Name: Calretinin için Immünostasyon rektal emiş biyopsisi ile Hirschsprung hastalığının tanısı, S100 protein ve protein gen ürün 9,5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Öğrenin, rektal emiş biyopsilerinde immunostaining protokolü ile Hirschsprung hastalığını kalretinin, S100 ve PGP9.5 belirteçleriyle tanımayı. Bu yüksek duyarlılıklı yöntem, ganglion hücrelerinin varlığını görselleştirerek pediatrik cerrahide güvenilir tanı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Film Laboratuvarı sağlayan onun büyük yardım için Tang weibing teşekkür ederiz. Bu yazı kamu refah araştırma tarafından desteklenmektedir ve özel fonlar Çin Ulusal Sağlık ve aile planlaması (Grant No. 201402007) alındı.

Bu protokol Huazhong bilim ve Teknoloji Üniversitesi birlik Hastanesi araştırma etiği Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. rektal emiş biyopsisi
<ol><li>Rektal emiş biyopsisi ile iyi eğitimli bir Pediatrik cerrah ve Rbi2 emiş Rektal biyopsi sistemini kullanarak bir asistanın Velinden bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra gerçekleştirin.<ol>
<li>Aşağıdaki endikasyonlara sahip hastalarda RSB gerçekleştirin: bebeklerde mekonyum veya çocuklarda kabızlık olmadan veya uzun süreli şişkinlik geçememesidir; defekasyonu tamamlamak için parafin yağa ihtiyacı olan uzun süreli kabızlık olan çocuklar; bir enterostomi geçiren çocuklarda bilinmeyen nedenlerden dolayı bağırsak tıkanıklığı veya bağırsak perforasyonu. Not: RSB için kontrendikasyonlar aşağıdaki gibidir: kötü fiziksel durumda olan veya RSB toleranslı olmayan ciddi semptomlara sahip çocuklar; Akut aşamalı enterokolit olan çocuklar; Tam şifa olmadan intestinal anastomoz geçiren çocuklar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bağırsak hazırlama olarak normal bir tuzlu tutma lavmanı gerçekleştirin 36 h prosedür önce gevşek dışkı ve mukoza aşırı ödem önlemek için. Çocuk şiddetli kabızlık varsa magnezyum sülfat solüsyonu ekleyin. K vitamini (1 mg/kg) yenidoğan için yönetin. Not: gerekli olmadığı gibi, preoperatif kan testleri yapmak veya antibiyotik yönetmek etmeyin.</li>
	<li>Hastaya litotomi konumuna koyun. Ceket parafin yağı ile tüp yüzeyi. Arka veya lateral duvarlar bakan yan delik ile rektum içine künt uçlu tüp 4-7 cm yerleştirin.</li>
	<li>Yan deliğin rektal duvara yeterli yapışmasını kolaylaştırmak için tüpün üzerine nazik basınç uygulayın. Tetiği basın ve aracı hemen geri çekin.</li>
	<li>Biyopsi aleti, 3 cm çapı 2 mm ve diş hattının 6 cm üzerinde, anteriora ve posteriora kadar 4 emme biyopsisi elde etmek için kullanın. Numuneyi, tuz ile nemlendirilmiş gazlı bez üzerine yerleştirmek için bir iğne kullanın.</li>
	<li>Hastanın rektal kanamayı çıkarmaması için prosedürden 2 h 'ye kadar dikkat edin. RSB sonra ilk 24 h daha fazla rektal ve anal manipülasyon kaçının.</li>
</ol>2. RSB bölümlerinin hazırlanması
<ol><li>Dokuyu düzeltmek için 6 saat boyunca rektal emiş biyopsisi% 4 paraformaldehit olarak yerleştirin. Doku hacmine göre 5 kat daha fazla bir fiksatif hacmi kullanın.</li>
	<li>11 saat boyunca patolojik doku kurutucu kullanarak dokuyu kurutur. Tüm programlanmış süreç aşağıdaki 5 adımda oluşur:<ol>
<li>Dokusunu formaldehit içine yerleştirin ve 1 h için düzeltin.</li>
		<li>4 h için 75% etanol içinde doku yerleştirin.</li>
		<li>Mutlak etanol içinde doku yerleştirin (iki değişiklik, 1 h her).</li>
		<li>Doku mutlak etanol (iki değişiklik, 30 dk her) yerleştirin.</li>
		<li>Dokuyu ksilene yerleştirin (üç değişiklik, 1 saat her biri).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dokusunu Parafin balmumu (58-60 °C) (üç değişiklik, 1 saat her) yerleştirin. Parafin bloklarında RSB dokularını katıştırın.</li>
	<li>Doku tamamen tam bir bölüm uçağı ile maruz kadar bir mikrotome kullanarak parafin blokları Trim.</li>
	<li>Bir mikrotome ile 0,4 μm bölümlere blokları kes.</li>
	<li>Bölümleri düz bir plaka içine yaymak için izin vermek için her biri birkaç saniye için 45-50 °C su içine bölümleri yerleştirin.</li>
	<li>Parafin bölümlerini slaytlar üzerine aktarın.</li>
	<li>3-5 h için 60 °C ' lik bir fırında slaytlar pişirin. çok uzun süre pişirmeyi kaçının, bu da antijenlerin kaybına yol açabilir.</li>
