı malzemeler dalmış mikroskoplar bileşenlerinin kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tank daldırma dönüştürücü kullanarak daha önce deiyonize ve degassed su ile doldurun. Su hattı örnek sahibi (Şekil 3) yatay düzlemde ile aynı hizaya gelmelidir. Not: Deiyonize su elektrik kaplin yüksek elektrik alanları huzurunda önler. Gaz giderme Ayrıca saçılma ve akustik dalgalar değişikliklere önleyecektir. Su hattı dönüştürücü konum altında düşüyor bir pompa veya Vana kullanarak her deneme sonra su tahliye. Ayrıca, değiştirmek veya sık sık su filtre ve temizleme su deposu mikroorganizmaların gelişimini önlemek için gerektiği gibi.</li>
</ol>3. eğik akustik uyarma
<ol><li>Piyasada bulunan mikroskoplar bileşenleri'ni kullanarak, dönüştürücü bir eğik pozisyonda optik yol ile ilgili gelecek şekilde yönlendirin. Bu herhangi dalgalar-ecek var olmak matuf (Şekil 3 ve Şekil 4) örnek uzak yansıyan sağlayacaktır.</li>
</ol>4. sürüş dönüştürücü
Not: Ultrason güç çeviriciler salınan elektrik enerjisini mekanik genişleme/daralma bir piezoelektrik malzeme dönüştürmek. Bu dönüşüm enerji kaybı ısı enerjisi şeklinde üretir. Güç çeviriciler en yüksek giriş voltajı sınırı sahip iken, bu nedenle, onlar da piezoelektrik öğesine termal zarar görmemesi için bir elektrik güç sınırı sahip: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq1.jpg"> zaman elektrik simülasyon, P elektrik gücü (Watt) içinde göreli kısmını ile görev döngüsü Vrms alternatif gerilim kaynağı ve Z elektrik giriş ortalama kare kökü gerilimi (Volt içinde) Empedans (ohm içinde). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq2.jpg"> V,s dönüştürücü için uygulanan en yüksek tepe giriş voltajı.
<ol><li>İstenen frekansı, nabız, devir sayısı içeren bir sinüs dalga formu oluşturmak ve darbe tekrarlama frekansı bir ticari fonksiyon jeneratör kullanarak. Ancak, etkili bir şekilde standart ultrason güç çeviriciler kez sürücü için gerekli nispeten yüksek Vpp işlev üreteci (Yani, artış Vsgenliği) çıkışını yükseltmek için güç amplifikatörü eklenmesi gerektirir. Not: belirli bir çevirici 35 dir. Örneğin, bir çevirici'nın üretici güç sınırını belirtir W. Sinüsoidal tepe-için-pik gerilimi (Viçinde) 500 giriş mV adlı bir görev döngüsü % 50 ve 50 dB ile güçlendirilmiş/100 W amplifikatör bu dönüştürücü güç sınırı içinde?<ol>
<li>Bu soruyu cevaplamak için amplifikasyon sonra gerilim hesaplayın. Radyo frekanslı (RF) güç amplifikatörü için büyütme faktörü (dB) tarafından tanımlanır: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq3.jpg" style="opacity: 0.9;"> Böylece, güçlendirilmiş gerilim genlik çıkış Vs vardır (Vs Vdışarı=) in:<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq4.jpg"> Denklemler 1 ve 2 kullanarak ve 50 Ω Elektrik empedans kullanarak, bu gerilim tarafından oluşturulan karşılık gelen güçtür: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq5.jpg"> Bu stimülasyon bu nedenle dönüştürücü güç sınırı içinde.</li>
		<li>Yukarıdaki örnekte kullanarak, dönüştürücü'nın üreticisi tarafından sağlanan güç ve gerilim sınırları karşılık gelen dalga formu parametreleri (Vpp, frekans, darbe süresi ve darbe tekrarlama frekansı) hesaplama. Dönüştürücü ve bağlı diğer enstrümanlar zarar görmesini önlemek için bu sınırları saygı emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultrason dönüştürücü ile uyumlu bir frekans aralığındaki çalışır bir işlev üreteci seçin. İşlev üreteci dönüştürücü nominal en yüksek frekansa frekansını ayarlamak.</li>
