Name: Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Öğrenin bakterilerde inorganik polifosfatın hızlı ve hassas kantifikasyonu için bu yöntemi. Lactobacillus reuteri kullanarak stres yanıtlarını inceleyin ve maliyet etkin analiz yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje Birmingham bölümü Mikrobiyoloji başlangıç fonlar ve NIH hibe R35GM124590 (MJG) ve NIH hibe R01AI121364 (FW) University of Alabama tarafından desteklenmiştir.

1. arındırıcı Maya Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>E. coli protein overexpression gerilme BL21(DE3)31 plazmid pScPPX26 Elektroporasyon32 veya kimyasal dönüştürme33tarafından dönüşümü.</li>
	<li>Lysogeny suyu (LB) bir 2 L unbaffled şişesi ile pScPPX2 içeren BL21(DE3) bir koloni içinde 100 µg mL-1 ampisilin içeren 1 L aşılamak ve gecede 37 ° C'de, 600 bir absorbans için sallayarak olmadan kuluçkaya nm (bir600) yaklaşık 0.3, spektrofotometre içinde ölçülen.</li>
	<li>(180 rpm) sallayarak kültür başlatmak ve zaman zarfında hücreleri bir A600 itibaren 0.4 - için büyür 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 0,5.</li>
	<li>İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM ve bir ek 100 µg mL-1 ampisilin son bir konsantrasyon ekleyin, sonra 37 ° C 180 rpm'de sallayarak ile 4 h için kuluçkaya. Not: Bu overexpression Protokolü çözünür ScPPX büyük miktarda oluşturur. Ancak, ScPPX overexpression çok bağışlayıcı ve diğer genel protein overexpression protokollerini çeşitli başarıyla ScPPX arındırmak için kullanılmıştır.</li>
	<li>Hücreleri bir 1 L santrifüj biberondan aktarmak ve bunları 5000 x g 4 ° C'de 20 min için centrifuging tarafından hasat Ve hücre Pelet 50 mL konik tüp transfer süpernatant çıkarın. Not: Hücre topakları süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir</li>
	<li>Pelet buz çözme, sonra 50 mm HEPES 9 mL, 0.5 M NaCl ve 5 mM imidazole (pH 8) toplam hacmi yaklaşık 10 mL için resuspend.</li>
	<li>(Son konsantrasyonları) 1 mg mL-1 lizozim, 2 mM MgCl2ve 50 adet mL-1 , RNA ve DNA onur kırıcı bir endonükleaz ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Not: ScPPX nükleik asitler (veri) gösterilmez, bağlar nükleaz tedavi arıtma sırasında bu nedenle esastır.</li>
	<li>Bir sonicator bir microtip ile kullanarak (bkz. Tablo reçetesi) sonication on Ice 5 darbe % 50 güç 2 döngüleri tarafından hücreleri parçalayıcı s 2 dk dinlenme döngüleri arasında ile kapalı, açık ve 5 s. Not: uygun işitme koruma sonication sırasında kullanın. Benzer şekilde overexpression ile durum için çeşitli hücre lizis Yöntemler ScPPX arıtma için kabul edilebilir.</li>
	<li>Lysate, 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk centrifuging tarafından çözünmez enkaz kaldırma Elde edilen süpernatant (yaklaşık 10 mL) 0.8 µm gözenek boyutu selüloz asetat şırınga filtre ile filtre.</li>
	<li>Lysate bir nikel-ücret 5 sütun şelat mL üzerine yük ( Tablo malzemelerigörmek) peristaltik pompa ya da büyük bir şırınga kullanarak.</li>
	<li>Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.</li>
	<li>Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.</li>
	<li>ScPPX ile 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl ve 0,5 M imidazole (pH 8), toplama 15 1 mL kesirler elute. Protein ile Bradford protein tahlil34 içerik için bu elüsyon kesirler test ( Tablo malzemelerigörmek) ve hangi kesirler arıtılmış ScPPX içeren onaylamak için bir SDS-sayfa jel35 çalıştırın (Moleküler ağırlığı 45 kDa =).</li>
	<li>Saf ScPPX içeren kesirleri havuz ve 50 mM HEPES ile yaklaşık 2 mg mL-1 ve 0,5 M NaCl havuza alınan protein konsantrasyonu ayarlayın. Yüksek protein konsantrasyonları sonraki adımda çökelti.</li>