	<li>Deparafinize slaytlar Ksilin içine yerleştirin (2 değişiklikler, 15 dk her).</li>
	<li>Mutlak etanol içinde slaytlar hidrat, 95%, 80%, ve 75% etanol için 5 dk her. Daha sonra, onları reverse osmoz (RO)-arıtılmış suda 5 dakika daha durulayın.</li>
</ol>3. antijen alımı
<ol><li>200 ml ro-arıtılmış su ile 4 ml EDTA antijen alma tamponunu karıştırarak kalretinin alımı için çalışma seyreltme yapın. 99 mL RO-arıtılmış su ile 1 mL sitrik asit sodyum sitrat tamponu (100x) karıştırarak S100 ve PGP 9.5 alımı için çalışma dilüsyonları yapın. Not: Calretinin, EDTA alma çözümüyle tercihen alınabilir. Ancak, sitrik asit sodyum sitrat tampon, S100 ve PGP 9.5 alınması için daha uygundur.</li>
	<li>Slaytları bir danışman boyama kavanozu içine yerleştirin. Alma çözeltisi ile kavanoz doldurun ve önceden ısıtılmış kaynar su banyosu içine yerleştirin. 20 dakika boyunca Kaynatıldıktan sonra, kavanozu su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. Soğutma işlemi yaklaşık 10 dakika sürer. slaytları çıkarın ve fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yavaşça bir kez yıkayın.</li>
	<li>Doku etrafında bir marker kalem ile bir daire çizin ve aşağıdaki prosedürler için ıslak bir kutu hazırlayın.</li>
</ol>4. engelleme
<ol><li>3 mL 30% H2O2 ile 27 ml ro-arıtılmış su karıştırarak çalışma seyreltmeleri yapın.</li>
	<li>İki veya üç damla ekleyin 3% H2O2 çözüm dropwise doku üzerine peroksiformlar engellemek için. Çözüm daire taşması değil emin olmak için hemen H2O2 çözüm ekleyin. 20 dakika boyunca 37 °C ' lik kuluçte peroksiklenin engellenmesini gerçekleştirin.</li>
	<li>Slaytları PBS ile hafifçe durulayın (üç yıkanması, her biri 5 dk.).</li>
	<li>5% Sığır serum albümin (BSA, 30 mL RO-arıtılmış su ile 1,5 g BSA tozu karıştırılarak hazırlanmış) ile 37 °C ' de 20 dakika boyunca slaytları engelleyin. Not:% 3 H2O2 ile engelleme, spesifik olmayan lekenin% 95 'ini engelleyebilir ve% 5 BSA ile engelleme, spesifik olmayan lekenin% 5 'ini engelleyebilir. Güvenilir bir sonuç elde etmek için iki yöntemi birleştirin.</li>
</ol>5. antikor reaksiyonu
<ol><li>% 5 BSA çıkarın ve 50 μL primer antikor (calretinin, S100 veya PGP 9.5) ' i slayda ekleyin. Gece 4 °C ' de inküyün.</li>
	<li>Slaytı PBS ile yıkayın (üç kez, her biri 3 dakika).</li>
	<li>Bölüm için 50 μL polimer arttırıcı (reaktif A; bkz. malzeme tablosu) ekleyin ve 37 °c ' lik kuluçte 20 dakika boyunca inküye yapın. Ardından, slaytı PBS ile yıkayın (üç kez, her biri 3 dakika).</li>
	<li>Bölüme 50 ikincil antikor B (keçi Anti-tavşan/fare IgG ikincil antikor) μL ekleyin ve 37 °C ' lik inkübte 30 dakika boyunca Kuluçk yapın. Bölüm PBS (üç kez, 5 dk her) ile yıkayın.</li>
</ol>6.3, 3-diaminobenzidin ve hematoxylin boyama
<ol><li>1,5 mL 'Lik bir tüpe 850 μL RO-arıtılmış su ekleyin ve 1 ml 3, 3-diaminobenzidin (DAB) çalışma çözeltisi toplam elde etmek için her reaktif için A, B ve 50 C sıralamadaki boyama reaktiflerini ( malzeme tablosunabakın) ekleyin. Eğer çökelti varsa, filtrasyon sonra çözüm kullanın.</li>
	<li>Doku bölümüne DAB çalışma solüsyonu bir damla ekleyin ve 3-10 dk için leke. kahverengi boyama tespit edilinceye kadar slaytları oda sıcaklığında DAB 'de Inküte et. Bir aydınlık alan mikroskop kullanarak dikkatle izleyin. DAB çalışma çözümünü ışıktan uzak tutun. Sonra, 5 dakika boyunca PBS ile slayt yıkayın.</li>
	<li>Yaklaşık 1 dakika boyunca çekirdekleri karşı koymak için bir damla hematoksilen ekleyin. Sonra, danışman kavanozu tutun ve yaklaşık 30-40 s için su bir damlasını altında yıkayın fazla boya kaldırılıncaya kadar. Doku bölümlerine zarar vermemek için dikkatli olun.</li>
	<li>25-30 s için PBS içeren bir danışman kavanozu içinde RSB slaytları batırın. Sonra, ayırt 1% hidroklorik asit-etanol 10 s. 1 dakika boyunca PBS ile slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Hidrasyon ters sırada slaytlar susuz: 75%, 80%, 95%, ve mutlak etanol (5 dk her).</li>
	<li>Slaytları ksillene (2 değişiklik, 5 dk.) maruz bırakmayın.</li>
	<li>UltraClean montaj kullanarak lamel magazini monte edin. Mikroskop kullanarak görselleştirmeden önce slaytların kurumasına izin verin.</li>
</ol>