	<li>İstenen süre ve tekrarlama frekansı işlev üreteci çekim modu kullanarak bir sinüsoidal gerilim darbe oluşturun. Tepe tepe gerilim istenen bir değere ayarlayın. Bu darbe süresi iki ardışık darbeleri arasında geçen saat daha kısa olduğundan emin olun.</li>
	<li>İşlev üreteci çıktısını bir osiloskop girişine bağlanarak istenen sinyalin dalga karşılık gelen onay.</li>
	<li>İşlev üreteci çıktısını bir RF Amplifikatör (Şekil 4) girifline ba¤lan›r. Stimülasyon parametreleri dönüştürücü'nın üretici sınırları içinde olduğundan emin olun.</li>
</ol>5. ışın hizalama
<ol><li>Bir frekans aralığı ve akustik yoğunluk frekans ile uyumlu ve ultrason dönüştürücü yoğunluğu ile çalışır bir hidrofon seçin.</li>
	<li>Dikkatle hidrofon sonda ucu konumundaki örnek (Şekil 4) konumuna karşılık gelen objektif görüş alanı içinde odak haline getirmek.</li>
	<li>Sonda ve dönüştürücü deiyonize ve degassed suya daldırılır emin olun. Bu onun kaplama alter ve ölçüm etkiler gibi su fiziksel herhangi bir nesne ile hidrofon ucu çarpmamayınasıl.</li>
	<li>Dönüştürücü bir brüt öncesi hizalamasını görsel olarak akustik ekseni hidrofon sonda doğru konumlandırma tarafından gerçekleştirin. Dönüştürücü'nın yüzeyi ve hidrofon ucu arasındaki mesafe yaklaşık dönüştürücü'nın odak uzaklığı karşılık emin olur.</li>
	<li>Bir osiloskop'ın sinyal girişi için çıkış hidrofon bağlayın. Eşitleme tetikleyici işlevi jeneratör başka bir osiloskop girişine bağlayın. Osiloskop üzerinde aynı anda her iki sinyali görselleştirin.</li>
	<li>Dönüştürücü ile birkaç ultrason döngüsü sırasında düşük iş hacmi ve sonda zarar görmesini önlemek için düşük genlik sürücü. Hidrofon'ın üreticisi güvenli kullanım koşulları ile hidrofon ipucu zarar görmesini önlemek için kontrol edin.</li>
	<li>S/bölümü topuzu hidrofon için dönüştürücü'nın yüzeyinden ultrason seyahat zamana göre ayarlayın. Osiloskop üzerinde hidrofon sinyal Eşitleme tetikleyici sonra arayın.</li>
	<li>Yavaş yavaş bir motorlu veya el ile XYZ sahne kullanarak dönüştürücü harekete. Dönüştürücü maksimal hidrofon sinyal (Şekil 4) ile ilişkili olan pozisyon içine bırakın. Not: sinyal yok mümkün olduğunu tespit edilirse akustik bakliyat yoğunluğu çok düşük olan veya ışın yanlış hizalanan veya bir nesne tarafından dağınık. Düzenli olarak hidrofon ve dönüştürücü görsel olarak önceden hizalanmış ve hiçbir kabarcıklar veya fiziksel nesne yolu polyester film dışında mevcut olduğunu kontrol edin. Sinyal hala algılanırsa, hidrofon sinyal genliği artırmak için küçük bir miktar tarafından giriş voltajı yükseltin.</li>
</ol>6. ultrason nabız basıncı ve yoğunluk tayini
<ol><li>Hizalanmış ışın ile çeşitli voltaj dönüştürücü sürüş için osiloskop, çıkış hidrofon en yüksek zirve genliğini ölçmek. Hidrofon'ın üretici tarafından önerilen basınç sınırını aşmayacak şekilde emin olun.</li>
	<li>Bu ölçümler basıncı ve/veya kalibrasyon yöntemiyle hidrofon'ın üreticisi tarafından sağlanan akustik yoğunluk değerleri dönüştürmek. Not: Akustik yoğunluk formülü kullanarak baskı ve tersi belirlenebilir: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq6.jpg"> ben (W m-2), akustik basınç ile P (Pa), akustik basınç ρ malzeme (1.000 kg m-3 su için) ve c orta propaganda içinde ses hızı yayma yoğunluğu (su, c = 1500 m s-1).</li>
	<li>Bu ölçüler kullanarak kalibrasyon eğriler oluşturmak. Not: Basınç vs gerilim ve yoğunluk vs. gerilim eğrileri sırasıyla bir doğrusal ve parabolik şekli var.</li>
	<li>İstenen bir sürüş gerilim basıncı ve/veya yoğunluk değeri karşılık gelen kalibrasyon eğrisi kullanarak belirleyin.</li>