	<li>Saf ScPPX depolama arabellek (20 mM Tris-[pH 7,5], HCl 50 mM KCl, %10 [v/v] gliserol) diyaliz tarafından değişimi. Havuza alınan ScPPX kesirler 12.000-14.000 Da moleküler ağırlık kesme diyaliz membran ( Tablo malzemelerigörmek) boru, mühürlü bir uzunluğu yerleştirin ve depolama arabellek en az 4 h yinelemek için bu adımı ile taze ile sürekli karıştırarak 4 ° C'de 1 L askıya 3 arabellek değişiklikleri toplam depolama arabellek.</li>
	<li>Arıtılmış, diyaliz protein bir santrifüj tüpü ya da tüpler ve 20.000 x g 4 ° C'de herhangi bir çözünmez toplamları kaldırmak için de 20 dk santrifüj aktarın. Dikkatle süpernatant temiz 15 mL konik tüp aktarın.</li>
	<li>Ayarlamak için 1 mg mL-1 depolama arabellek ile arıtılmış ScPPX konsantrasyonu, % 0,1 (w/v) eklemek proteaz-Alerjik Sığır serum albumin (BSA; son konsantrasyonu) ve 6 ay 4 ° C'de mağaza Not: dondurulmuş13olduğunda faaliyete fazla % 90 ScPPX kaybeder.</li>
</ol>2. hasat örnekleri polifosfat çıkarma için
<ol><li>Bakteri polip içeriği belirlemek için vade farkı şartları altında büyür. Bu iletişim kuralı için Lactobacillus reuteri36 37 ° C'de gecede seçeneği enzim İndüksiyon (Mey) orta37 sistein (Mey-C) olmadan sallayarak olmadan büyümek.</li>
	<li>Santrifüjü 50-100 µg hücresel protein toplam 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde tarafından yeterince hücre hasat (bkz. Adım 3 aşağı). E. coliiçin bu bir günlük faz kültür 0.2 - A600 1 mL 0,4. L. reuteriiçin bu bir gecede kültür 1 mL dir. İlgi diğer türler için gerektiği şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Tamamen süpernatant hücre çökeltilerini kaldırın.</li>
	<li>Hücre granül GITC lizis arabellek (4 M guanidin isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) 250 µL içinde resuspend ve kuluçka deposu lysates-80 ° C'de 10 dakika süreyle 95 ° C'de tarafından parçalayıcı Not: yüksek sıcaklıkta genişletilmiş kuluçka polip düşmesine hidroliz38tarafından neden olabilir bu yana lizis zamanla tutarlı olması. Lysates süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir Dikkat: Guanidin isothiocyanate chaotropic tuzudur ve olmalı eldiven ile ele ve tehlikeli atık kurtulduk.</li>
</ol>3. ölçme hücre Lysates Protein içeriği
<ol><li>BSA standartları 0, 0.1, 0,2 ve 0.4 mg mL-1 BSA, GITC lizis arabelleği hazırlayın. Not: GITC Bradford tahlil renk gelişimi etkiler GITC, BSA standartları yapmak önemlidir. BSA standartları-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir</li>
	<li>Aliquot 5 µL çözdürülen, iyi karma hücre lysates ve kuyu temiz 96-şey plaka ayırmak için BSA standartları.</li>
	<li>Her şey için 195 µL Bradford reaktifi34 ekleyin ve 595 absorbans ölçmek nm (bir595) bir plaka okuyucu ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Karşılaştırma için formül y kullanarak BSA standart eğri olarak her iyi protein miktarı hesaplamak = mx + b, nereye i ise595, x BSA µg, standart eğrinin eğimini metredir, ve b standart eğri y kesişimi. Sonuç değeri 0,05 Toplam mg protein her örnek içinde belirlemek için çarpmak.</li>
</ol>4. açılan polifosfat
<ol><li>250 µL % 95 etanol her GITC lysed örnek ve girdap karışımı ekleyin.</li>
	<li>Silis membran spin sütun ve santrifüj 30 için bu karışımı uygulamak 16,100 x g s.</li>
	<li>Akış-üzerinden atmak, sonra 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, % 50 Etanol ve santrifüj 30 750 µL (pH 7.5), 5 mm Tris-HCl ekleyin 16,100 x g s.</li>
	<li>Akış-through ve santrifüj 16,100 x g de 2 min için atmak.</li>
	<li>Sütun bir temiz 1.5 mL microfuge tüpü yerleştirin ve 50 mm Tris-HCl (pH 8) 150 µL ekleyin.</li>
	<li>5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya sonra polip 8.000 x g de 2 min için centrifuging tarafından elute. Not: arzu edilirse, eluates-20 ° C'de en az 1 hafta boyunca saklanır.</li>