<ol><li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung%27s+disease%3A+A+bridge+for+science+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung%27s+disease%3A+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li>
<li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+hematoxylin+and+eosin+staining+in+patients+with+suspected+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Surgery%22%5BJournal%5D)">The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease.</a> BMC Surgery. 17 (1), 71(2017).</li>
<li>Agrawal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+histochemistry+%28AChE%29+-+A+helpful+technique+in+the+diagnosis+and+in+aiding+the+operative+procedures+of+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease.</a> Diagnostic Pathology. 10 (1), 208(2015).</li>
<li>Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry+in+Hirschsprung%27s+disease%3A+An+adjunct+to+formalin-based+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Turkish+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis.</a> The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).</li>
<li>Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+procedures+update+on+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Laboratory procedures update on Hirschsprung disease.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598(2015).</li>
<li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li>
<li>Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+calretinin+expression+indicates+aganglionosis+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease.</a> Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).</li>
<li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Stop+Looking%3F+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry%3A+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li>
<li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li>
<li>Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis%3A+a+%26%2334%3Bpositive%26%2334%3B+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &#34;positive&#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).</li>
<li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada HD tanısı için RBS bölümlerini lekelemek için üç farklı immunhistokimyasal antikorları kullanarak bir prosedür açıklanmıştır. Tanı protokollerimizin duyarlılığı% 96,49 (% 95 CI, 0.88-0,99) ve özgüllük% 100 (% 95 0.97-1.00) oldu.
Protokolün en önemli adımları RSB ve antijen-antikorların reaksiyonu. Biyopsinin büyüklüğü, lekeme doğruluğunu belirler. Küçük bir biyopsi hassas bir tanı yapmak için yeterli doku sağlamaz, büyük bir biyopsi ise daha yüksek kanama riskine neden olur. Tecrübe mes...