</ol>7. kalsiyum-duyarlı/LIPUS canlı hücre floresans görüntüleme
<ol><li>İstenen görüntü arabellek bir hücre permeant kalsiyum duyarlı boya 5 mikron içeren hücre kültür orta yerine (Örneğin, Fluo-4 değilim). Kültür çanak CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde hücreleri aynı tampon boya ücretsiz ile yıkayın.</li>
	<li>Çanak örnek tutucuya yerleştirin. Mavi ışık aydınlatma kullanarak hücreleri heyecanlandırmak (490 nm) ve aşırı ağartma veya piksel doygunluk kaçınmak için uyarma yoğunluğu ve fotoğraf makinesi pozlama ayarı.</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme istediğiniz görüntü alma ayarlarını kullanarak gerçekleştirin. Bir daldırma amacı istenmeyen yansımalar (bkz. Şekil 4) azaltmak için daha iyi görüntü kalitesi ve uzun çalışma mesafesi ile kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+intensity+focused+ultrasound%3A+The+fundamentals%2C+clinical+applications+and+research+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+and+Interventional+Imaging%22%5BJournal%5D)">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li>
<li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aToccaceli%2C+G+%22Emerging+strategies+and+future+perspective+in+neuro-oncology+using+Transcranial+Focused+Ultrasound+Technology%22">Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology</a>. , World Neurosurgery. (2018).</li>
<li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanobiology+of+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li>
<li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound%3F+A+continuum+mechanics+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li>
<li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li>
<li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity%2C+low-frequency+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511(2008).</li>
<li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Therapeutic+Ultrasound%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30(2017).</li>
<li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li>
<li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264(2015).</li>
<li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li>
<li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+modulates+ion+channel+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170(2016).</li>
<li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115(2013).</li>
<li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li>
<li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-biophysics+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148(2017).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736(2012).</li>
<li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li>
<li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li>
<li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344(2017).</li>
<li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Büyük avantajı odaklı ultrason non-invaziv mekanik ve/veya termal enerji yüksek spatio-temporal hassasiyetle biyolojik örnekler sunmak için onun yetenek olduğunu. Mekanik olarak teşvik amacıyla diğer teknikleri genellikle istihdam invaziv fiziksel problar (Örneğin, hücre alay) hücreleri veya yabancı nesneler (Örneğin, Optik cımbız) yüksek enerjili lazer ışınları etkileşim gerektirir. Manyetik Isıtma biyolojik örnekler içinde belirli uzamsal konumları ısı olabilir ama yabancı Manyetik Nano tanecikleri ol...

