Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı

Bu yöntem, biyolojik örneklerin düşük yoğunluklu ultrason stimülasyonu tarafından üretilen mekanik kuvvetlere nasıl tepki verdiği gibi mekanobiyolojideki anahtar soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir deneycinin mekanik kuvvetleri bir örneğe noninvaziv olarak uygulamasına ve çeşitli biyolojik çevreleri gerçek zamanlı olarak ölçmesine olanak sağlamasıdır. Başlamak için, dikey bir pres matkap kullanarak standart 35 milimetrelik kültür çanak altında yavaş yavaş 12 milimetrelik bir delik matkap.

Delindikten sonra, dış tarafta pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için bir bıçak kullanarak yemeğin dibine bağlı plastik parçaları çıkarın. Daha sonra, yemeğin dış alt yüzeyine deniz seviyesinde epoksi veya tutkal ince bir tabaka uygulayın. Yapıştırıcının üzerine, yapıştırıcının film ile kalın plastik yüzey arasında eşit olarak yayıldığından emin olmak için sıkıca bastırarak iki noktalı beş mikron kalınlığında polyester filmi yerleştirin.

Yavaşça düz bir yüzey oluşturmak için, parmakları ile bir santrifüj şekilde film çekin. Yapıştırıcı kuruduktan sonra polyester alt kabı %95 etanol ile kısa bir süre durulayın. Daha sonra, UV güçlü bir 254 nanometre UV uyarma kaynağı altına yerleştirerek çanak sterilize.

Santimetre kare başına yaklaşık 330 milijoule uv dozu sunmak için süre ve yoğunluğu ayarlayın. Daha sonra, 1-100 oranında istenilen kültür ortamı ile ticari olarak kullanılabilir ekstrasellüler matriks protein karışımı seyreltin. Matris polimerizasyonunu önlemek için buz üzerinde çalışın ve orta karışımın 100 mikrolitresini polyester filme hızlı bir şekilde uygulayın.

Sterilitesini korumak için kapağı tekrar yemeğin üzerine yerleştirin. Bir kez kapalı, bir hücre kültüründe matris kaplı, polyester alt yemekleri kuluçka, karbondioksit tamponlu inkübatör 37 santigrat derece altı ila 12 saat. Kuluçkadan sonra, aşırı orta aspire ve doğrudan istenilen yoğunlukta hücrelerle yüzey tohum.

Dik bir mikroskop amacı nın altına bir su tankı yerleştirin. Daha sonra, ticari olarak kullanılabilir optomekanik bileşenleri kullanarak, örnek tutucuyu hedef ve dönüştürücü arasında yerleştirin. Hareket eden parçaların ve çeviri aşamalarının aktüatörlerinin su hasarını önlemek için tankın dışında veya su hattının üzerinde olduğundan emin olun.

Daha sonra, daldırma transdüserkullanmadan önce, tankı numune tutucunun yatay düzlemine kadar deiyonize ve gazsız su ile doldurun. Aşındırıcı olmayan, ticari olarak mevcut optomekanik bileşenleri kullanarak, optik yol ile ilgili olarak eğik bir konumda transdüser emin olun. Bu, yansıyan dalgaların örnekten uzaklaştırılmasını sağlayacaktır.

İşlev jeneratörünün frekansını transdüserin nominal tepe frekansına ayarlayın. Daha sonra, fonksiyon jeneratörünün patlama modunu kullanarak istenilen süre ve tekrarlama frekansında bir sinüzoidal voltaj darbesi oluşturun. Ardından, tepeden tepeye gerilimi istenilen değere ayarlayın.

Nabız süresinin ardışık iki darbe arasında geçen süreden daha kısa olduğundan emin olun. İşlev jeneratörünün çıktısını bir osiloskop girişine bağlayın. Dalga formunun istenen sinyale karşılık geldiğini doğrulamak için osiloskopu kullanın.