Hirschsprung hastalığı (HD) distal bağırsak yolunun farklı segmentlerinde ganglion hücrelerinin eksikliği ile karakterize ortak konjenital bağırsak bağırsak bozukluğu1. Embriyonik nöral hücrelerin istilası tamamlandığında insan enterik sinir sistemi oluşur. Eğer sürecin bir bozukluğu varsa ve istilanın tamamlanması başarısız olursa, yenidoğan distal bağırsak aganglionik2olur. Bu potansiyel ölümcül durum Hirschsprung hastalığı denir. Proliferasyon, motilite ve bağırsak büyümesi başarılı kolonizasyon üç ana bileşenleridir.
Sınırlı submukozal biyopsinin geleneksel hematoksisi ve Eozinin (H & E) boya tedavisi, ameliyattan elde edilen tam kalınlıkta bir dokunun H & E boyama sonucu tatmin edici olarak elde edilemez. Ayrıca, rektal emiş dokusunun asetilkolinesteraz (AChE) lekesi,% 91 olan yetersiz duyarlılığı ve Frozen bölümler3,4' ün karmaşık işlenmesi nedeniyle teorik olarak zordur. Ganglion hücrelerinin ve formalin-sabit ve parafin-gömülü örneklerinde lekelenebilir sinir liflerinin birçok diğer immunhistokimyasal belirteçleri kademeli olarak mainstream HD tanılama haline gelmektedir. Calretinin, HD etkilenen segmentlerin myenterik ve submukozal pleksusunda ifade edilmez olan D vitamini bağımlı kalsiyum bağlayıcı bir proteindir5. , Sinir lifleri ve glial hücreler, genellikle HD etkilenen segmentler6submukozal dokuda nöro hipertrofisi mevcut gibi neural arması türetilen hücrelerde S100 protein ifade edilir. Protein gen ürün 9,5 (PGP 9.5) güvenilir lekeler sinir lifleri ve ganglion hücreleri; PGP 9.5 boyama, özellikle izole hypoganglionosis vakalarında, kalretinin lekeleme ek olarak davranır. S100 ve PGP 9.5 ile çift boyama yanlış negatif hızını azaltabilir ve hassasiyeti artırabilir. Bir önkoşul olarak, mevcut çalışma bu roman tanı yönteminin yeterli özgüllüğü ve yüksek hassasiyetini sağlamayı amaçlamaktadır. Bizim yeni protokol aganglionik bağırsak ve hipertrofik sinir lifleri ayrımcılık için her üç işaretçileri kullandı. 318 çocuk prospektif bir çalışma laboratuvarımız tarafından yapıldı ve daha önce ayrıntılı bir protokol7olmadan yayınlandı. Bu makalede ayrıntılı protokol ve önlemler ele alınmaktadır. Doğumdan bu yana şiddetli bir defekasyon probleminden ya da diğer ortak hastalıklar haricinde kronik kabızlık olan çocuklardan gelen herhangi bir yenidoğan, rektal emiş biyopsisi (RSB) için potansiyel adaylardır. Bizim yeni protokol sadece RSBs değil, aynı zamanda tam kalınlık biopsleri veya cerrahi numuneler son tanı yapmak için boyama için uygundur.