Birçok hastalığın bazı formu invaziv tıbbi müdahale gerektirir. Bu yordamları çoğu kez pahalı, riskli, kurtarma dönemleri gerektirir ve böylece bir yük sağlık sistemleri için ekleyin. Non-invaziv tedavi yöntemleri konvansiyonel cerrahi işlemler daha güvenli ve daha ucuz alternatifler sunmak potansiyeline sahip. Ancak, farmakoterapi veya Transkraniyal Manyetik stimülasyon gibi güncel non-invaziv yaklaşımları kez ticaret-off doku penetrasyon, kronolojik zamanmekansal çözünürlük ve istenmeyen hedef kapalı etkileri arasında tarafından sınırlıdır. Bu bağlamda, biyolojik fonksiyonları işlemek için potansiyeli olan umut verici bir non-invaziv teknoloji odaklı bir ultrason teşkil derin dokularda yüksek kronolojik zamanmekansal doğruluk ve sınırlı hedef kapalı etkileri içinde.
Odaklı ultrason stimülasyon oluşur hassas yerlerde akustik enerji sunma Derinlerde yaşayan organizmalar. Akustik darbe parametreleri bağlı olarak, bu enerji çeşitli tıbbi kullanımlar olabilir. Örneğin, gıda ve İlaç İdaresi onaylanmış yoğun odaklı ultrason (HIFU) kullanımı için prostat tümörleri, tremor neden olan beyin bölgeleri, uterin fibroids ve kemik metastazı1 ağrı neden sinir uçlarının termal ablasyon . HIFU aracılı difüzörü kavitasyon de geçici kan - beyin bariyerini sistemik tarafından idare edilen tedavi2hedeflenen teslim etmek için açmak için kullanılır. Kayma en yüksek Nabız-ortalama yoğunluğu (bensppa) ve kayma en yüksek ortalama zamansal yoğunluk (benspta) uygulamalar genellikle birkaç kW cm-2 ve nabız basıncı MPa birkaç onlarca üretmek HIFU için kullanılan. Bu yoğunluk değerleri çoğu uzakta FDA onaylı bensppa vespta sınırları tanılama ultrason, 190 W cm-2 ve 720 mW cm-2, sırasıyla3. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda içinde veya yakınında tanılama ultrason yoğunluğu sınırları (LIPUS) dizi etkili ve güvenli bir şekilde uzaktan nöral işlemek için4ateş vardır o tahribatsız pulsed ultrason stimülasyon göstermiştir, 5,6,7,8, hormon salgılanması9,10 ve Biyomühendislik hücreleri11. Henüz, hangi hücreleri hissediyorum ve ultrason için yanıt hücresel ve moleküler mekanizmaları belirsiz, klinik LIPUS tercümesi iyileştirmelerden kalır. Dolayısıyla, son birkaç yıl içinde Yapay membran, kültürlü hücreleri ve hayvanlar ultrason ile uyarılan biyofiziksel ortaya çıkarmak için bir ivme kazanmış ve fizyolojik süreçleri LIPUS12,13tarafındanmodülasyonlu, 14,15.
Fiziksel bir medya yayılıyor bir titreşim ses oluşur. Ultrason ile bir frekans insan sesli aralığı (Yani, yukarıda 20 kHz) yukarıda bir sesi. Bir laboratuvar ortamda ultrason dalgaları genellikle belirli bir yüksek frekans bant içinde salınan bir elektrik alanı cevaben titreşir bir materyal içeren piezoelektrik güç çeviriciler tarafından üretilmektedir. Güç çeviriciler iki türü bulunmaktadır: tek öğe dönüştürücüler ve dönüştürücü diziler. Tek öğe piezoelektrik güç çeviriciler odaklama bir objektif olarak geçecek olan ve, bu nedenle akustik enerji odak bölgesi adı verilen tanımlanmış bir bölgeye yoğunlaşmaktadır bir eğri yüzey sahip. Tek öğe güç çeviriciler çok daha ucuz ve daha kolay dönüştürücü diziler çalıştırmak. Bu madde tek öğe dönüştürücü üzerinde durulacak.
Bir odaklanan tek öğe çevirici odak bölgenin boyutunu akustik mercek geometrik özellikleri ve akustik frekansını bağlıdır. Bir milimetre boyutunda odak bölge bir tek öğe çevirici ile elde etmek için ultrason frekansları MHz aralığında genellikle gereklidir. Ne yazık ki, bu tür frekansta akustik dalgalar çok hızlı bir şekilde ne zaman hava gibi ince bir ortamda yayılır zayıflatılmış. Böylece, MHz ultrason dalgaları üretilecek ve su gibi daha yoğun bir malzeme örnek yayılır gerek. Bu LIPUS modalite mikroskop için entegre ilk meydan okuma kabul ettiğiniz anlamına gelir.