</ol>5. polifosfat sindirerek
<ol><li>0, 5, 50 ve 50 mM Tris-HCl (pH 8) 200 µM potasyum fosfat içeren standartlar hazırlamak. Not: Potasyum fosfat standartları süresiz olarak oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.</li>
	<li>Aliquot 100 µL her fosfat standart ve, polip örnekleri temiz 96-şey plaka ayrı kuyu hulâsa.</li>
	<li>(Örnek) içeren bir ana karışım hazırlamak: 5 x ScPPX reaksiyon arabellek (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM amonyum asetat, pH 7.5)1330 µL, H2O 19 µL ve saf ScPPX (1 mg mL-1) 1 µL.</li>
	<li>Ana Mix 50 µL 96-şey plaka her şey için ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Not: arzu edilirse, sindirilmiş polip örnekleri-20 ° C'de süresiz olarak saklanır.</li>
</ol>6. ücretsiz fosfat24 algılama
<ol><li>Antimon Potasyum Tartarat 200 ml su, 4 N H2150 mL kadar ekleme 0.185 g çözülerek algılama çözüm temel hazırlamak41,49 g amonyum heptamolybdate ekleme,. Dağıtılması ve 456 mL nihai bir birime getirmek için ilave edin. Parçacıklar kaldırmak ve saklamak için çözüm korunuyorsunuz ışık 4 ° c ilâ 1 ay için filtre.</li>
	<li>1 M askorbik asit stok çözeltisi hazırlamak. Işık 4 ° c ilâ 1 ay için korumalı depolama.</li>
	<li>Taze bir çalışma stok algılama çözüm her gün algılama çözüm temel 9,12 mL 1 M askorbik asit 0,88 mL ile karıştırılarak hazır olun. Oda sıcaklığında kullanmadan önce gelmek algılama çözüm izin verin.</li>
	<li>Her örnek ve standart 96-şey plaka algılama çözüm 50 µL ekleyin ve renk geliştirme izin vermek yaklaşık 2 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Ölçmek 882 absorbans nm bir plaka okuyucu ile ve her örnek fosfat konsantrasyonu, buna karşılık potasyum fosfat standart eğri hesaplamak. Uyarı: Toksik tuzları ve kuvvetli asit algılama çözüm içerir. Eldiven giymek ve aşırı çözüm zehirli atık tedavi.</li>
</ol>7. hücresel polifosfat içerik hesaplama
<ol><li>Polip kaynaklı fosfat tüm her hücrede aşağıdaki formüle göre lysate nanomoles 6.5. adımda belirlenen fosfat konsantrasyonları dönüştürmek: nmol polip 1.5 x = (µM fosfat / 10) Not: Standart eğri tabanlı yöntemi adım 6 fosfat (içinde µM) konsantrasyonu her 100 µL polip örnek adım 5.2 bölünmemeli belirler. Bu konsantrasyon nmol bir sayıya dönüştürmek için 100 µL 10 tarafından ayrılmıştır bir cilt L, vermek için6 konsantrasyon (µmol L-1) tarafından çarpılan, sonra 1.000 (bir µmol nmol sayısı) ile çarpılır. Bu konsantrasyonu 10 tarafından bölünmesi için azaltır. Adım 4'te hazırlanan toplam özü cilt 150 µL, bu fosfat tüm hulâsa içinde mevcut nmol hesaplamak için 1.5 sonuç değeri çarpmak için gerekli bu yüzden.</li>
	<li>3.4. adımda belirlenen her örnek mg toplam protein nmol polip bölünerek toplam hücresel protein içeriğe hücresel polip normalleştirmek. Polip düzeyleri polip kaynaklı bireysel ücretsiz fosfat konsantrasyon açısından ifade edilir. Not: bazı durumlarda, fosfat standart eğri (adım 6.5) doğrusal aralığı dışında polip kaynaklı bir örnek mevcut fosfat miktarı düşebilir. Polip düzeyleri çok yüksek ise, aşırı polip içeren eluate adım 4,6 seyreltilmiş 1:10 veya 1: 100, gerekirse olabilir ve 5-7 arası adımları açıklandığı gibi yeniden ölçülür.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokol basitleştirir ve tipik bir el tam olarak işlemek için yaklaşık 1,5 saat alarak 24 örnekleri ile çeşitli bakteri, polip düzeylerinin miktar hızlandırır. Bu örnekleri hızlı tarama ve analiz mutant kütüphanelerin izin verir ve kinetik deney polip birikimi zamanla ölçüm kolaylaştırır. Protokol etkili üç farklı kültürlenebilen temsilcileri üzerinde çalışıyor göstermiştir: bakteri, firmicutes ve bunlar, onların esnek için kötü üne sahip olan hücre duvarları49koşullar zor.
<...