<table><tbody><tr><td>kalretinin antikoru</td><td>MXB Biyoteknoloji</td><td>MAB-0716 170416405c</td><td>Antikor: birincil antikor</td></tr><tr><td>S-100 antikoru</td><td>MXB Biyoteknoloji</td><td>Kiti-0007</td><td>antikor: birincil antikor</td></tr><tr><td>PGP9.5 antikoru</td><td>Şangay uzun ada antikoru Co. Ltd</td><td>R-0457-03</td><td>antikor: birincil antikor</td></tr><tr><td>arttırıcı reaktif</td><td>MXB Biyoteknoloji</td><td>KIT-9902-A 170416405a</td><td>antikor: ikincil antikor A</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan / Fare IgG İkincil Antikor</td><td>MXB Biyoteknoloji</td><td>KIT-9902-B</td><td>antikor: ikincil antikor B</td></tr><tr><td>DAB boyama kiti (A, B ve C reaktifi içeren)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>DAB-0031</td><td>boyama kiti</td></tr><tr><td>Isı inkübatörü</td><td>Şangay yiheng enstrüman Co, Ltd</td><td>DHP-9082</td><td>aleti</td></tr><tr><td>Rbi2 emme rektal biyopsisi sistem</td><td>Aus Systems Pty Ltd, Güney Avustralya, Avustralya</td><td>CP1200 HP1000 SS1000</td><td>enstrüman</td></tr><tr><td>mikrotomu</td><td>Leica</td><td>leica RM2016</td><td>enstrüman</td></tr><tr><td>sitrik asit sodyum sitrat tamponu (100X)</td> <td>MXB Biyoteknoloji</td><td>MVS-0101</td><td>antijen alma tamponu</td></tr><tr><td>patolojik doku kurutucu</td><td>wuhan junjie electronic Co. Ltd</td><td>JT-12F</td><td>enstrüman</td></tr></tbody></table>

calretinin için immünostasyon rektal emiş biyopsisi ile hirschsprung hastalığının tanısı, s100 protein ve protein gen ürün 9,5

Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

Hirschsprung hastalığı (HD) klinik olarak bebeklerde mekonyum veya çocuklarda uzun süreli kabızlık geçmek için bir yetersizlik olarak ortaya çıkan konjenital bir bağırsak hastalığıdır. Rektal emiş biyopsisi (RSB) ganglion hücrelerinin yokluğunda belirlemek için ve nöral hipertrofisi Şu anda HD tanısı için en doğru testtir. Geleneksel hematoksislin-eozin boyama hassasiyeti ve özgüllüğü yoktur. Asetilkolinesteraz boyama karmaşık süreci nedeniyle yaygın olarak kullanılamaz. RSBs üzerinde yaptığımız calretinin, S100 proteini ve protein geni ürün 9,5 (PGP 9.5) için immünostasyonu olan yeni protokolümüz,% 96,49 (% 95 güven aralığı, 0.88-0,99) ve% 100 (% 95 güven aralığında) yüksek hassasiyet ve özgüllük oranları sergiler interval, 0.97-1.00), sırasıyla. HD etkilenen segmentler genellikle kalretinin ifadesi yokluğunda mevcut, S100 protein, ve PGP 9.5, submukozal dokuda nöral Hipertrofinin belirteçleri olan. Bu protokol, bu yeni tanılama yönteminin ayrıntılı işletim sürecini açıklar.

Toplam 318 hasta çalışmaya alındı. Tüm hastalarda RSB yapıldı ve dokularda calretinin, S100 ve PGP 9.5 için lekelenmiş. Yeni protokolüne dayalı tanı 97 durumlarda HD, 213 vakalarda HD olmayan ve 8 olguda HD şüphesi vardı. 132 cerrahi hastalar arasında, 99 hastada ameliyattan sonra tam kalınlıkta numunelerin immünostürlenerek HD tanısı konuldu. S100 ve PGP 9.5 boyama, 99 hastaların% 92 ve% 93 ' in sırasıyla hipertrofik sinir gövdeleri olduğunu gösterdi. 186 hastaların diğer 83 tam kalınlık...

Bu protokol, calretinin, S100 proteini ve protein geni ürün 9,5 için immünostasyon rektal emiş biyopsisi sürecini açıklar. Hirschsprung hastalığı için bu roman adjuvan tanı yöntemi tercih duyarlılık ve özgüllük oranları vardır.