Fiziksel arabirimler arasında (ki bir ürün malzeme yoğunluğu ve akustik hız) farklı akustik impedances akustik yol boyunca malzemelerle en aza indirmek için ikinci bir mücadeledir. Bu arabirimler yansıtabilir, olurlar, dağılım ve akustik dalgalar, etkili bir örnek için teslim akustik enerji miktarı ölçmek üzere emerler. Onlar istenmeyen mekanik eserler acabilirsiniz. Örneğin, ileri yayılıyor olanlar ile müdahale backpropagating dalgalar yansımaları üretilen dik akustik uyuşmazlığı empedans arabirimleri oluşturun. Girişime yol boyunca dalgalar her diğer alanlarda düğümleri ve anti-düğümleri, denilen bölgeler alternatif, özetle denilen sabit bölgelerinde, sözde duran dalgalar (Şekil 1) oluşturmayı iptal etmek. Onlar içinde vivoolmayabilir gibi bu deneysel arabirimler içinde vitro ortadan kaldırmak veya kontrol edebilmek deneyci için önemlidir.
Optik gazetecilere floresans ölçüm şeffaf biyolojik örnekler gerçek zamanlı olarak ve hiçbir fiziksel rahatsızlık ile sorguya çekmek için iyi bilinen bir yöntemdir. Bu yaklaşım böylece herhangi bir fiziksel probları sonicated alanında mevcut mekanik eserler tanıtacak olarak LIPUS çalışmaları için idealdir. Bu iletişim kuralı uygulama ve LIPUS çalışması için bir ticari epi-floresan mikroskop açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>büyük çalışma hacmine sahip dik mikroskop</td><td>Thorlabs</td><td>CERNA</td><td></td></tr><tr><td>büyük çalışma hacmine sahip dik mikroskop</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope</td><td></td></tr><tr><td>optomekanik bileşenler</td><td>Thorlabs</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>iğne hidrofon</td><td>ONDA Corporation</td><td>HNP/C/R/A/T serisi + AH/G ön amplifikatör</td><td></td></tr><tr><td>iğnesi hidrofon</td><td>Hassasiyeti Akustik</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>fiber optik hidrofon</td><td>ONDA Corporation</td><td>HFO serisi</td><td></td></tr><tr><td>fiber optik hidrofon</td><td>Hassas Akustik</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>osiloskop</td><td>Keysight Teknolojisi</td><td>DSOX2004A (4 kanallı 70MHz)</td><td></td></tr> <tr><td>fonksiyon üreteci</td><td>Keysight Teknolojisi</td><td>33500B (20MHz tek kanallı)</td><td></td></tr> <tr><td>RF güç amplifikatörü</td><td>Elektronik Navigasyon Endüstrileri (ENI)</td><td>325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td><td></td></tr><tr><td>RF güç amplifikatörü</td><td>Elektronik ve İnovasyon (E& I)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>daldırma ultrason dönüştürücü</td><td>Olympus</td><td>odaklanmış daldırma transdcuers</td><td></td></tr><tr><td>daldırma ultrason dönüştürücü</td><td>Benthowave Enstrüman</td><td>HiFu dönüştürücü BII-76 serisi</td><td></td></tr><tr><td>daldırma ultrason dönüştürücü</td><td>Hassas Akustik</td><td>Piezo-seramik veya HiFu dönüştürücüler</td><td></td></tr><tr><td>daldırma ultrason dönüştürücü</td><td>Ultrasonik-S-lab</td><td>Yüksek</td> yoğunluklu Matrigel Corning VWR 80094-330 Mylar film 2.5 mikron Chemplex CAT.NO:107 sipariş üzerine <td></td>üretilen HiFu</tr><tr><td></td><td>dönüştürücüler</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Yumuşak dokulara nüfuz düşük yoğunluktaki ultrason darbeleri odaklanarak, LIPUS sinir ateş, hormon salgılanması ve genetik olarak yeniden programlanan hücreleri uzaktan ve güvenli bir şekilde işlemek için umut verici bir biyomedikal teknoloji temsil eder. Ancak, bu teknoloji tıbbi uygulamalar için çeviri şu anda tarafından hangi biyofiziksel mekanizmaları eksikliği doku anlamda hedef ve LIPUS için yanıt engel oluyor. Bu mekanizmalar tanımlamak için uygun bir yaklaşım sinyal yolları temel belirlemek için LIPUS ile birlikte optik biyosensörler kullanmak olacaktır. Ancak, LIPUS floresan mikroskop için uygulama yansıtmak, emer ve akustik dalgalar yetisiyle fiziksel arabirimleri varlığı nedeniyle istenmeyen mekanik eserler tanıştırayım. Bu makale LIPUS için piyasada bulunan dik epi-floresan mikroskoplar akustik yol boyunca fiziksel arabirimleri etkisini en aza indirerek dahil etmek için adım adım bir yordam sunar. Basit bir yordam bir tek öğeli Ultrason çevirici çalışmasına ve dönüştürücü odak bölge objektif odak noktası getirmek için tasvir edilmiştir. LIPUS kullanımı ile LIPUS kaynaklı kalsiyum geçişler kalsiyum Imaging'i kullanma ölçülen kültürlü insan glioblastoma hücrelerdeki örneği gösterilmektedir.