İnorganik polifosfat (polip) hayat1,2,3tüm etki alanlarında bulunan doğrusal bir biyopolimer fosfat phosphoanhydride bağlı birimlerin var. Çeşitli bakteri, polip stres tepkisi, hareketliliği, biyofilm oluşumu, hücre döngüsü kontrol, antibiyotik direnci ve virülans4,5,6,7,8 için önemlidir ,9,10,11. Bakteri metabolizmasında polip çalışmaların bu nedenle hastalığa neden ve farklı ortamlarda gelişirler için bakteri yeteneğini temel anlayışlar verim potansiyeline sahip. Birçok durumda, ancak, bu çalışmalarda kısıtlayıcı bir faktör bakteri hücreleri içinde sayısal polip için kullanılabilen yöntemleri vardır.
Şu anda Biyolojik materyallerde polip düzeylerini ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. Bu yöntemler genellikle iki farklı adımları içerir: polip ayıklanması ve polip miktarının mevcut bu özler. Maya Saccharomyces cerevisiae Bru ve meslektaşları12, özleri polip yanı sıra DNA ve RNA fenol kullanarak tarafından geliştirilen geçerli altın standart yöntem ve kloroform, etanol yağış, tedavi ile takip deoksiribonükleaz (DNaz) ve ribonükleaz (RNase) ve sonra kullanarak sayısal ücretsiz fosfat verim S. cerevisiae polip aşağılayıcı enzim exopolyphosphatase (ScPPX)-13 ile elde edilen arıtılmış polip sindirim bir malakit Renkölçer tahlil yeşil tabanlı. Bu yordamı son derece nicel ama emek yoğun, tek bir deneyde işlenebilir ve bakteriyel örnekleri için optimize edilmemiştir örneklerini sayısını sınırlama. Diğerleri polip hücre ve dokuların silis boncuk ("glassmilk") veya silis membran sütunları6,14,15,16,17kullanarak çeşitli ayıklama bildirdin, 18. Bu bakteriler, genellikle öncelikle sentezlemek için düşünülen için daha az endişe olmasına rağmen bu yöntemleri verimli bir şekilde kısa zincir polip (az 60 fosfat adet)12,14,15, ayıklamak değil uzun zincirli polip3. Polip asidik koşulları12altında kararsız olduğundan polip ekstraksiyon kuvvetli asit19,20 kullanarak eski yöntemler artık yaygın olarak kullanılmaktadır.
Ayrıca sayısal polip için bildirilen yöntemler vardır. En ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), genellikle DNA leke için kullanılan bir floresan boya daha yaygındır. DAPI-polip kompleksler farklı floresan uyarma ve emisyon maxima DAPI-DNA komplekslerinde21,22daha var ama diğer hücresel bileşenleri, RNA, nükleotit ve inositol de dahil olmak üzere önemli girişim yapmaktadır özgüllük ve polip ölçümleri bu yöntem kullanılarak yapılan duyarlılığını azaltarak fosfatlar12,15,16,23. Alternatif olarak, polip ve adenozin nükleotittir (ADP) adenozin arıtılmış Escherichia coli kullanarak trifosfat (ATP) dönüştürülebilir polip kinaz (PPK) ve luciferase14,17 kullanarak sayısal sonuç ATP ,18. Bu polip çok az miktarda algılanmasını sağlar, ancak iki enzimatik reaksiyon adımları ve hem biyoluminesans hem de çok saf ADP, pahalı reaktifler olan gerektirir. ScPPX, özellikle digests polip ücretsiz fosfat6,12,13,daha basit yöntemleri ama ScPPX kullanarak tespit24, içine DNA ve RNA12tarafından inhibe DNaz ve RNase tedavi gerektiren polip içeren ayıklar. Ne PPK ne de ScPPX ticari olarak mevcut, ve PPK arıtma oldukça karmaşık25,26.
Polip hücre lysates veya özleri de polyacrylamide jeller üzerinde27,28,29,30, zincir uzunluğu değerlendirilmesi izin vermez, ancak bir yöntem boyama negatif DAPI tarafından görüntülenmeyecektir düşük işlem hacmi ve kötü nicel.
Biz şimdi polip hızlı miktar seviyelerinde farklı bakteri türleri sağlar bir hızlı, ucuz, orta-den geçerek polip tahlil raporu. Bu yöntem, 4 M guanidin isothiocyanate (GITC)14 95 ° C'de bakteri hücreleri hücresel fosfatazlar, birden fazla örnekleri hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma ardından devre dışı bırakabilirsiniz için lysing tarafından başlar. Elde edilen polip içeren özü sonra DNaz ve RNase muamele için ihtiyacını ortadan kaldırarak ScPPX, büyük bir fazlalığı ile sindirilir. Biz basit nikel benzeşme arıtma ScPPX miktarda mg için bir iletişim kuralı içerir. Son olarak, ücretsiz fosfat polip kaynaklı basit, hassas, askorbik asit tabanlı Renkölçer tahlil24 ile sayısal ve toplam hücresel protein için normalleştirilmiş. Bu yöntem polip bakteri hücreleri içinde ölçümü akıcılık ve biz kullanımı gram-negatif bakteriler, gram-pozitif bakteri ve mikobakteriler temsilci türleri ile göstermek.