Daha sonra, fonksiyon jeneratörünün çıktısını düzgün büyüklükteki bir RF amplifikatörün gücüne bağlayın. Ultrason transdüseriyle uyumlu bir frekans aralığı ve akustik yoğunlukla çalışan bir hidrofon sondası kullanarak, sondanın ucunu numunenin konumundaki hedefin görüş alanı içinde dikkatlice odakhaline getirin. Hem prob hem de transdüserin su banyosuna daldırDığından emin olun ve akustik eksenini hidrofon sondasına görsel olarak yerleştirerek transdüserin brüt ön hizalanmasını gerçekleştirin.

İkisi arasındaki mesafenin dönüştürücünün odak uzaklığıyla örtüşteceğinden emin olun. Hidrofonun ucunu su dışında herhangi bir fiziksel nesneyle çarpmayın, çünkü bu kaplamasını değiştirecek ve ölçümü etkileyecektir. Daha sonra, hidrofon çıkışını osiloskopun sinyal girişlerinden birine bağlayın.

Ardından, işlev jeneratöründen senkronizasyon tetikleyicisini başka bir osiloskop girişine bağlayın. Her iki sinyali de aynı anda osiloskopta görselleştirin. Daha sonra, sonda zarar önlemek için düşük görev döngüsü ve düşük genlik birkaç ultrason döngüleri ile transdüser sürücü.

Hidrofon ucuna zarar vermemek için hidrofon üreticisinin güvenli çalışma koşullarını kontrol edin. S-bölümü bünyesini transdüserin yüzeyinden hidrofona ultrasonun seyahat süresine göre ayarlayın. Senkronizasyon tetikleyicisi sonra osiloskop üzerinde bir hidrofon sinyali arayın.

Daha sonra, motorlu veya manuel XYZ aşaması nı kullanarak dönüştürücüsü yavaşça çalıştırın. Transdüseri maksimal hidrofon sinyaliyle ilişkili konuma yerleştirin. Kiriş şimdi hizalanmış ken, transdüseri yönlendiren çeşitli voltajlar için osiloskoptaki hidrofon çıkışının tepeden tepegenliğini ölçün.

Hidrofonun basınç limitini aşmamaya özen. Fluo-4 gibi kalsiyuma duyarlı bir boyanın beş mikromolar içeren istenilen görüntüleme tamponu ile hücrenin kültür ortamını değiştirin. Sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derece bir karbondioksit tamponlu kuluçka kültür çanak kuluçka. Kuluçkadan sonra, hücreleri boyasız aynı tamponla dikkatlice yıkayın.

Daha sonra, tabak örnek tutucuyerleştirin. 490 nanometre de mavi ışık aydınlatma kullanarak hücreleri heyecanlandırın. Aşırı ağartma veya piksel doygunluğu önlemek için uyarma yoğunluğunu ve kamera maruziyetini ayarlayın.

Daha iyi görüntü kalitesi için uzun bir çalışma mesafesi ile daldırma hedefi kullanarak ve istenmeyen yansımaları azaltmak için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin. Burada glioblastoma hücreleri standart kültür ortamında hücre dışı matris kaplı polyester filmde gösterilmiştir. Bu hücreler kalsiyuma duyarlı floresan bir muhabirle kuluçkaya yatırıldı.

Bu resimde, kırmızı nokta bir görüntü işleme yazılımı kullanılarak tanımlanan tek tek floresan hücreleri temsil eder. Ultrason ile 10 saniye boyunca uyarılma üzerine, güçlü kalsiyum yükseklikleri ilgi birçok bölgede görselleştirilmiş edildi. İlgi alanı etkinleştirilen bölgelerin sayısı zaman içinde burada gösterilir.

Ultrason ile 10 saniyelik aktivasyon sonrasında bölgelerin yaklaşık %70'inin kullanıcı tarafından tanımlanan eşik değerlerinin üzerinde olduğu saptandı. Bu işlemi denerken, floresan ölçümü yapmadan önce ultrason ışını hizalamak için hatırlamak önemlidir.