Şekil 5 LIPUS deney ile kalsiyum görüntülemede Multiplexed komutu örneğidir. Glioblastoma hücreleri (A-172) standart Kültür (% 10 serum ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiş) orta EMPM kaplı polyester film üzerinde yetiştirilen ve kalsiyum duyarlı floresan muhabir Fluo-4 ile inkübe AM. Hücreleri bir 10 X daldırma lens ile ve bir beyaz LED ışık kaynağı ile aydınlatılan görüntüsü ve floresan ışık standart GFP filtre kümesi kullanılarak toplanmıştır. LIPUS tarafın...

Düşük yoğunluklu Geniş puls ultrason stimülasyon (LIPUS) yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile endojen veya mühendislik hücrelerinin non-invaziv mekanik uyarılması için bir yöntemi var. Bu makalede nasıl bir epi-floresan mikroskop LIPUS uygulanacağı ve akustik empedans uyuşmazlığı istenmeyen mekanik eserler önlemek için ultrason yol boyunca en aza indirmek nasıl açıklanır.

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Bu yöntem, biyolojik örneklerin düşük yoğunluklu ultrason stimülasyonu tarafından üretilen mekanik kuvvetlere nasıl tepki verdiği gibi mekanobiyolojideki anahtar soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir deneycinin mekanik kuvvetleri bir örneğe noninvaziv olarak uygulamasına ve çeşitli biyolojik çevreleri gerçek zamanlı olarak ölçmesine olanak sağlamasıdır. Başlamak için, dikey bir pres matkap kullanarak standart 35 milimetrelik kültür çanak altında yavaş yavaş 12 milimetrelik bir delik matkap.Delindikten sonra, dış tarafta pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için bir bıçak kullanarak yemeğin dibine bağlı plastik parçaları çıkarın. Daha sonra, yemeğin dış alt yüzeyine deniz seviyesinde epoksi veya tutkal ince bir tabaka uygulayın. Yapıştırıcının üzerine, yapıştırıcının film ile kalın plastik yüzey arasında eşit olarak yayıldığından emin olmak için sıkıca bastırarak iki noktalı beş mikron kalınlığında polyester filmi yerleştirin.Yavaşça düz bir yüzey oluşturmak için, parmakları ile bir santrifüj şekilde film çekin. Yapıştırıcı kuruduktan sonra polyester alt kabı %95 etanol ile kısa bir süre durulayın. Daha sonra, UV güçlü bir 254 nanometre UV uyarma