Calretinin için Immünostasyon rektal emiş biyopsisi ile Hirschsprung hastalığının tanısı, S100 protein ve protein gen ürün 9,5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

Bu yöntem Hirschsprung hastalığının tanısında soruları n yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin yöntemi ve işlevleri, protokolü izlerseniz, yüksek hassasiyet ve aynı anda işleyen özgüllük oranları sergiler. Prosedürü gösteren Mijing Fang, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.Rektal emme biyopsilerini oda sıcaklığında altı saat boyunca %4 paraformaldehitte dokunun hacminin beş katı olarak sabitleyerek başlayın. Patolojik doku dehidratöründeki sabit dokuları 11 saat boyunca kurutun ve işlenmiş rektal emme biyopsi dokularını parafin bloklarına gömün. Doku tam bir kesit düzlemi maruz kalana kadar bir mikrotom üzerinde blokları kırpın.Daha sonra gömülü dokunun 0,4 mikrometrelik bölümlerini elde etmek için mikrotomu kullanın. Bölümlerin düz bir plana yayılmasını sağlamak için 45 ila 50 derece santigrat su yerleştirin. Düzleştirilmiş bölümleri cam kaydıraklara aktarın ve 60 derecelik bir fırında 3-5 saat pişirin.Deparafinize slaytları iki 15 dakikalık ksilen değişikliklerine yerleştirin ve ardından hidrasyonlarını sıralı beş dakikalık etanol daldırmalarına yerleştirin. Daha sonra ters ozmoz saf su slaytlar durulayın ek bir beş dakika. Antijen alımı için, alma çözeltisi bir Coplin boyama kavanozuna slaytlar yerleştirin ve kaynar su önceden ısıtılmış bir banyo içine kavanoz yerleştirin.20 dakika sonra, kavanozun oda sıcaklığına kadar soğumasını yaklaşık 10 dakika bekleyin ve slaytları PBS ile hafifçe durulayın. Sonra her doku bölümü çevreleyen ve ıslak bir kutu içine slaytlar yerleştirmek için bir hidrofobik marker kullanın. Herhangi bir peroksiti engellemek için, her doku üzerine %3 hidrojen peroksit çözeltisi iki veya üç damla ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derece slaytlar yerleştirin.Kuluçka sonunda, üç beş dakikalık PBS yıkayarak slaytları durulayın ve ardından 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca %5 büyükbaş serum albumini bloke edin. Daha sonra, fazla sığır serum albumin atın ve 4 derece santigrat bir gecede ilgi birincil antikor 50 mikrolitre ile hücreleri etiketleyin. Ertesi sabah, PBS üç üç dakikalık yıkıntı ile slaytlar durulayın ve her slayt polimer arttırıcı 50 mikrolitre ekleyin.37 santigrat derecede 20 dakika sonra, PBS'de slaytları üç kez yıkayın ve her doku bölümüne 50 mikrolitre ikincil antikor B ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika sonra, PBS üç beş dakikalık yıkıntı ile bölümleri durulayın ve her slayt için taze hazırlanmış DAB çalışma çözümü bir damla ekleyin. Işık mikroskopisi ile uygun kahverengi boyama seviyesi tespit edildiğinde, PBS'deki slaytları beş dakika durulayın ve çekirdekleri bir dakika hematoksilin damlasıyla lekeleyin.Yaklaşık 30 ila 40 saniye boyunca bir damla su altında fazla leke çıkarın ve taze PBS 25-30 saniye yıkama. 10 saniye boyunca % 1 hidroklorik asit etanol dokuları ayırt ve bir dakika PBS yıkama takip. Hidrasyon ters sırayla beş dakikalık daldırma ile slaytlar dehydrate ve ksilen iki beş dakikalık değişiklikler slaytlar maruz.Daha sonra ultra temiz montaj kullanarak kapak kayma monte ve hafif bir mikroskop üzerinde görselleştirme önce slaytlar kurumasını bekleyin. 318 rektal kesitbiyopsi hastasının katıldığı bu temsilci çalışmada 99 hastaya ilk olarak rektal kesit biyopsisi tanısı konuldu. Normal doku biyopsilerinde kalretinin ilerlediği birçok ganglion hücresi gözlendi.Ancak, Hirschsprung hastalığı segmentlerinden doku herhangi bir alanda ganglion hücreleri tespit edildi. S-100 ve PGP9.5 immünboyama normal innerve bağırsakta gözlenen bazı küçük sinir dalları sadece granüler boyama ile hastalıklı dokunun submukozasında hiperkupak sinir gövdeleri ortaya. Bu işlemi denerken rektal emme biyopsilerinin boyutu ve kesit kalınlığı gibi detaylara dikkat etmek önemlidir.Parçalandıktan sonra, bu teknik Hirschsprung hastalığının tanısını desteklemek için pediatrik cerrahi alanında araştırmaların önünü açacaktır.