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>akademik ve diğer kar amacı gütmeyen kurumlar tarafından kullanılabilir</td></tr><tr><td>LB suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli büyüme ortamı</td></tr><tr><td>ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>izopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>potasyum hidroksit (KOH)</td><td>HEPES tamponlu çözeltilerin pH'ını ayarlamak için</td> <td>Fisher Scientific</td><td>P250500</td></tr><tr><td>sodyum klorür (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>lizozim</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6070106</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür (MgCl2)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Universal Nuclease</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88700</td><td>Benzonaz (Sigma-Aldrich cat. # E1014) kabul edilebilir bir alternatiftir</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-120</td><td>diğer hücre lizis yöntemleri (örneğin French Press) da etkili olabilir:</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap şelatlama HP sütunu</td>, <td>GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>herhangi bir nikel afinite kromatografi sütunu veya reçine ikame edilebilir</td></tr>, <tr><td>nikel (II) sülfat hekzahidrat</td><td>AC415611000</td><td>HiTrap sütunu</td><td></td></tr><tr><td>0.8 ve mikro; m gözenek boyutu selüloz asetat şırınga filtreleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>Spektrumu&nbsp; Spectra/Por 4 RC Diyaliz Membran Tüpü 12.000 ila 14.000 Dalton MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667B</td><td>MWCO < 30.000 Da olan diğer diyaliz membranları da çalışmalıdır</td></tr><tr><td>hidroklorik asit (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Tris tamponlu çözeltilerin pH'ını ayarlamak için</td></tr><tr><td>potasyum klorür (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS orta karışım</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>E. coli büyüme ortamı</td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>monobazik potasyum fosfat (KH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt>)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>dibazik potasyum fosfat (K<alt>2</alt>HPO<alt>4</alt>)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>kurutulmuş maya özü</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>tripton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-50</td><td></td></tr><tr><td>manganez sülfat monohidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>guanidin izotiyosiyanat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini (proteaz içermez)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>şeffaf düz tabanlı 96 oyuklu plakalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812-100EA</td><td>herhangi bir şeffaf 96 oyuklu plaka çalışacaktır</td></tr><tr><td>Tecan M1000 Sonsuz plaka okuyucu</td><td>Tecan, Inc.</td><td>uygulanamaz,</td><td>595 ve 882 nm'de absorbansı ölçebilen herhangi bir plaka okuyucu etanol çalışacaktır</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>silika membran spin kolonları</td><td>Epoch Life Science</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrofüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>amonyum asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>antimon potasyum tartrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N sülfürik asit (H < alt > 2 < / alt > SO4)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>amonyum heptamolibdat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>askorbik asit</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>AC401471000</td><td></td></tr></tbody></table>

bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

İnorganik polifosfat (polip) yaşamın tüm etki alanları arasındaki bulundu biyolojik bir polimerdir ve virülans ve stres yanıt olarak birçok bakteri için gereklidir. Sayısal polip Biyolojik materyallerde, emek yoğun ya da duyarsız, kullanışlılığı sınırlama birçoğu için yöntemler vardır. Burada bakteri, polip miktar için akıcı bir yöntem birden çok örnekleri, polip polip özgü exopolyphosphatase ScPPX ile sindirim ve tespiti hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma kullanarak mevcut hassas bir askorbik asit tabanlı kolorimetrik yöntemi ile elde edilen ücretsiz fosfat. Bu yordamı basit, ucuz ve güvenilir polip miktar farklı bakteriyel türler sağlar. Biz temsilcisi polip miktar gram-negatif bakteri (Escherichia coli), gram-pozitif laktik asit bakteri (Lactobacillus reuteri) ve Mikobakteriyel türler (Mycobacterium smegmatis) mevcut. Biz de şu anda ticari olarak kullanılabilir durumda değilse nikel benzeşme arıtma ScPPX, mg miktarlarda için basit bir protokol içerir.

Protokolü'nün önemli adımlar Şekil 1' deki Basitleştirilmiş biçimde diyagramını.
Bu iletişim kuralıyla Ayagin Gram-negatif bakteriler, vahşi tipi E. coli kullanımını göstermek için MG165539 LB zengin Orta 37 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile orta log fazı için yetiştirilen, sonra durulanır ve ek bir 2s için inkübe 4 g L-1 glikoz ve 0,1 mM K2</s...

İnorganik polifosfat, gram pozitif, gram-negatif ve Mikobakteriyel türler de dahil olmak üzere çeşitli bakterilerde hızlı miktar için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