multiplexing-focused-ultrasound-stimulation-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Floro etiketli antikorların ardışık bağlanması ve elüsyonunu kullanarak heterojen nano yapılardaki çoklu molekülleri tek molekül doğruluğu ile görüntüleme yöntemi gösteriyoruz.

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Sıkı odaklı femtosaniye lazer, gerçek zamanlı gözlem ve fotostimülasyon sağlayan bir Konfokal mikroskopiye birleştirilerek hücrelere hassas stimülasyon sağlayabilir. Fotostimulasyon, ERK sinyalizasyon yolu ve reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal yanıp sönme dahil olmak üzere hücre moleküler olaylarını etkinleştirebilir.

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, kan-beyin bariyer geçirgenliğini artırmak için odaklanmış ultrason ve mikrobubble tedavileri sırasında kemirgen beyninin gerçek zamanlı in vivo multifoton floresan görüntülemesini sağlayan cerrahi ve teknik prosedürleri açıklar.

Kan-Beyin Bariyer Geçirgenliğini Artırmak için Odaklanmış Ultrason ve Mikrobubble Tedavilerini Görselleştirmek için Gerçek Zamanlı Intravital Multifotoğraf Mikroskopisi

Sunulan protokoller, aktivasyon mekanizmaları ve biyoeffeksleri de dahil olmak üzere ultrason tetiklenen ilaç dağıtım uygulamaları için tasarlanmış floresan etiketli mikrobubbles'ın yanıtını karakterize etmek için kullanılabilir. Bu makale, ilgili uzunluk ve zaman ölçeklerini yakalamak için gerçekleştirilen bir dizi in vitro ve in vivo mikroskopi tekniğini kapsamaktadır.

Ultrason Tetiklenen İlaç Salınımı için Floresan Etiketli Mikrobubbles'ın Karakterizasyonu için Çok Zamanlı Mikroskopi Yöntemleri

Sistem konfigürasyonu, optik hizalama, numune hazırlama ve deneysel prosedürler dahil olmak üzere cerrahi marj analizi için intraoperatif olarak histolojik görüntüler sağlayabilen yüksek hızlı ve üstü açık bir ultraviyole fotoakustik mikroskop gösterilmiştir.

Derin Öğrenme destekli Sanal Boyama ile Histolojik Görüntüleme için Yüksek Hızlı Ultraviyole Fotoakustik Mikroskopi

Protokol, serbest hareket eden farelerde eşzamanlı odaklanmış ultrason nöromodülasyonu ve fiber fotometri kaydının tüm operasyonel iş akışı için dönüştürücü üretimini, parametre raporlamasını, cerrahi prosedürü ve sinyal kaydını içerir.

Serbest hareket eden farede eş zamanlı odaklanmış ultrason nöromodülasyonu ve fiber fotometri kaydı

Spektral Yinelemeli Ağartma Çoklamayı Genişletir (IBEX), spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için heparin blokajı ekleyerek ve otofloresansı bastırmak için hesaplamalı karıştırma ile spektral algılamadan yararlanarak temel IBEX tekniğini temel alır. Bu yaklaşım, arka plan kaynaklarını azaltırken görüntü elde etmeyi hızlandırır ve sağlam, çok yönlü, yüksek parametreli uzamsal proteomik analizlere olanak tanır.

Spesifik Olmayan Doku Floresansını En Aza İndirmek için Spektral Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Pleks Görüntüleme

Öğrenin, düşük yoğunluklu darbeli ultrason stimülasyonunu (LIPUS) epifloresan mikroskobunda uygulayarak mekanobiyolojide hücresel tepkileri gerçek zamanlı incelemeyi. Bu yöntem, biyolojik örnekler üzerinde invaziv olmayan mekanik kuvvet uygulaması sağlar.

Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı

Daha fazla video keşfet