diagnosis-hirschsprung-s-disease-immunostaining-rectal-suction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, fare kolon dokusunun immünohistokimyasal boyanması yoluyla kimyasal kaynaklı kolitin değerlendirmesini göstermektedir. Lekeli bir doku bölümünde, hasarlı dokuda çok sayıda bağışıklığa duyarlı hücrenin varlığı, kolit sırasında bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu temsil eder.

Kolon Dokusu Kesitlerinin İmmünohistokimyasal Analizi ile Kimyasal Kaynaklı Kolitin Değerlendirilmesi

Bu videoda rektal aspirasyon biyopsi kesitlerinde S-100 proteini için immünohistokimyasal boyama gösterilmektedir. Antijen ile alınan bölümler bloke edilir ve primer ile tedavi edilir, ardından Hirschsprung hastalığının bir belirteci olan S-100'e karşı ikincil antikorlar gelir. Hedeflenen hücreleri boyamak için kromojenik substrat eklenir. Numuneler kurutulur ve mikroskop altında görselleştirmeden önce monte edilir.

İnsan Rektal Aspirasyon Biyopsi Kesitlerinde S-100 Proteininin İmmünohistokimyasal Boyanması

Kaynak: Ear, P. H., et. al. İnce Bağırsak Nöroendokrin Tümör Sferoidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ince bağırsak nöroendokrin tümör sferoidlerinin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Sferoidler sabitlenir, geçirgen hale getirilir ve bloke edilir ve daha sonra birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edilir. Floresan mikroskobu altında monte edilmeden ve görüntülenmeden önce leke çekirdeklerine bir boya eklenir.

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Sferoidlerinin İmmünofloresan Kullanılarak Karakterizasyonu

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Enterik sinir sistemi, bağırsağı çoğaltan, göç eden ve kolonize eden nöral krest hücreleri tarafından oluşturulur. Nöral krest hücreleri, nörotransmitter fenotiplerine özgü belirteçlerle nöronlara farklılaşır. Bu protokol, enterik sinir sistemi nörotransmitter ekspresyonunu görselleştirmek için murin embriyonik gastrointestinal sistemin diseksiyonu, sabitlenmesi ve immün boyanması için bir tekniği tanımlar.

Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Farelerin potansiyel DNA zarar verici ajanlara maruz kalmasından sonra somatik kolonik kök hücre mutasyonlarının tekrarlanabilir ölçümü için önemli gelişmeler bildiriyoruz.

Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

Bu protokol, bir sıçan poşit modeli oluşturma yöntemini açıklar. İleal poş modeli, mikrocerrahi teknikler kullanılarak ileal poş-anal anastomoz (IPAA) ameliyatı yapılarak oluşturuldu. Ameliyattan sonra, sıçan 4 gün boyunca% 4 dekstran sülfat sodyum (DSS) ile tedavi edildi.

Dekstran sülfat sodyum kullanılarak proktokolektomi ve ileal poş-anal anastomoz sonrası bir sıçan kroşe modeli

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

Yenidoğan kemirgen omurilik elektrofizyolojik kayıtlar ölçmek için kullanılan ekstraselüler emme elektrot üretimi ve kullanımı bir...

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Burada doğrudan fare kortekste microregional doku hipoksisi görselleştirmek için bir yöntem...

Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

Öğrenin, rektal emiş biyopsilerinde immunostaining protokolü ile Hirschsprung hastalığını kalretinin, S100 ve PGP9.5 belirteçleriyle tanımayı. Bu yüksek duyarlılıklı yöntem, ganglion hücrelerinin varlığını görselleştirerek pediatrik cerrahide güvenilir tanı sağlar.

Calretinin için Immünostasyon rektal emiş biyopsisi ile Hirschsprung hastalığının tanısı, S100 protein ve protein gen ürün 9,5

Daha fazla video keşfet