İnorganik polifosfat bakteriyel stres yanıtında önemli bir elementtir. Ancak bakterilerde poliP ayıklama ve ölçme için eski yöntemler karmaşık ve emek yoğun. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı bakteri türlerinin çeşitli poliP düzeylerinin hızlı, hassas ve ucuz nicel sağlar.Prosedür arya Pokhrel, benim laboratuvar bir lisans öğrencisi tarafından gösterilecek. Başlamak için, sistin olmadan malik enzim indüksiyon orta lactobacillus reuteri bakterilerbüyümek 37 derece santis sallayarak olmadan bir gecede. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde bu gece kültürünün bir mililitresini toplam 50 ila 100 mikrogram hücresel protein vermeye yetecek kadar hücre toplamak için santrifüj edin.Hücre peletinden süpernatant'ı tamamen çıkarın ve sonra 250 mikrolitre GITC lysis tamponu ekleyin ve girdap ile askıya alın. Hücreleri 10 dakika boyunca 95 derecede kuluçkaya yatırın. Lysate'yi 80 derecede saklayın.İlk olarak, GITC lysis tamponba mililitre başına sıfır, 1, 2 ve 4 miligram içeren BSA standartlarını hazırlamak. Aliquot beş mikrolitre çözülmüş, iyi karışık hücre lisates ve bsa standartlarına beş mikrolitre açık bir 96 kuyu plaka kuyuları ayırmak için. Her kuyuya 195 mikrolitre Bradford reaktifi ekleyin ve bir plaka okuyucuda 595 nanometrede emiciliği ölçün.El yazmasında belirtildiği gibi BSA standart eğrisi ile karşılaştırıldığında her kuyudaki protein miktarını hesaplayın. Her örnekteki toplam protein miktarını belirlemek için, elde edilen değeri 05 ile çarpın. Polifosfat ekstraksiyonuna başlamak için, her GITC lysed numunesine 250 mikrolitre %95 etanol ekleyin ve girdap ları karıştırın.Pipet bu karışımı bir silika membran spin sütuna yerleştirilir 1.5 mililitre santrifüj tüp. Santrifüj 16, 100 g 30 saniye. Akışı atın ve tris-hidroklorür, sodyum klorür, EDTA ve etanol karışımı 750 mikrolitre ekleyin.Santrifüj 16, 100 gs 30 saniye. Akışı atın ve spin sütununa 16, 100 gs'de iki dakika santrifüj edin. Kolontemiz bir 1,5 mililitrelik mikrofuge tüp yerleştirin.50 milimolar pH sekiz tris-hidroklorür 150 mikrolitre ekleyin ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Elute polyP santrifüj tarafından 8, 000 g iki dakika. 50 milimolar pH sekiz tris-hidroklorür sıfır, beş, 50 veya 200 mikromolar potasyum fosfat içeren standartları hazırlayarak başlayın.Aliquot 100 mikrolitre her fosfat standart ve 100 mikrolitre çıkarılan poliP örnekleri net bir 96 kuyu plaka ayrı kuyular halinde. Örnek başına 30 mikrolitre 5X ScPPX reaksiyon tamponu, 19 mikrolitre su ve bir mikrolitre saflaştırılmış ScPPX içeren bir ana karışım hazırlayın.Ve 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yat. Tespit gününde, 9,12 mililitre algılama çözeltisi tabanını 88 mililitre bir azı miliskorbik asitle karıştırarak yeni bir çalışma stoğu hazırlayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. 96 kuyu plakasındaki her numuneye ve standartlara 50 mikrolitre algılama çözeltisi ekleyin.Renk gelişimine izin vermek için, yaklaşık iki dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka. 882 nanometrede emiciliği ölçmek ve potasyum fosfat standart eğrisi ile karşılaştırıldığında her numunenin fosfat konsantrasyonu hesaplamak için bir plaka okuyucu kullanın. Daha sonra fosfat konsantrasyonlarını her hücreli sıvıda poliP kaynaklı fosfatın nanomollerine dönüştürün ve hücresel poliP içeriğini el yazmasında açıklandığı gibi toplam hücresel proteine normalleştirin.Yabani tip E.coli, bir gram-negatif bakteri, LB yetiştirilen hiçbir poliP üretti. Ama MOPS yetiştirilen, toplam protein miligram başına yaklaşık 192 nanomoles poliP üretti. PoliP kigazlarından yoksun bir E.coli delta ppk mutant, her iki ortamda da poliP üretmez.Bir delta ppx mutant, hangi exopolyphosphatase yoksun, yabani tip olarak poliP yaklaşık aynı miktarda üretti. Ve fosfat taşımasında kusurlu olan delta phoB mutantı vahşi tipten çok daha az poliP üretti. Yabani tip L.reuteri, meic ortamda bir gecede yetiştirilen bir gram-pozitif bakteri toplam protein miligram başına yaklaşık 51 nanomolpoliP birikmiş.PoliP kigazından yoksun bir L.reuteri ppk1 null mutant bu miktarın yarısından daha azını içeriyordu. Ppk1 null mutant poliP bu varlığı muhtemelen ikinci bir poliP kiazlık içeren L.reuteri kaynaklanmaktadır. Mycobacterium smegmatis suş SMR beş, Hartmans-de Bont orta etanol yokluğunda toplam protein miligram başına yaklaşık 141 nanomol poliP birikmiş büyüdü.Etanol tedavisi üç kat artışile sonuçlanırken. Bu işlemden sonra, akrilamid jel elektroforez poliP zincir uzunluğu farklılıkları değerlendirmek için yapılabilir. Bu yordamı çalışırken, sık yapılan hatalardan kaçının.Mikrotiter plaka kuyularında kabarcıklar almaktan kaçınmayı unutmayın ve kolondan mikrofuge tüpüne geçerken numunelerinizi uygun tüpe aktarmaya dikkat edin. GITC ve güçlü asitler le çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun koruyucu ekipmanın her zaman giyilmesi gerektiğini unutmayın.

assaying-for-inorganic-polyphosphate-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, ölçmek ve sınıflandırmak P monoesters, P diesters ve inorganik P. olarak toprak fosfor standart bir laboratuvarda tek seferde 96 numune ölçülen olabilir mikroplaka okuyucu kullanır enzimatik hidroliz yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Çevre Örneklerinde Organik P Yüksek Verim Ölçme ve Sınıflandırma

İnositol pyrophosphates kanser, diyabet ve obezitenin insan patolojilerin önemli bir rol oynar; ancak, etki mekanizması tam bir anlaşmazlık meselesidir. Piyasada bulunan inositol pyrophosphates eksikliği detaylı çalışmalar sorunlu vermektedir. Burada inositol pyrophosphates miligram üretmek ve izole etmek için basit bir protokol.

Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması

Kaynak: Pokhrel, A., et al. Bakterilerde İnorganik Polifosfat Deneyi. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, bakteri örneklerinde inorganik polifosfatı (poliP) ölçmek için bir kolorimetrik testi göstermektedir. Prosedür, poliP'nin enzimatik olarak serbest fosfata dönüştürülmesini içerir, bu daha sonra mavi renkli bir kompleks oluşturmak için molibdat ve askorbik asit ile reaksiyona girer. Bu kompleksin absorbansını bilinen fosfat konsantrasyonlarının standart bir eğrisi ile karşılaştırarak, bakteri...

Bakterilerde İnorganik Polifosfat Miktarının Belirlenmesi için Bir Test

Kaynak: Vidilaseris, K., ve diğerleri. Thermotoga maritima Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin taranması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ortofosfat salınımını ölçerek bakteriyel membrana bağlı pirofosfataz (mPPaz) inhibitörlerini taramak için kolorimetrik bir tahlil göstermektedir. Yöntem, potansiyel bir antimikrobiyal ilaç hedefi olan Thermotoga maritima'dan mPPaz'ı inhibe eden bileşiklerin tanımlanmasını sağlar.

Kolorimetrik Bir Test Kullanılarak Bakteriyel Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin Taranması 

Bu kağıt filtre malzemeleri, demir içeren üzerine Fosfonat adsorpsiyon araştırmak için bir prosedür tanıttı biraz çaba ve yüksek güvenilirlik ile özellikle taneli demir hidroksit. Arabelleðe alýnmýþ bir çözümde phosphonate bir rotator kullanarak adsorbent temas getirdim ve bir minyatür fosfor tayini yöntemi ile analiz.

Fosfonat adsorpsiyon taneli ferrik minyatürize fosfor belirleme yöntemini kullanarak hidroksit üzerine belirlemek için en iyi duruma getirilmiş yordamı

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Bu makale, alkalen fosfataz aktivitesi S. aureus biyofilm kültür 96-iyi doku kültürü plaka ölçmek için bir yüksek aktarım yöntemi...

Renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde S. aureus biyofilm

Radyoaktif bakteriyel kültürlerin mikrotiter yemeklerde büyümesi, (p) ppgpp dahil olmak üzere birden çok teknik ve biyolojik çoğalan nükstrütit havuzu zenginliğini sağlayan yüksek verimlilik örneklemesini kolaylaştırır. Fizyolojik stres kaynakları tarafından provoke edilen büyüme geçişleri ve stres kurtarma etkileri izlenebilmektedir.

Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma

Burada membrana bağlı pirofosfataz (Thermotoga maritimadan) inhibitörleri için 96 kuyu plaka biçiminde mobibdenum mavi reaksiyonu dayalı bir tarama yöntemi salıyoruz.

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Memeli hücre ekstraktlarından inositol pirofosfatların mutlak kantitasyonu için kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi için bir prosedür tanımlanmıştır.

İnositol Pirofosfatların Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ile Mutlak Kantitasyonu

Öğrenin bakterilerde inorganik polifosfatın hızlı ve hassas kantifikasyonu için bu yöntemi. Lactobacillus reuteri kullanarak stres yanıtlarını inceleyin ve maliyet etkin analiz yapın.

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Daha fazla video keşfet